Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En platform for hydrogendeuteriumudvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) til undersøgelse af peptidbiosyntetiske enzymer

Published: May 4, 2020 doi: 10.3791/61053
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, McGill University

Summary

Lanthipeptide synthetases katalyserer multistep reaktioner under biosyntesen af peptid naturlige produkter. Her beskriver vi en kontinuerlig, bottom-up, hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDX-MS) workflow, der kan anvendes til at studere kropsbygning dynamik lanthipeptid synthetaser, samt andre lignende enzymer involveret i peptid naturlige produkt biosyntese.

Abstract

Hydrogen-deuterium exchange mass spektrometri (HDX-MS) er en kraftfuld metode til biofysisk karakterisering af enzymkonformationelle ændringer og enzym-substratinteraktioner. Blandt de mange fordele bruger HDX-MS kun små mængder materiale, kan udføres under næsten indfødte forhold uden behov for enzym/ substratmærkning og kan give rumligt løst information om enzymkonformationsdynamik – selv for store enzymer og multiproteinkomplekser. Metoden indledes ved fortynding af etzymet af interesse i buffer tilberedt i D2O. Dette udløser udveksling af protium i peptidbinding midt (N-H) med deuterium (N-D). På de ønskede udvekslingstidspunkter slukkes reaktions-aliquots, enzymet proteolyzed i peptider, peptider adskilles af ultra-performance væskekromatografi (UPLC), og ændringen i massen af hver peptid (på grund af udveksling af brint til deuterium) registreres af MS. Mængden af deuterium optagelse af hver peptid er stærkt afhængig af den lokale brint limning miljø af denne peptid. Peptider, der er til stede i meget dynamiske områder af enzymet, udveksler deuterium meget hurtigt, mens peptider fra velordnede regioner udveksles meget langsommere. På denne måde rapporterer HDX-hastigheden om lokal enzymformationsdynamik. Perturbationer til deuteriumoptagelsesniveauer i nærværelse af forskellige ligands kan derefter bruges til at kortlægge ligandbindingssteder, identificere allosteriske netværk og til at forstå konformationsdynamikkens rolle i enzymfunktion. Her illustrerer vi, hvordan vi har brugt HDX-MS til bedre at forstå biosyntesen af en type peptid naturlige produkter kaldet lanthipeptider. Lanthipeptider er genetisk kodede peptider, der er postoversættelsesmæssigt modificeret af store, multifunktionelle, kropsbygningsdynamiske enzymer, der er vanskelige at studere med traditionelle strukturelle biologi tilgange. HDX-MS er en ideel og fleksibel platform til undersøgelse af disse typer enzymers mekanistiske egenskaber.

Introduction

Proteiner er strukturelt dynamiske molekyler, der prøver forskellige konformationer på tidsskalaer, der spænder fra femtosekundsbindingsvibrationer til omlægninger af hele proteindomæner, som kan forekomme over mange sekunder1. Disse konformationelle udsving er ofte kritiske aspekter af enzym/ proteinfunktion. For eksempel er kropsbygningsændringer forårsaget af ligandbinding ofte af afgørende betydning for modulerende enzymfunktion, enten ved at organisere aktive stedrester, der er nødvendige for katalyse, definere substratbindingssteder i sekventielle kinetiske mekanismer, beskytte reaktive mellemprodukter fra miljøet eller ved at modulere enzymfunktion via allosteriske netværk. Nylige undersøgelser har også vist , at kropsbygningsdynamik kan bevares gennem hele evolutionen , og at turbationer til bevarede molekylære bevægelser kan korreleres med ændringer i substratspecifikitet og fremkomsten af nye enzymfunktioner2,3.

