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Immunology and Infection

तिलपिया झील वायरस के विशिष्ट और तेजी से पता लगाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) परख

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/61025
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 2,3
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science, King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS), King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

Summary

हम पारंपरिक आरटी-पीसीआर तकनीकों की तुलना में अपेक्षाकृत कम समय में सरल उपकरणों का उपयोग करके तिलपिया मछली में TiLV का पता लगाने के लिए एक आरटी-लैंप परख पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से विकासशील देशों में TiLVD के महामारी प्रसार को नियंत्रित करने में मदद कर सकता है ।

Abstract

तिलपिया झील वायरस रोग (TiLVD), तिलपिया झील वायरस (TiLV) की वजह से तिलपिया में एक उभरती हुई वायरल बीमारी, जलकृषि उद्योग में एक निरंतर चुनौती है जिसके परिणामस्वरूप दुनिया के कई हिस्सों में तिलपिया की सामूहिक रुग्णता और मृत्यु हो गई है । इसलिए प्रारंभिक संक्रमण का पता लगाने और जलकृषि खेती में रोग के प्रसार को रोकने के लिए TiLV संक्रमण के लिए एक प्रभावी, तेजी से और सटीक नैदानिक परख आवश्यक है। इस अध्ययन में, मछली के ऊतकों में तिलपिया झील वायरस का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और व्यावहारिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) विधि प्रस्तुत की गई है। संक्रमित नमूनों के आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप परखों की तुलना में 63 (100%) और 51 (80.95%) नमूने, क्रमशः। इसके अलावा, असंक्रमित नमूनों के विश्लेषण से पता चला है कि सभी ६३ असंक्रमित ऊतकों ने आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप परख दोनों के लिए नकारात्मक परिणाम दिए । तिलपिया में पांच रोगजनकों के साथ क्रॉस-रिएक्टिविटी का मूल्यांकन आरटी-लैंप का उपयोग करके किया गया था, और सभी परीक्षणों ने नकारात्मक परिणाम दिखाए। दोनों जिगर और बलगम संक्रमित मछली से प्राप्त नमूनों आरटी-लैंप विधि का उपयोग कर तुलनीय परिणाम दिखाया, सुझाव है कि बलगम एक गैर घातक परख के रूप में आरटी-दीपक में इस्तेमाल किया जा सकता है मछली की हत्या से बचने के लिए । निष्कर्ष में, परिणामों ने दिखाया कि प्रस्तुत आरटी-लैंप परख 1 घंटे के भीतर तिलपिया ऊतक में TiLV का पता लगाने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। इसलिए TiLV के तेजी से निदान के लिए खेतों पर एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में विधि की सिफारिश की है।

Introduction

तिलपिया झील वायरस रोग (TiLVD) तिलपिया(Oreochromis spp.) में एक वायरल बीमारी है जो कथित तौर पर एशिया1,2,2अफ्रीका और अमेरिका सहित दुनिया के कई क्षेत्रों में तिलपिया मौतों का कारण बनती है । इस बीमारी को पहली बार इसराइल में 2009 में तिलपिया की सामूहिक मृत्यु दर के दौरान पहचाना गया था, जहां Kinneret झील में जंगली तिलपिया की संख्या नाटकीय रूप से 257 से 8 टन प्रतिवर्षघटी। यह बीमारी तिलपिया झील वायरस (TiLV) के कारण होती है, जिसे एक नए जीनस तिलापिनाइनवायरस और एक नई प्रजाति तिलापिया तिलापिनाइनवायरस3के रूप में अनोनोविरिडी परिवार को सौंपा गया है । TiLV के आनुवंशिक लक्षण वर्णन से पता चला है कि वायरस एक उपन्यास छा, नकारात्मक भावना, एकल फंसे आरएनए वायरस है कि 10 खंडों 10 प्रोटीनएन्कोडिंग है 1,,2,,4। सरोथेरोडन, ओरेओक्रोमोसिस,और तिलापाइन और अन्य गर्म पानी की मछली (जैसे, विशालकाय गौरामी(ओस्फ्रेनोमस गोरमी)जीनस में तिलपिया की विभिन्न प्रजातियों को टिल्व2,5के लिए अतिसंवेदनशील दिखाया गया है। वर्तमान में, यह वायरस विश्व स्तर पर फैलता रहता है, संभवतः संक्रमित जीवित मछली6,,7के आंदोलन के माध्यम से, जबकि जमे हुए तिलपिया या उसके उत्पाद के माध्यम से वायरल संचरण का खतरासीमित 8है। TiLV संक्रमण के कारण पर्याप्त मृत्यु दर तिलपिया उद्योग पर काफी हानिकारक आर्थिक प्रभाव पड़ने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, TiLV संक्रमण से जुड़े मिस्र में ग्रीष्मकालीन मृत्यु सिंड्रोम के आर्थिक प्रभाव की गणना 100 मिलियन अमेरिकी डॉलर9की थी । तदनुसार, मछली के खेतों में इस बीमारी के नियंत्रण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक त्वरित और उचित नैदानिक विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है।

