Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Andrea Comba; Patrick  J. Dunn; Phillip  E. Kish; Padma Kadiyala; Alon Kahana; Maria  G. Castro; Pedro  R. Lowenstein

doi:10.3791/60939

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Artigo de método

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

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DOI:

10.3791/60939

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12 de abril de 2020

Andrea Comba¹^,²^,⁴ , Patrick J. Dunn¹^,²^,⁴ , Phillip E. Kish¹^,³ , Padma Kadiyala¹^,²^,⁴ , Alon Kahana³ , Maria G. Castro¹^,²^,⁴ , Pedro R. Lowenstein¹^,²^,⁴

¹Dept. of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, ²Dept. of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, ³Dept. of Ophthalmology & Visual Science, University of Michigan Medical School, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical School

Neste artigo

Resumo

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Resumo

Gliomas são tumores cerebrais primários caracterizados por sua invasividade e heterogeneidade. Padrões histológicos específicos como pseudopalisades, proliferação microvascular, transformação mesenquimal e necrose caracterizam a heterogeneidade histológica de gliomas de alto grau. Nosso laboratório demonstrou que a presença de altas densidades de células mesenquimais, denominadas oncostreams, se correlacionam com a malignidade tumoral. Desenvolvemos uma abordagem única para entender os mecanismos que estão por trás do crescimento e da invasão de Glioma. Aqui, descrevemos um protocolo abrangente que utiliza microdissecção de captura a laser (LMD) e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial de mRNA de estruturas multicelulares heterogêneas intratumorais (ou seja, áreas mesenquimais ou áreas de invasão de tumor). Este método mantém boa histologia tecidual e integridade do RNA. Perfusão, congelamento, incorporação, secção e coloração foram otimizadas para preservar a morfologia e obter amostras de microdissecção a laser de alta qualidade. Os resultados indicam que a perfusão de camundongos portadores de glioma usando 30% de sacarose fornece boa morfologia e qualidade de RNA. Além disso, as seções de tumor de coloração com 4% de cresípia violeta e 0,5% de eosina resultam em boa coloração nuclear e celular, preservando a integridade do RNA. O método descrito é sensível e altamente reprodutível e pode ser utilizado para estudar a morfologia tumoral em vários modelos tumorais. Em resumo, descrevemos um método completo para realizar ODL que preserva a morfologia e a qualidade do RNA para sequenciamento para estudar as características moleculares de estruturas multicelulares heterogêneas dentro de tumores sólidos.

Introdução

Gliomas são os tumores primários mais agressivos do sistema nervoso central. São altamente invasivos e heterogêneos¹. A análise dos componentes celulares e moleculares do tumor revelará novos alvos terapêuticos.

Entre os diferentes métodos disponíveis atualmente, a microdissecção de captura a laser (DLM) do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável que permite o isolamento de áreas anatômicas discretas ou populações celulares específicas de tecidos tumorais para estudar seu perfil molecular²^,³. O LMD permite a análise de perfis de ....