I de senere år har hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDX-MS) hurtigt vist sig som en kraftfuld teknik til at sonde, hvordan protein konformationelle landskaber reagerer på perturbationer såsom ligand binding eller mutagenesis4,5,6,7. I et typisk HDX-MS-eksperiment (Figur 1) anbringes et protein af interesse i buffer tilberedt i D2O, hvilket udløser udskiftning af opløsningsmiddelbyttelige protoner med deuteria. Valutakursen for peptidbindingernes midte er stærkt afhængig af pH, den lokale aminosyresekvens og af amideens lokale strukturelle miljø8. Amider, der beskæftiger sig med hydrogenbindingsinteraktioner (som dem, der er til stede i α-helices og β-sheets), udveksler langsommere end midt i ustrukturerede områder af proteinet, der udsættes for bulkopløsningsmiddel. Således er omfanget af deuteriumoptagelse en afspejling af enzymets struktur. Enzymer, der er kropsbygningsdynamiske, eller som gennemgår strukturelle overgange ved ligandbinding, forventes at give et målbart HDX-respons.

Det mekanistiske grundlag for den langsomme valutakurs for en struktureret midte fremgår af figur 25,8,9. For at kunne gennemgå HDX skal den strukturerede region først forbigående prøve en udfoldet kropsbygning, således at de opløsningsmiddelmolekyler, der katalyserer HDX-udveksling via en bestemt syre/base kemisk mekanisme, har adgang til det udskiftelige midt. I sidste ende bestemmer de relative størrelser af den kemiske valutakurs (kchem) og folde- og refoldingskurserne (kåben og ktæt) HDX-kursen målt i eksperimentet5,8. Fra denne enkle kinetiske model er det klart, at omfanget af deuteriumoptagelse vil afspejle den underliggende kropsbygningsdynamik (som defineret af kopen og kclose). De fleste HDX-MS-eksperimenter udføres i en bottom-up-arbejdsgang, hvor interesseproteinet efter udvekslingsreaktionen fordøjes til peptider, og deuteriumoptagelsen af hver peptid måles som en stigning i masse7. På denne måde tillader HDX-MS, at der kortlægges forstyrrelser af enzymens kropsbygningsdynamik på den lokale rumlige skala af peptider, hvilket gør det muligt for forskeren at vurdere, hvordan forstyrrelsen ændrer dynamikken i forskellige områder af interesseens enzym.

Fordelene ved HDX-MS-tilgangen til belysning af proteinstrukturel dynamik er talrige. For det første kan metoden udføres med små mængder indfødt protein eller på proteinkomplekser i systemer med kvartær struktur10. Det er ikke engang nødvendigt, at det enzympræparat, der anvendes ianalysen,skal være stærkt renset11,12, så længe bottom-up HDX-MS-arbejdsgangen giver et tilstrækkeligt antal selvsikkert identificerede peptider, der dækker proteinsekvensen af interesse. Desuden kan HDX-MS give oplysninger om kropsbygningsdynamik under næsten indfødte forhold uden behov for stedsspecifik proteinmærkning, som ville blive anvendt i enkeltmolekyle fluorescensundersøgelser13, og der er ingen størrelsesgrænse for protein- eller proteinkomplekset, der kan undersøges (hvilket gør tilgange som nuklear magnetisk resonans [NMR] spektroskopi udfordrende)7,14. Endelig kan tidsløste HDX-MS-metoder anvendes til at studere iboende uordnede proteiner, som er vanskelige at studere med røntgenkrystallografi15,16,17,18. Den vigtigste begrænsning af HDX-MS er, at dataene har lav strukturel opløsning. HDX-MS-data er nyttige til at pege på, hvor kropsbygningsdynamikken ændrer sig, og til at afsløre koblede kropsbygningsændringer, men de giver ikke ofte meget indsigt i den præcise molekylære mekanisme, der driver den observerede ændring. De seneste fremskridt inden for kombinationen af metoder til afkobling af elektronfangst med data fra protein-HDX-MS har vist lovende resultater med hensyn til kortlægning af udvekslingssteder for enkelt aminosyrerester19, men der er stadig ofte behov for opfølgende biokemiske og strukturelle undersøgelser for at skabe klarhed om strukturelle modeller, der fremsendes af DATA FRA HDX-MS.