अब तक, TiLVD का निदान आणविक परख, वायरल अलगाव, और हिस्टोपैथोलॉजी पर आधारित रहा है। टीआईएलवी डायग्नोसिस10,11के लिए विभिन्न पीसीआर प्रोटोकॉल और प्राइमर विकसित किए गए हैं . उदाहरण के लिए, एक SYBR हरे आधार पर रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) विधि संवेदनशीलता के साथ वायरस की दो प्रतियां/μL के रूप में कुछ के रूप में पता लगाने के लिए विकसित किया गया है और TiLV पता लगाने10के लिए मांय । TiLV का पता लगाने के लिए अन्य पीसीआर तरीकों में TaqMan मात्रात्मक पीसीआर11,आरटी-पीसीआर2,नेस्टेड आरटी-पीसीआर12और अर्ध-नेस्टेड आरटी-पीसीआर13शामिल हैं । हालांकि, इन तरीकों को परिष्कृत प्रयोगशाला उपकरणों और प्रतिक्रियाओं की जटिलता के कारण परिणाम प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत विस्तारित समय की आवश्यकता होती है, जो उन्हें क्षेत्र आवेदन के लिए अनुपयुक्त बनाता है।

लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) परख एक तेजी से, सरल और व्यावहारिक के लिए क्षेत्र आवेदन14,,15है । यह तकनीक एक स्ट्रैंड विस्थापन प्रतिक्रिया के सिद्धांत को नियोजित करती है, जबकि प्रवर्धन प्रतिक्रिया एक परिष्कृत और महंगे थर्मल साइकिलर14,,15के बिना आइसोथर्मल परिस्थितियों में चलती है। नतीजतन, एम्पलीफाइड लैंप उत्पादों या आरटी-लैंप उत्पादों का विश्लेषण सीढ़ी-जैसे बैंड में डीएनए या आरएनए14 के सुरक्षित दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट दाग के साथ एग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके किया जाता है या टर्बिडिटी या सफेद उपजी16,,17,,18की उपस्थिति के लिए नग्न आंखों के साथ अवलोकन होता है। इन कारणों से इस तकनीक का उपयोग विभिन्न मछली रोगजनकों17, 18 ,,,,,19,20,18,21,22,23 ,24,25,26,27का ऑन साइट पता लगाने के लिए किया गया है ।24 इस अध्ययन का उद्देश्य TiLV का पता लगाने के लिए एक तेजी से, संवेदनशील, और सटीक आरटी-लैंप परख स्थापित करना था। आरटी-लैंप परख 30 मिनट के भीतर मछली के नमूनों में TiLV के लिए स्क्रीनिंग प्रदान करता है । इस तकनीक को TiLVD के निदान और निगरानी के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रयोग, जो पशु ऊतक ों के उपयोग को शामिल किया गया था, संस्थागत पशु देखभाल और कासेर्ट विश्वविद्यालय, बैंकॉक, थाईलैंड (प्रोटोकॉल संख्या ACKU61-VET-009) की उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. ऊतक संग्रह

