O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.
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Artigo de método
Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio de crescimento de neurita e a avaliação da neurotoxicidade são dois estudos importantes que podem ser realizados utilizando o método aqui apresentado. Este protocolo fornece uma análise confiável da morfologia neuronal juntamente com medições quantitativas de modificações no comprimento do neurite e localização de proteína sináptica e abundância após o tratamento com pequenos compostos de moléculas. Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade pode ser realizada para avaliar, distinguir e classificar compostos químicos comerciais com base em seu potencial efeito neurotoxicidade no desenvolvimento.
Embora as linhas celulares sejam hoje amplamente utilizadas em ensaios de triagem composta em neurociência, elas geralmente diferem geneticamente e fenotipicamente de sua origem tecidual. As células primárias, por outro lado, mantêm marcadores e funções importantes observados in vivo. Portanto, devido ao potencial de tradução e relevância fisiológica que essas células poderiam oferecer ensaio de crescimento neurite e avaliação da neurotoxicidade pode beneficiar consideravelmente do uso de células progenitoras neurais humanas (hNPCs) como o modelo primário de células humanas.
O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais, um modelo celular que representa de perto a biologia humana."
Introdução
O crescimento da neurita é um processo fundamental para a formação da rede neuronal e da regeneração nervosa1,2. Após uma lesão, o crescimento de neurite desempenha um papel fundamental na regeneração do sistema nervoso. O crescimento da neurita também é um elemento importante da sinalização extracelular na indução de atividades regenerativas neuronais para melhorar os desfechos para distúrbios neurodegenerativos e lesões neuronais3,,4,,5,6.
Mantendo seu p....
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Protocolo
Declaração ética: Os espécimes fetais foram recebidos do Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento da Universidade de Washington, em Seattle, por meio de um programa de distribuição de tecidos apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH). O Laboratório de Pesquisa de Defeitos de Nascimento obteve o consentimento informado por escrito adequado dos pais e a aquisição de tecidos foi monitorada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Washington. Todo o trabalho foi realizado com aprovação do Escritório de Pesquisa de Sujeitos Humanos da Universidade de Miami8.
1. Isolamento e cultura de células ....
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Resultados
O protocolo apresentado no manuscrito foi utilizado com sucesso em dois artigos publicados recentemente22,23. A Figura 3 demonstra o uso de neurônios derivados de hNPCs na análise do efeito dos inibidores de HDAC como compostos epigenéticos na extensão dos neurites como um marcador para o crescimento de neurite e subsequente capacidade neurogênica de compostos de pequenas moléculas.
Além disso, na
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Discussão
Este protocolo é um dos poucos artigos publicados que descrevem o teste para o comprimento de neurite após o tratamento com compostos de teste. Além disso, descrevemos como usar hNPCs para um ensaio de crescimento de neurito e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando este ensaio de crescimento neurite e avaliação neurotoxicidade em neurônios derivados de hNPCs, o potencial neurogênico de uma categoria de compostos epigenéticos de pequenas moléculas, inibidores de HDAC, na indução do crescimento de neurite é demonstrado
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Divulgações
Todos os autores não indicam potenciais conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pela nimad research grant (940714) concedida à MAF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Corrediças de Câmara de Vidro de 4 poços | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulina III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | ||
| B27 - menos vitamina A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Recipientes de congelamento de células garantindo taxa controlada padronizada -1° Congelamento de células C / minuto em um -80 &# 176; C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Meio de criopreservação contendo 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldeído | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanil-L-glutamina suplemento Soro |
| cabra | Thermo | 50062Z | |
| Heparina | Calbiochem | 375095 | |
| Laminina | Sigma | L2020-1MG | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A92902-25G | |
| L-lisina | Sigma | L5501 | |
| MEM aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Meio de criopreservação sem soro projetado para a criopreservação de células-tronco pluripotentes embrionárias humanas e induzidas |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Médio | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Poliestireno Branco Microplacas | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Ácido Retinóico | Sigma | R2625 | |
| Azida de Sódio | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Reagente de dissociação celular contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas |
| Sinaptofisina | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
Referências
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P.
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Reimpressões e permissões