Nedenfor præsenteres en detaljeret protokol for udvikling af en HDX-MS-analyse20. Nedenstående prøveforberedelsesprotokoller bør generelt gælde for ethvert protein, der udviser god opløselighed i vandige buffere. Der findes mere specialiserede prøveforberedelsesmetoder og HDX-MS-arbejdsgange for proteiner, end det er nødvendigt at analysere i nærværelse af vaskemiddel eller fosfolipider21,22,23,24. Instrumentale indstillinger for INDSAMLING AF HDX-MS-data beskrives for et firdobbelt flyvetidsspektrometer med høj opløsning koblet til flydende kromatografisystem. Der kan indsamles data af samme kompleksitet og opløsning på et hvilket som helst af en række kommercielt tilgængelige systemer til flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Der findes også nøgleaspekter af databehandlingen ved hjælp af en softwarepakke, der er kommercielt tilgængelig. Vi præsenterer også retningslinjer for dataindsamling og -analyse, der er i overensstemmelse med anbefalingerne fra det bredere HDX-MS community12. Den beskrevne protokol bruges til at studere halM2's dynamiske strukturelle egenskaber, en lanthipeptidsynetase, der katalyserer multistepmodningen af et antimikrobielt peptid naturligt produkt20. Vi illustrerer, hvordan HDX-MS kan bruges til at afsløre substratbindingssteder og allosteriske egenskaber, der har undgået tidligere karakterisering. Flere andre protokoller om protein HDX-MS er blevet offentliggjort i de seneste år25,26. Sammen med det nuværende arbejde skulle disse tidligere bidrag give læseren en vis fleksibilitet i eksperimentelt design.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af deutererede reagenser og enzymstrømpeopløsninger

  1. Forbered reagenser, der er nødvendige for HDX-reaktionerne (herunder eventuelle buffere, salte, substrater, ligands osv.) som 100−200x koncentrerede stamopløsninger i D2O (99,9% atomfraktion D). Forbered mindst 50 ml bufferlageropløsning.
    BEMÆRK: Til karakterisering af HalM2, Der blev fremstillet følgende opløsninger: 500 mM MgCl2,100 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), 750 mM ATP (i HEPES-buffer), 800 mM HEPES pD 7,1, 500 μM HalA2 og 500 mM AMPPNP.
  2. Frys og lyophilize bestanden løsninger til tørhed.
  3. Genopløs i D2O, og gentag lyophilization cyklus mindst én ekstra gang til at erstatte så mange af de udskiftelige protoner med deuteroner som muligt.
  4. PD for det deutererede HEPES-stødpudelager justeres til den ønskede værdi med koncentreret NaOD/DCl under hensyntagen til følgende forhold27:
    Equation 1
    BEMÆRK: Midt HDX-hastigheden afhænger i høj grad af opløsningens pL (pL = pH eller pD)5. Forskellige partier af stødpudelageropløsninger skal fremstilles, opbevares og anvendes på samme måde for at undgå mindre pL-afdrift mellem forsøg.
  5. Mængden af hvert reagens, der er nødvendigt for en 300 μL HDX-analyse, beregnes og opbevares som engangs-aliquots ved -80 °C.
  6. Der fremstilles en koncentreret enzymlageropløsning (~100−200 μM) i protiated enzymlagringsbuffer ved hjælp af et centrifugalfilter (Tabel over materialer) eller tilsvarende anordning.
    BEMÆRK: Den nøjagtige buffer og centrifugalfilter molekylær vægt cutoff vil afhænge af protein / enzym af interesse. HalM2 opbevares i 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mMM KCl og 10% glycerol. 10 kDa filtre blev brugt til at forberede det koncentrerede enzym.
  7. Enzymet til engangsdele og opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Dette kan være et stoppested. Alle lagerløsninger, der er beskrevet i afsnit 1, kan udarbejdes forud for HDX-reaktionerne. Hvis de opbevares ved -80 °C, vil de fleste enzymer/deutererede stamopløsninger være stabile i mange måneder.