  1. लौंग के तेल (यानी, 3 mL/L) के ओवरडोज का उपयोग करके तिलापिया मछली को यूथानाइज करें। ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट का उपयोग लौंग के तेल के विकल्प के रूप में किया जा सकता है।
  2. बाँझ मेयो कैंची और संदंश का प्रयोग करें पोस्टमॉर्टम तिलपिया और उत्पाद के पेट को खोलने के लिए लगभग 30-50 मिलीग्राम जिगर के ऊतकों, या एक माइक्रोस्कोप कवर ग्लास का उपयोग कर, मछली की त्वचा परत देशभर (पूर्वकाल से पीछे) एक 1.5 mm microcentrifuge ट्यूब में खुरचकर बलगम के 100 μL इकट्ठा।
  3. तुरंत आरएनए निष्कर्षण चरण पर जाएं या एकत्र किए गए नमूने को प्रयोग तक −80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। चूंकि अक्षुण्ण आरएनए डीएनए की तुलना में अधिक संवेदनशील है, इसलिए आरएनए निष्कर्षण के दौरान RNase-मुक्त सामग्री और अभिकर्मकों का उपयोग करें।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. जिगर के ऊतकों से आरएनए निकालने के लिए, तिलपिया ऊतक के 30-50 मिलीग्राम को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें जिसमें ग्वानिडिनियम-एसिड-फिनॉल निष्कर्षण अभिकर्ता(सामग्री की तालिका)का 600-1,000 माइक्रोनल होता है, और हाथ से आयोजित ऊतक समरूपता का उपयोग करके नमूने को पल्वेरित करें। ऊतक के नमूनों में ग्वानिडिनियम-एसिड-फिनॉल निष्कर्षण अभिकर्ता का लगभग 10% की आवश्यकता होती है। बलगम के नमूनों के लिए, ग्वानिडिनियम-एसिड-फिनॉल निष्कर्षण अभिकर्ता (3:1) के केवल 300 माइक्रोन का उपयोग करें।
    सावधानी: ग्वानिडिनियम-एसिड-फिनॉल निष्कर्षण अभिकर्ता विषाक्त है; इसलिए, हैंडलिंग को सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। सुरक्षा उपकरण, जैसे सुरक्षा चश्मा, एक प्रयोगशाला गाउन, और सुरक्षा दस्ताने, पहना जाना चाहिए।
  2. कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर समरूप नमूना अपकेंद्रित, और एक नया बाँझ 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में supernatant हस्तांतरण।
  3. ट्यूब में 95% इथेनॉल की बराबर मात्रा जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. समाधान को एक स्पिन कॉलम(सामग्री की तालिका)में स्थानांतरित करें जो एक संग्रह ट्यूब में रखा गया है और कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्री है। प्रवाह के माध्यम से त्यागें, और स्पिन कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  5. प्रवाह के माध्यम से त्यागने से पहले कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए कॉलम और सेंट्रलाइज 10,000 x पर आरएनए प्री-वॉश रिएजेंट(सामग्री की तालिका)के 400 माइक्रोन जोड़ें। इस कदम को एक और बार दोहराएं।
    नोट: आरएनए प्री-वॉश तैयार करने के लिए, आरएनए प्री-वॉश ध्यान केंद्रित करने के 40 मीटर में 95% इथेनॉल के 10 एमएल जोड़ें।
  6. कमरे के तापमान पर 2 मिन के लिए कॉलम और सेंट्रलाइज 10,000 x ग्राम पर आरएनए वॉश बफर(सामग्री की तालिका)के 700 माइक्रोन जोड़ें। कॉलम को बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: आरएनए वॉश बफर तैयार करने के लिए, आरएनए वॉश बफर ध्यान केंद्रित करने के 12 एमएल में 95% इथेनॉल का 52 एमएल जोड़ें।
  7. स्पिन कॉलम मैट्रिक्स में 100 माइक्रोन के साथ न्यूकैप-मुक्त पानी और कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्री के साथ कैप्चर किए गए आरएनए नमूने को एल्यूट करें।
  8. निकाले गए आरएनए की एकाग्रता को माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापें और एनआरएन को न्यूकलीज-मुक्त पानी का उपयोग करके वांछित एकाग्रता में पतला करें।
    नोट: OD260/OD280 के योग्य अवशोषण मूल्य १.६ से १.९ के लिए पर्वतमाला, आरटी लैंप परख के लिए स्वीकार्य आरएनए शुद्धता का संकेत है ।
  9. तुरंत अगले चरण पर जाएं, या उपयोग तक नमूना −80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

3. प्राइमर डिजाइन

  1. आरटी-लैंप के लिए विशिष्ट प्राइमर डिजाइन करने के लिए प्राइमर एक्सप्लोरर संस्करण 4 का उपयोग करें। वेबसाइट पर जाएं, https://primerexplorer.jp/e/, और प्राइमरएक्सप्लोरर V4 बटन पर क्लिक करें।
  2. फास्टा फॉर्मेट में TiLV के सेगमेंट 3 के सीक्वेंस वाली फाइल का चयन करें और फिर प्राइमर डिजाइन बटन पर क्लिक करें ।
    नोट: जेनबैंक परिग्रहण संख्या KX631923 से FASTA प्रारूप में दृश्यों को पुनः प्राप्त करें, जो तिलपिया झील वायरस TV1 खंड 31का प्रतिनिधित्व करता है ।
  3. प्राइमर डिजाइन करने के लिए, निम्नलिखित बुनियादी मापदंडों को इनपुट करें:
    - 40%-60% की एक जीसी सामग्री
    - 280 आधार जोड़े (बीपी) का एक एम्प्लीसन
    - 5 डिग्री सेल्सियस के अधिकतम अंतर के साथ प्राइमर के बीच एक समान पिघलने का तापमान (टीएम)
    नोट: प्राइमर एक दूसरे के पूरक नहीं होना चाहिए
    1. माध्यमिक संरचनाओं के गठन के लिए प्रवण अनुक्रम क्षेत्रों से बचें।
    2. सबसे बड़े जी के लिए इष्टतम डिजाइन के लिए न्यूनतम − 3.5 के साथ डिमर प्राइमर विश्लेषण का चयन करें, और छोटे लोगों के लिए इष्टतम डिजाइन के लिए अधिकतम −4 के साथ प्राइमर के सिरों का चयन करें।
  4. जेनरेट बटन पर क्लिक करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर इनपुट डेटा प्रसंस्करण खत्म होने के बाद, प्राइमर परिणाम दिखाए जाएंगे(चित्रा 1)।