2. Kalibrering af HDX-sluk-lydstyrken

  1. Der fremstilles en 300 μL HDX-reaktion i D2O ved hjælp af de deutererede reagenser og koncentrerede enzymlagre, der er forberedt i punkt 1.
    1. Brug en endelig enzymkoncentration på 1−5 μM.
    2. Brug en endelig deutereret HEPES bufferkoncentration på mindst 50−100 mM.
    3. Sørg for, at koncentrationerne af andre komponenter er tilstrækkelige til at opretholde den ønskede enzymaktivitet/-funktion.
  2. Forbered 1 L HDX-dæmpningsopløsning (100 mM fosfat, 0,8 M guanidin-HCl, pH 1,9). Fryse og opbevares i både 50 mL portioner (for langtidsbestand) og 1 mL portioner (til engangsbrug aliquots).
    BEMÆRK: Den nøjagtige sammensætning af dæmpningsbufferen afhænger af det enzym, der bruges i proteolysetrinnet i bottom-up HDX-MS-arbejdsprocessen (trin 3.3.3). Den dæmpningsbuffer, der gives her, er kompatibel med pepsin, den mest anvendte protease til HDX-MS. Hvis der bruges en anden protease, skal du kontakte proteaseleverandøren for at sikre bufferkompatibilitet.
  3. Kalibrere mængden af dæmpningsbuffer, der er nødvendig for at justere den endelige pL i den slukkede HDX-reaktionsblanding til en pH-meteraflæsningsværdi på 2,3.
    BEMÆRK: Peptidens opløsningsmiddel H/D-valutakurs midt i N-H-bindingen er en pH-afhængig proces, der er underlagt både syre- og basekatalyse. Den mindste valutakurs forekommer til en værdi af pH 2,5 (pH-måleraflæsning = 2,3 for en blanding på 50:50 H2O:D2O). Således vil en endelig pL-værdi nær 2,5 minimere hydrogen tilbage udveksling, der opstår under bottom-up LC-MS analyse, og dermed bevare deuterium etiketten i peptider.
    1. 50 μL af HDX-reaktionsblandingen blandes fra trin 2.1 med 50 μL slukbuffer, og pL i den slukkede blanding måles med en mikrotipelektrode.
    2. Forøg lydstyrken af sluk-opløsningen efter behov for at justere den endelige pH-måleraflæsning til en værdi af 2,3.
    3. Når det relevante slukningsvolumen er blevet bestemt, gentages slukningsprocessen flere gange ved hjælp af friske 50 μL aliquots fra HDX-reaktionen (trin 2.1) for at sikre, at der opnås en ensartet endelig pL ved tilsætning af en fast mængde stødpude.

3. Udarbejdelse af referenceeksempler og optimering af LC-MS-arbejdsgangen nedefra og op

  1. Der fremstilles ikke-deutererede referenceprøver for det protein, der er af interesse for tre eksemplarer i 0,5 mL rør. Sørg for, at de endelige reaktionsblandingsbetingelser er identiske med dem, der anvendes i de autentiske HDX-reaktioner (trin 2.1), bortset fra at reaktionerne fremstilles i H2O ved hjælp af reagenslageropløsninger, der også er fremstillet i H2O.
  2. Forspørg prøverne som i trin 2.3 ved at tilføje den relevante lydstyrke for at justere den endelige pH-værdi til 2,5. Flash fryse prøverne i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til analyse.
  3. Analyser de protiated enzymreferenceeksempler ved hjælp af en bottom-up LC-MS-arbejdsgang.
    BEMÆRK: Før disse trin udføres, skal LC-MS-systemet, der skal bruges til dataindsamling, kalibreres korrekt og være klar til brug. Timingen og temperaturen for alle trin i LC-MS-arbejdsgangen nedefra og op skal styres nøje for at minimere forskelle i rygudveksling mellem prøver. Med den MS-instrumentering, der anvendes i denne protokol (Tabel over materialer Og Supplerende oplysninger), kan de fleste trin styres via instrumentsoftwaren. For at sikre indsamlingen af præcise replikater anbefales det at automatisere så mange af trinnene i arbejdsprocessen som muligt.
    1. En individuel enzymreferenceprøve (tilberedt som i trin 3.2) fjernes fra fryseren og optøs ved 37 °C i 1 min. i et vandbad.
    2. På præcis 2 minutter efter fjernelse af prøven fra fryseren og optøning tilføres en 40 μL del af den slukkede referenceprøve i en ULTRA-performance flydende kromatografikolonne (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM), der indeholder en stationær fase, der er funktionaliseret med pepsin (en syrestaldet protease).
    3. Prøven fordøjes med en strømningshastighed på 100 μL/min. i 3 min ved 15 °C ved hjælp af 0,1% myresyre i H2O (pH = 2,5) som opløsningsmiddel.
    4. De peptiske peptider opsamles, når de lusker fra pepsinkolonnen på en C18-fældekolonne, der holdes ved 0,4 °C for at minimere tilbageudveksling.
    5. Desaltede peptiske peptider overføres fra fældekolonnen til en C18-analysekolonne (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å), der holdes og betjenes ved 0,4 °C for adskillelse af peptiske peptider.
      BEMÆRK: Trin 3.3.3−3.3.5 kan automatiseres af visse LC-MS-systemer, der bruges til HDX-MS-dataindsamling. Alternativt kan disse trin udføres uafhængigt, idet man skal huske på, at timingen og temperaturen på hvert trin skal kontrolleres omhyggeligt for at opnå en konsekvent lav rygudveksling.
    6. C18-kolonnen med acetonær/vand/0,1% formic syreopløsningssystem elueres. Optimer LC-gradienten for det protein, der er af interesse, for at maksimere adskillelsen af og bevare deuteriumetiketten i de peptiske peptider.
      BEMÆRK: Oplysninger om graduering findes i de understøttende oplysninger.
    7. Understøt den peptiske fordøje til elektrosprayionisering (ESI) massespektrometri.
      BEMÆRK: Kildebetingelserne i de understøttende oplysninger vil give tilstrækkelig ionisering for de fleste peptiske peptider.
      1. Når ioniseret i MS instrument, udføre en gas fase ion mobilitet adskillelse ved hjælp af kvælstof som buffer gas til at øge den maksimale kapacitet af metoden.
      2. Efter ionmobilitetsadskillelse udsættes peptidprækursorionerne for en MSE-arbejdsgang, der involverer vekslende cyklusser med lav kollisionsenergi (4 V) og høj kollisionsenergi (21−40 V).
        BEMÆRK: De vekslende lav- og højkollisionsenergiregimer gør det muligt at indsamle MS-data (lav kollisionsenergi) samtidig med MSMS-data (høj kollisionsenergi). Dette giver igen mulighed for tidskorrelation af prækursorioner med deres respektive fragmentioner. Denne sammenhæng er afgørende for sikker peptididentifikation som beskrevet i afsnit 4.
      3. Opdag peptidprækursoren og fragmentionerne ved hjælp af en masseanalysator med en opløsningseffekt på mindst 20.000.
      4. Samtidig med dataindsamlingen skal du anskaffe MS-data for en ekstern [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) ekstern standard.
        BEMÆRK: Den MS-arbejdsproces, der er beskrevet i trin 3.3.7, kaldes en MSE-protokol. Komplette instrumentale indstillinger for en MS E-protokol, der er egnet til HDX-MS med bund op, findes i understøttende oplysninger.
    8. Vurder kvaliteten af LC-MS-dataene.
      BEMÆRK: Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol og de instrumentale indstillinger i de understøttende oplysningerskal referenceprøverne frembringe et samlet ionkromatogram med en maksimal signalintensitet på ca. 1 x 108. Der skal være mange peptiske peptider, der eluerer mellem 3–9 min (Figur 3A−C).
    9. Der indsprøjtes 40 μL blindprøver (0,1% myresyre i vand) for at rense pepsin- og analysekolonnerne C18.
      BEMÆRK: Generelt skal 2−3 emner være tilstrækkelige.
    10. Gentag trin 3.3.1−3.3.9 for hver af trepartsreferenceproteinprøverne.