4. आरटी-लैंप परख

  1. 1x एसडी II रिएक्शन बफर के 2.5 माइक्रोन युक्त आरटी-लैंप मास्टर मिक्स तैयार करें, 6 एमएम एमजीएसओ4का 3 माइक्रोन, 1.4 माइक्रोन ऑफ 1.4 एमएम डीएनटीपी सेट, 0.8 एम बीटाइन का 4 माइक्रोन, 0.052 मीटर कैल्सिन मिश्रण का 1.3 माइक्रोन, 1.6 माइक्रोएम टीएलवी-एफ 3 प्राइमर, 1.6 माइक्रोएम टीएलवी-एफ 3 प्राइमर, 1.6 माइक्रोन का टीएलवी-बी 3 प्राइमर, 0.2 माइक्रोन टिल्व-बीआईपी प्राइमर का 1 माइक्रोन, 0.2 माइक्रोन टिल्व-एफआईपी प्राइमर का 1 माइक्रोन, 0.3 यू बीएसटी डीएनए पॉलीमरेज का 1 माइक्रोन, 0.1 यू एएमवी रिवर्स ट्रांसटेकाज़ का 1 माइक्रोन, और न्यूलीज-फ्री वाटर रिएक्शन का 3.8 माइक्रोन।
    नोट: कुल प्रतिक्रिया मात्रा का कम से कम 10% शामिल अतिरिक्त मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  2. आरटी-लैंप मास्टर मिश्रण के 22 माइक्रोन को बाँझ 1.5 माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में वितरित करें।
  3. प्रतिक्रिया ट्यूब में निकाले गए आरएनए के 3 माइक्रोन जोड़ें, और भंवर द्वारा नमूना मिलाएं। नकारात्मक नियंत्रण के लिए आरएनए सामग्री के बजाय आसुत पानी का उपयोग करें।
  4. प्रतिक्रिया को 60 वर्ष के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, इसके बाद प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए 10 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस हो गए।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, नेत्रहीन नग्न आंखों के साथ रंगीन परिवर्तनों का निरीक्षण करते हैं। एक सकारात्मक परिणाम फ्लोरोसेंट हरे रंग के रूप में दिखाई देगा।

5. अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. 1x टीएई बफर के 40 मीटर में 0.6 ग्राम अगारोज पाउडर को निलंबित करके 1.5% w/v अगारोज जेल तैयार करें। मिश्रण को माइक्रोवेव में 3-5 मिन के लिए गर्म करके पिघलाएं जब तक कि अगारोज पूरी तरह से भंग न हो जाए, और मिश्रण करने के लिए भंवर न हो जाए।
  2. जब तक तापमान 65 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंच जाता तब तक अगारोज को ठंडा होने दें। एक जेल ट्रे पर अगारोज समाधान के 40 mL डालो और जेल मोल्ड करने के लिए एक कंघी जोड़ें।
  3. अगारोज जेल को 20-30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर सेट करने की अनुमति दें जब तक कि यह पूरी तरह से जम न जाए। इसके बाद कंघी निकालकर जेल टैंक में जेल रखें।
  4. जेल टैंक में जेल की सतह को कवर करने के लिए एक रनिंग बफर जोड़ें।
  5. प्रत्येक कुएं में आरटी-लैंप नमूने के 10 माइक्रोन और 6x जेल लोडिंग बफर के 2 माइक्रोन जोड़ें। संदर्भ लेन में 1 केबी डीएनए सीढ़ी के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  6. कैथोड और एनोड से जुड़े ढक्कन में प्लग करें जो बिजली आपूर्ति से जुड़ा हुआ है। बिजली की आपूर्ति चालू करें, इसे लगातार 100 वी पर सेट करें, और 40 00 के लिए चलाएं।
  7. जेल जुदाई को पूरा करने के बाद, जेल ट्रे से जेल निकालें। फिर 7 मिन के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर एथिडियम ब्रोमाइड (ईटीबीआर) का उपयोग करके सूखा जेल दाग ें और इसे 5 मिन के लिए आसुत पानी में रेस्टारीन करें ।
    सावधानी: EtBr विषाक्त है और एक कैंसरजन माना जाता है; इसलिए, इस एजेंट का उपयोग करते समय सावधान रहें।
  8. जेल दस्तावेज़ीकरण प्रणाली का उपयोग करके जेल को यूवी लाइट में बेनकाब करें जहां बैंड दिखाई देते हैं, और जेल की तस्वीर लेते हैं।