4. Behandling af referencedataene og definition af en peptidliste

  1. Analyser de rå MSE-data (trin 3.3.7) ved hjælp af proteomics-software (Tabel over materialer). Brug proteomics-softwaren til biblioteker | Protein Sequence Databanks til at definere protein database ved at importere aminosyre sekvens af protein af interesse.
    BEMÆRK: Målet med dette trin er at søge i reference-MS-data for peptiske peptider, der er afledt af det protein, der er af interesse, og at bruge MSMS-dataene (erhvervet samtidig med MS-dataene) til at validere eventuelle formodede peptididentifikationer.
  2. Giv et navn til proteinsekvensen af interesse. Importér proteinsekvensen (i FASTA-format). Softwaren vil udføre en i silico fordøjelsen af databaseproteinet for at generere en liste over peptider, der vil blive brugt til at søge i LC-MS-dataene.
  3. Definer behandlingsparametrene (findes i menuen Bibliotek). Vælg Electrospray MSE som dataopsamlingstype. I feltet Lås masse for opladning 2 skal du indtaste 785,8426 for m/z for 2+ ion af [Glu-1]-fibrinopeptidE B (GluFib) og klikke på udfør.
  4. Definer arbejdsprocesparametrene (findes i menuen Bibliotek).
    1. Vælg Electrospray MSE som søgetype. Under | Overskriften Databasesøgningsforespørgsel skal du vælge det databaseprotein, der blev oprettet i trin 4.2 i feltet Databank.
    2. Skift primær digest-reagens til uspecifikt, og ryd feltet Fast modifikatorreagens ved at holde Ctrl-knappen nede, mens du klikker på Carbamidomethyl C.
  5. Angiv outputmappen ved at navigere til indstillinger | opsætning af automatisering | Identitet E. Markér afkrydsningsfelterne for Apex 3D og Peptide 3D-output og ionregnskabsoutput, og angiv den ønskede mappe.
  6. Behandl referenceeksempeldataene.
    1. Opret en ny plade på venstre værktøjslinje i proteomics platformarbejdsområdet ved at højreklikke på Microtiter Plate. Der fremhæv tre brønde i mikrotiterpladen (en for hver referenceprøve, der er indsamlet i afsnit 3). Venstre klik i en brønd, hold og træk til tre brønde.
    2. Højreklik, og vælg Tilføj rådata. I det vindue, der vises, skal du navigere til den mappe, der indeholder de tre referencefiler fra afsnit 3, og vælge dem på samme tid.
    3. Klik på næste, og vælg de behandlingsparametre, der er defineret i trin 4.3. Klik på næste, og vælg de arbejdsprocesparametre, der er defineret i trin 4.4. Klik derefter på udfør.
  7. Når de rå data, behandlingsparametre og arbejdsgangsparametre er blevet tildelt hver brønd på pladen, vises brøndene blå. Vælg brøndene, højreklik, og vælg de nyeste rådata. Klik på højre nederste hjørne af vinduet for at spore behandlingen af dataene. Når meddelelsen Intet job at køre vises, er behandlingen færdig.
  8. Når databehandlingen er afsluttet, bliver brøndene i pladen grønne. Højreklik på brøndene, og vælg vis arbejdsprocesresultater. Der åbnes et separat vindue for hver referencedatafil.
  9. Undersøg dataene for at sikre, at størstedelen af MS-signalerne i referenceprøvedataene med succes blev kortlagt til peptider forudsagt fra in-silico fordøjelsen af det protein, der er af interesse. Matchede peptider vil blive farvet blå i udgangsspektret (Figur 4). Dobbeltklik på OK-filteret, og kontroller, at procentdækningen er større end 99 %.
    BEMÆRK: Ved behandling gemmes dataoutput automatisk med filtypenavnet (raw_data_file_name_IA_final_peptide) i den mappe, der er angivet i trin 4.5.
  10. Importér proteomics-softwareoutputtet til HDX-behandlingssoftwaren (Table of Materials) for yderligere tærskelværdi.
    1. Klik på Data i venstre hjørne af HDX-behandlingssoftwarevinduet. Klik på import PLGS resultater og klik på tilføje ikonet. Vælg de behandlede datafiler fra trin 4.9 ved at navigere til den relevante mappe.
    2. Klik på Næste, og angiv følgende parametre: minimum på hinanden følgende ioner ≥ 2, massefejl = 5 ppm og filtærskel = 3. Klik på Udfør.
  11. Når du er tilfreds med tærskelparametrene, skal du gemme HDX-projektet. Alle HDX-data importeres til dette projekt til analyse og visning.
    BEMÆRK: Deuterium udvekslede prøver, der er beskrevet i næste afsnit, skal behandles med en identisk LC-MS-arbejdsproces. Før du fortsætter med HDX-analyse (afsnit 5), skal du derfor sikre dig, at prøveforberedelsen (afsnit 2), bottom-up LC-MS-arbejdsgangen (afsnit 3) og databehandlingsarbejdsgangene (afsnit 4) giver den ønskede reproducerbarhed og sekvensdækning af målproteinet. Hvis nogen af disse processer skal ændres for at forbedre dækningen, anbefales det at vende tilbage til trin 2.1, udarbejde friske referenceprøver i tre eksemplarer og gentage afsnit 2−4 (samtidig med at der foretages de nødvendige justeringer af protokollen) for at sikre, at hver peptid kan reproduceres og detekteres.

5. Udførelse af HDX-reaktioner

  1. Forbered arbejdsområde til HDX-reaktioner.
    1. For-aliquot sluk buffer i korrekt mærket 0,5 mL rør. Forbered et andet rør til hvert tidspunkt, hver replikat og hver biokemisk tilstand, der skal analyseres. Brug den relevante lydstyrke fra trin 2.2, der er nødvendig for at justere den endelige pH-måleraflæsning af en 50 μL del af HDX-reaktionen til en værdi på 2,3.
    2. Centrifuger kort de 0,5 mL bøtter for at overføre hele stødpude bufferen til bunden af røret. Placer rørene på is.
    3. Fyld en lille Dewar med flydende nitrogen og holde støder op til arbejdsområdet.
  2. Forbered HDX-reaktionerne. Sørg for, at der er tilstrækkelig reaktionsvolumen til at indsamle det ønskede antal udvekslingstidspunkter (en 50 μL aliquot for hvert ønsket tidspunkt). Indsamle mindst 4−5 tidspoint over 3−4 størrelsesordener i tidsskala (f.eks. slukke gange på 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min], og 14.400 s [4 timer] giver tilstrækkelig dækning af udveksling dynamik for de fleste enzymer).
    1. Forblanding af alle de deutererede komponenter (minus enzym) fra trin 1.1 i D2O.
    2. For hver biokemisk tilstand, der skal undersøges (frit enzym, enzym + ligand, enzym + inhibitor osv.), skal HSX-reaktioner forberedes i mindst tre eksemplarer.
    3. Reaktionsblandingerne inkuberes i et temperaturreguleret vandbad ved 25 °C i 10 minutter inden tilsætning af enzymet.
      BEMÆRK: Enzymet skal fremstilles som en koncentreret stamopløsning (~100−200 μM, trin 1.6) for at minimere tilsætningen af protium i HDX-analysen.
    4. Når enzymet tilsættes til en endelig koncentration på 1−5 μM, skal du starte timeren. Opløsningen blandes forsigtigt og hurtigt med en 200 μL pipette for at sikre, at enzymet fordeles jævnt i prøven.
    5. Ved de ønskede udvekslingstidspunkter fjernes 50 μL aliquots fra HDX-reaktionen og blandes hurtigt og jævnt med den forkodte, iskolde stødpude i et 0,5 mL rør.
      BEMÆRK: Blandingsvolumenerne og blandingsproceduren skal være så præcis og reproducerbar som muligt for at sikre, at den ønskede endelige dæmpning af pL på 2,3 opnås hurtigt i alle prøver. Holde dæmpning buffer iskold vil bidrage til at minimere tilbage udveksling ved denaturering af enzym.
    6. Umiddelbart efter slukning af HDX-prøven skal røret og flashfryses i flydende nitrogen.
    7. Fortsæt med at indsamle tidspunkter, indtil alle assays er færdige, og overfør derefter prøver til fryseren -80 °C til opbevaring.
      BEMÆRK: Dette kan være et stoppested. Efter at have indsamlet alle HDX-tidspunkter kan prøverne opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til LC-MS-analyse. Ideelt set bør tredobling af HDX-reaktioner udføres for alle biokemiske tilstande af interesse samme dag. Som minimum skal alle replikerede HDX-reaktioner for en given biokemisk tilstand køres parallelt samme dag.
  3. Når du har indsamlet alle de slukkede HDX-tidspunkter, skal du underkaste eksemplerne den optimerede bottom-up LC-MS-arbejdsgang, der er udviklet som beskrevet i trin 3.3. Indsprøjt HDX-prøver i randomiseret rækkefølge med et passende antal emner mellem prøverne for at sikre, at enhver peptidoverførsler er minimale.
    BEMÆRK: HDX-data behøver ikke at blive indsamlet i MS E-tilstand. Det høje kollisionsenergisegment (trin 3.3.7.2) bør derfor fjernes fra MS-arbejdscyklussen. Dette bør være den eneste ændring, der er foretaget i den arbejdsproces, der er beskrevet i trin 3.3.
  4. Vurder kvaliteten af HDX-dataene, efterhånden som de indsamles.
    1. Sørg for, at kromatografiske toppe i det samlede ionkromatogram for de ikke-deutererede referenceprøver vises på samme retentionstid i de deutererede prøver (som i figur 3D−F).
    2. Sørg for, at massespektre opsummeret over bestemte tidsintervaller fra referenceprøver og deutererede prøver viser tegn for deuteration (dvs. et skift i isotopkonvolutten af individuelle peptider til højere m/z-værdier i de deutererede prøver [Figur 6]).