6. पूरक डीएनए (cDNA) संश्लेषण

  1. एक सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें 5x आरटी बफर का 2 माइक्रोन, प्राइमर मिक्स का 0.5 माइक्रोन, आरटी एंजाइम का 0.5 माइक्रोन और प्रति प्रतिक्रिया न्यूक्लीज-मुक्त पानी का 2 माइक्रोन शामिल है।
    नोट: पाइपिंग के दौरान संभावित नुकसान के कारण प्रतिक्रिया को 1x शामिल करते हुए अतिरिक्त मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  2. मास्टर मिश्रण के 5 μL को बाँझ 1.5 मिलीस माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में बांटें।
  3. सभी मिश्रण को बर्तन के नीचे ले जाने के लिए प्रतिक्रिया ट्यूब में पतला निकाले गए आरएनए (चरण 2.8 से प्राप्त) के 100 एनजी जोड़ें।
  4. 60 मिन के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, इसके बाद एक पीसीआर मशीन में 5 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस। उपयोग तक सीडीएनए को −20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. आरटी-क्यूपीसीआर

  1. 10 माइक्रोएम रिवर्स प्राइमर के 0.3 माइक्रोन, 10 माइक्रोएम फॉरवर्ड प्राइमर के 0.3 माइक्रोन, 2x एसवाईबीआर ग्रीन डीएनए पॉलीमरेज के 5 माइक्रोन और प्रति प्रतिक्रिया न्यूक्लीज-फ्री वॉटर के 0.4 माइक्रोन युक्त एक TiLV qPCR मास्टर मिक्स तैयार करें। निम्नलिखित प्राइमर और नियंत्रण का उपयोग करें:
    फॉरवर्ड प्राइमर (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAGACAATATATT-3 '
    रिवर्स प्राइमर (TiLV-112R): 5'-CGGCGTACTCGCAGCAGTATAAGCT-3'
  2. इस्तेमाल किए गए वास्तविक समय थर्मल साइकिलर के साथ संगत क्यूपीसीआर स्ट्रिप के प्रत्येक कुएं में TiLV qPCR मास्टर मिश्रण के 6 μL बांटें।
  3. सीडीएनए टेम्पलेट के 4 माइक्रोन जोड़ें, नकारात्मक नियंत्रण (न्यूक्लीज-फ्री वॉटर), पॉजिटिव कंट्रोल (10 पीजी/माइक्रोन), और pTiLV (प्लाज्मिड)10 या क्रमिक रूप से टिल्व प्लाज्मिड को अच्छी तरह से पतला करें, और प्रत्येक नमूने को फ्लिकिंग करके मिलाएं। प्रत्येक नमूने को ट्रिपलेट में संचालित करें।
  4. प्रोग्राम किए गए रियल-टाइम थर्मल साइकिलर में क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं को रखें। क्यूपीसीआर प्रोग्राम 3 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करने के लिए सेट करें, इसके बाद पिघलने वाले वक्र कदम से पहले 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र ों को बढ़ाने की जरूरत है जिसमें तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस से बढ़ाकर 95 डिग्री सेल्सियस पर 05 डिग्री सेल्सियस/5 एस वेतन वृद्धि की जरूरत है।
  5. प्रवर्धन और पिघलने वाले घटता का मूल्यांकन करके डेटा विश्लेषण का संचालन करें, और फिर क्रमिक रूप से पतला प्लाज्मिड का उपयोग करके डेटा से प्राप्त मानक वक्र का उपयोग करके TiLV प्रतियों की संख्या की गणना करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में तिलपिया में टीआईएलवी संक्रमण का पता लगाने के लिए आरटी-लैंप परख विकसित की गई थी। परीक्षण किए गए नमूने २०१५ और २०१६ के बीच थाईलैंड के विभिन्न हिस्सों में स्थित 14 खेतों से एकत्र किए गए थे । संक्रमित और असंक्रमित मछली को मुख्य रूप से शारीरिक निदान और रोगसूचक TiLVD के दिखावे के आधार पर समूहीकृत किया गया था । बाद में संग्रह प्रक्रिया के बाद आरटी-पीसीआर का उपयोग करके TiLV संक्रमण की पुष्टि की गई। अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और ल्यूमिनेसेंट ग्रीन कलर का पता लगाने को लैंप एम्प्लिक्स(चित्रा 2)के मूल्यांकन विधियों के रूप में चुना गया था। संक्रमित और असंक्रमित तिलपिया मछली के जिगर और बलगम को टीएलवी रोग के लक्षणों की नैदानिक उपस्थिति की विशेषता थी, जिसमें त्वचा का क्षरण, त्वचा लाली, एक्सोथैल्मस और पेट में सूजन शामिल थी। पिछली रिपोर्टों में TiLV35की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए आणविक नैदानिक परखों में जिगर के नमूनों के उपयोग का प्रदर्शन किया गया है । वैकल्पिक रूप से, बलगम परख में फायदेमंद हो सकता है क्योंकि यह जानवरों को मारने से बचने में मदद कर सकता है। परिणामों में एक सीढ़ी की तरह डीएनए बैंड पैटर्न और संक्रमित जिगर और संक्रमित मछली के बलगम नमूनों में एक फ्लोरोसेंट हरा रंग दिखाया(चित्रा 2),जबकि कोई डीएनए बैंड और कैल्शियम के पीले रंग के असंक्रमित पशु ऊतकों में आरटी-लैंप मिश्रण में मनाया गया(चित्रा 2)। दिलचस्प बात यह है कि मलेशिया में एक खेत से एकत्र किए गए एक TiLV-संक्रमित तिलपिया नमूने को भी इस आरटी-लैंप परख का उपयोग करके सकारात्मक रूप में निदान किया गया था; हालांकि, स्थानीय थाई खेतों से एकत्र नमूनों की तुलना में पीसीआर उत्पाद के आकार में भिन्नता देखी गई(चित्रा 2)।

आरटी-लैंप परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए, आरटी-लैंप और आरटी-क्यूपीसीआर परख(टेबल 1)दोनों का उपयोग करके कुल 63 टीएलवी-संक्रमित ऊतकों और 63 असंक्रमित ऊतकों का विश्लेषण किया गया था। संक्रमित नमूनों के आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप परखों की तुलना में 63 (100%) और 51 (80.95%) नमूनों की, क्रमशः । इसके अलावा, असंक्रमित नमूनों के विश्लेषण से पता चला है कि सभी ६३ असंक्रमित ऊतकों ने आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप परख(टेबल 1)दोनों का उपयोग करके नकारात्मक परिणाम दिए । इस विश्लेषण ने प्राथमिक TiLV का पता लगाने के लिए आरटी-लैंप परख की विश्वसनीयता का प्रदर्शन किया। आरटी-लैंप परख की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, अन्य रोगजनक बैक्टीरिया और वायरस से संक्रमित मछली से ऊतक, जिसमें स्ट्रेप्टोकोकस अगालैक्स, फ्रांसिस्को नोट्यूंनसिस, फ्लेवोबैक्टीरियम कॉलमरे, एयरोमोनास हाइड्रोफिलाऔर इरिडोवायरस का उपयोग आरटी-लैंप और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषणों के लिए टेम्पलेट्स के रूप में किया गया था। आरटी-लैंप और आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर दोनों ने किसी भी परीक्षण किए गए नमूनों(तालिका 2)में कोई रंगीन परिवर्तन और कोई फ्लोरोसेंट संकेत नहीं दिए। इसके अतिरिक्त, आरटी-लैंप परख की संवेदनशीलता का आकलन TiLV-संक्रमित मछली से निकाले गए आरएनए टेम्पलेट्स के धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करके किया गया था । तुलनात्मक रूप से, आरटी-क्यूपीसीआर परख आरटी-लैंप परख से अधिक संवेदनशील था क्योंकि आरटी-क्यूपीसीआर परख में10-8 की पहचान सीमा थी जबकि आरटी-लैंप विधि को TiLV जीनोम(तालिका 2)का पता लगाने के लिए 10-7 गुना कमजोर पड़ने की आवश्यकता थी ।-7

Figure 1
चित्रा 1. इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले छह आरटी-लैंप प्राइमर के न्यूक्लियोटाइड दृश्य जो TiLV का पता लगाने के लिए विशिष्ट थे। प्रत्येक प्राइमर की स्थिति TiLV जीनोम (परिग्रहण संख्या KX631923) के खंड 3 पर गठबंधन किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. फ्लोरोसेंट विजुअलाइजेशन द्वारा 1.5% अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और (बी) में टीएलवी-संक्रमित और असंक्रमित नमूनों (ए)से प्राप्त आरटी-लैंप एम्प्लिकेशन का विश्लेषण। M= 1 kb डीएनए सीढ़ी, 1-2 = TILV संक्रमित मछली के यकृत से आरएनए, 3-4 = TiLV संक्रमित मछली के सीडीएनए, 5-6 = TILV संक्रमित मछली के बलगम से आरएनए, 7-8= TiLV-संक्रमित मछली की सेल लाइनें, 9= TILV-संक्रमित मछली (मलेशिया) के यकृत से आरएनए, गैर-TiLV संक्रमित मछली के यकृत से 10 = आरएनए, 11 = गैर-TiLV संक्रमित मछली के यकृत से आरएनए, गैर-TiLV संक्रमित मछली के बलगम से 12 = आरएनए, 13 = कोई टेम्पलेट नियंत्रण यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया

नमूनों के प्रकार नमूनों की संख्या डिटेक्शन वैधता (%)
आरटी-क्यूपीसीआर आरटी-लैंप
संक्रमित नमूने 63 100.00 (63/63) 80.95 (51/63)
असंक्रमित नमूने 63 0 (0/63) 0 (0/63)

तालिका 1. आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-लैंप का उपयोग करसंक्रमित और असंक्रमित मछली के नमूनों में TiLV का पता लगाने के लिए आरटी-लैंप का सत्यापन

विशिष्टता एसए. F.n. F.C. ए.एच. I.v.
क्यूपीसीआर दीपक क्यूपीसीआर दीपक क्यूपीसीआर दीपक क्यूपीसीआर दीपक क्यूपीसीआर दीपक
– – – – – – – – – –
संवेदनशीलता विधि/ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
कमजोर पड़ना
क्यूपीसीआर + + + + + + + + –
दीपक + + + + + + + – –

तालिका 2। आरटी-क्यूपीसीआर की तुलना में आरटी-लैंप परख की विशिष्टता और संवेदनशीलता। विशिष्टता मूल्यांकन के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस अगालैटिए (एसए), फ्रांसिस्को नोट्यूनेन्सिस (एफए), फ्रांसिस्को नोट्यूनेन्सिस (एफए), फ्लेवोबैक्टीरियम कॉलमरे (F.c.), एयरोमोनास हाइड्रोफिला (A.h.), और Iridovirus (I.v.), आरटी-qPCR और RT-LAMP के लिए टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संवेदनशीलता मूल्यांकन के लिए, TILV-संक्रमित मछली से प्राप्त आरएनए 10 गुना क्रमिक रूप से १०० एनजी से 1 fg को पतला किया गया था और आरटी-qPCR और आरटी-लैंप के लिए टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया । + और - संकेत क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम मतलब है।

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Discussion

जलकृषि उद्योग को लगातार वायरल संक्रमण ों से खतरा है जिससे9,23,,28को काफी आर्थिक नुकसान होता है . उदाहरण के लिए, उभरते TiLV दुनिया के कई भागों में तिलपिया उत्पादक देशों के लिए एक बड़ा खतरा बन गया है1,,6,,9। अब तक, TiLVD को रोकने के लिए कोई विशिष्ट चिकित्सीय उपलब्ध नहीं है । जबकि एक टीके के विकास चल रहा है, एक कुशल टीका पर्याप्त समय की आवश्यकता से पहले यह वाणिज्यिक प्रयोजनों के लिए उपलब्ध है होगा । इन परिस्थितियों को देखते हुए, सख्त जैव सुरक्षा माप, जैसे कीटाणुनाशक ों के आवेदन, TiLVD29,,30के प्रसार को रोकने के लिए मछली के खेतों में आवश्यक हैं । वर्तमान में, TiLV संचरण को कम करने के लिए सबसे कुशल नियंत्रण उपायों में से एक TiLV31की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए किशोर मछली और वयस्कों की स्क्रीनिंग है । स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए, नैदानिक उपकरण को तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट होने की आवश्यकता है ताकि यह संक्रमित आबादी को दूर करने और बीमारी के आगे फैलने से रोकने में सहायता कर सके। हालांकि, TiLV के लिए वर्तमान आणविक परख साइट पर लागू करने के लिए मुश्किल है । पहली बार में, उन्हें कुशल शोधकर्ताओं और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। दूसरा, प्रयोगशाला परिणाम प्राप्त करने में कई दिन लग सकते हैं, जिससे रोग को तुरंत15,,16को नियंत्रित करना और रोकना मुश्किल हो जाता है ।

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, Notomi एट अल.14 ने 2000 में लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) नामक एक उपन्यास न्यूक्लिक एसिड आधारित प्रवर्धन परख की स्थापना की। इसके बाद से विभिन्न मछली वायरस16,17,18,19,,, 20 ,,,,,,21,22,23,24, 25,2026,32,33,34का पता लगाने के लिए दीपक की प्रतिक्रिया को सफलतापूर्वक लागू किया गया है .26 इस अध्ययन में, हमने तिलपिया मछली के नमूनों में TiLV का पता लगाने के लिए एक आरटी-लैंप प्रोटोकॉल विकसित किया। हालांकि आरटी-लैंप विधि की संवेदनशीलता आरटी-क्यूपीसीआर की तुलना में 10 गुना कम कुशल है, लेकिन आरटी-लैंप परख 100 एफजी के रूप में कम के रूप में एक TiLV आरएनए जीनोम की उपस्थिति का पता लगा सकता है, जो चिकित्सकीय रोगग्रस्त मछली34में TiLV का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। विशेष रूप से, आरटी-लैंप परख 60 मिनट के भीतर एक परिणाम पैदावार और केवल एक साधारण पानी स्नान या गर्मी ब्लॉक उपकरणों34की आवश्यकता है, जबकि आरटी-qPCR परख अधिक समय लगता है और विश्लेषण के लिए और अधिक महंगी वास्तविक समय पीसीआर उपकरण की आवश्यकता है15,,34. इसके अलावा, आरटी-लैंप के अंतिम उत्पाद को हल्के पीले रंग से फ्लोरोसेंट हरे रंग तक फ्लोरोसेंट रंग के रंग में परिवर्तन के माध्यम से देखा गया था, जिससे यह परिष्कृतउपकरण34के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना नग्न आंखों को दिखाई देता है। ये फायदे आरटी-लैंप को फील्ड डायग्नोसिस के लिए उपयुक्त बनाते हैं। इसके अलावा, अध्ययन के निष्कर्षों का सुझाव दिया है कि दोनों जिगर और बलगम टी-लैंप का उपयोग कर TiLV का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले अध्ययनों के समान, बलगम का उपयोग करके एक गैर घातक नमूना ने मछली या मूल्यवान ब्रूडस्टॉक35को मारे बिना TiLV के निदान की अनुमति दी। हाल ही में, छह प्राइमर३६के एक सेट का उपयोग करके खंड 1 (S1 क्षेत्र) में TiLV न्यूक्लियोटाइड दृश्यों के चीनी और थाई अलग-थलग ों का पता लगाने के लिए एक आरटी-लैंप परख विकसित की गई थी। वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि विकसित आरटी-लैंप परख ने उसी प्राइमर सेट का उपयोग करते समय आरटी-पीसीआर की तुलना में २७.७८% पर TiLV संक्रमण के झूठे-नकारात्मक संकेत का निदान किया । आगे की तुलना में, आरटी-पीसीआर की तुलना में TiLV के सेगमेंट 3 का पता लगाने पर झूठी-नकारात्मक परिणाम अपेक्षाकृत कम 19.05% पर था। वायरल डिटेक्शन विधि की दक्षता की तुलना अन्य रिपोर्टों के साथ करते समय, हम 80.95% पर TiLV संक्रमण का पता लगाने में सक्षम थे, जबकि अन्य कार्यों ने 72.22%36 और 82.89%37पर वायरस का पता लगाया। कुल मिलाकर, यह परिकल्पना की जा सकती है कि आरटी-लैंप परख के विभिन्न घटक, उदाहरण के लिए, विभिन्न प्राइमर सेट और TiLV जीनोम के विभिन्न लक्षित खंड परख की वैधता को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं।

हालांकि आर टी लैंप परख रोग स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और कई प्रदर्शनीय लाभ है, इस अध्ययन सीमाओं के बिना नहीं था । आरटी-लैंप परख के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक एक उपयुक्त प्राइमर सेट का डिजाइन था जिसमें चार से छह प्राइमर शामिल थे। पीसीआर उत्पादों के स्टेम-लूप संरचनाओं के गठन को बढ़ावा देने के लिए, लक्षित जीन या न्यूक्लियोटाइड दृश्यों की उचित लंबाई लगभग 500 बीपी से अधिक होने की आवश्यकता थी, जबकि आरटी-पीसीआर परख के लक्षित जीन को 50-150 बीपी14,,38,,39की सीमा में अपेक्षाकृत कम होना था।

निष्कर्ष में, विकसित आरटी-लैंप परख तेजी से, लागत प्रभावी, संवेदनशील, और TiLV का पता लगाने के लिए विशिष्ट है । विश्लेषण आरटी-क्यूपीसीआर परख के लिए 4-5 घंटे की तुलना में 1 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है। विशेष रूप से, आरटी-लैंप परख क्षेत्र की स्थितियों के लिए व्यावहारिक है क्योंकि परिष्कृत उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता के बिना नग्न आंखों के साथ सकारात्मक परिणाम देखे जा सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

परियोजना को थाईलैंड अनुसंधान कोष (टीआरएफ) अनुदान संख्या RDG6050078 और कृषि और खाद्य के लिए उन्नत अध्ययन के लिए केंद्र, उन्नत अध्ययन संस्थान, Kasetsart विश्वविद्यालय, बैंकॉक, थाईलैंड के उच्च शिक्षा अनुसंधान संवर्धन और थाईलैंड के राष्ट्रीय अनुसंधान विश्वविद्यालय परियोजना, उच्च शिक्षा आयोग के कार्यालय, शिक्षा मंत्रालय, थाईलैंड द्वारा वित्त पोषित है । अनुसंधान स्नातक स्कूल, Kasetsart विश्वविद्यालय से स्नातक कार्यक्रम छात्रवृत्ति द्वारा भाग में समर्थित है । लेखक वीडियो और पियावातारा सिकिइन की कथा बोलने के लिए डॉ क्वांवी सिरिककंचना को वीडियो के संपादन के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601

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References

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तिलपिया झील वायरस के विशिष्ट और तेजी से पता लगाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) परख
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Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).

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