6. Behandling af HDX-data

  1. Importer HDX-dataene til HDX-projektet, der blev oprettet i trin 4.11, ved at klikke på Data | MS-filer på den øverste værktøjslinje.
    1. Klik på ny stat og ny eksponering efter behov for at definere de biokemiske tilstande (f.eks. gratis enzym, enzym + ligand osv.) og deuteriumeksponeringstider, der er relevante for analysen.
    2. Klik på New Raw for at vælge de HDX-datafiler, der skal analyseres. Tildel de relevante udvekslingstider og biokemiske tilstand til hver rå datafil, der importeres.
      BEMÆRK: Dataene kan importeres og behandles i batches eller på én gang. Hvis du føjer data til projektet, fortrydes ingen analyse, der tidligere er udført i det pågældende projekt.
  2. Når datafilerne er tilføjet, skal du klikke på Udfør for at starte databehandlingen. Efter en kort forsinkelse spørger softwaren, om brugeren vil gemme dataene, før de fortsætter. Klik på Ja.
    BEMÆRK: Den indledende behandling kan tage op til flere timer afhængigt af hvor mange prøver der analyseres, hvor mange peptider der er på den endelige peptidliste (trin 4.10), størrelsen af det kromatografiske vindue og hyppigheden af spektral erhvervelse.
  3. Hvis det ønskes, skal du ændre behandlingsparametrene i menuen Konfiguration for at ændre ionsøgningsparametrene. Sørg for at anvende de samme ionsøgningsparametre for alle data i et givet projekt.

7. Analyse og visualisering af HDX-data

BEMÆRK: Når den første behandling af de rå data er afsluttet (trin 6.2), vil HDX-behandlingssoftwaren have placeret peptider fra peptidlisten (genereret i trin 4.10) i hver af de rå datafiler, der blev analyseret. Når isotopfordelingen for en peptid på listen er placeret i en rå datafil, repræsenterer HDX-behandlingssoftwaren hver isotop med en "pind" (som i figur 6C−E). De relative intensiteter af pindene for en given peptid bruges derefter til at beregne deuteriumoptagelsen i forhold til referencespektre. Mens HDX-behandling software gør et beundringsværdigt stykke arbejde med korrekt tildeling af "pinde" til de fleste peptider, betydelig manuel kuration af deuterium optagelse værdier vil stadig være påkrævet.

  1. Analyse af værdier for peptiddeuteriumoptagelse
    1. Vælg den første peptid på listen peptid, og åbn den stablede spektrale afbildning i menuen Visninger. Rul op og ned i det stablede spektreplotvindue for at se massespektre for den valgte peptid som funktion af deuteriumbytningstid(Figur 7D,E).
    2. Tildel og fjern tildeling af pinde efter behov ved hjælp af museklik for at sikre, at den korrekte isotopfordeling er placeret i dataene, og at hver isotop er blevet tildelt (tildelte pinde vises blå). Hvis du klikker på et af spektre i det stablede spektrale plot (Figur 7D, E), kan brugeren tildele/fjerne tildelingspinde i det aktive datafremviservindue ( Figur7C).
    3. Kontroller stick-opgaverne for hver opladningstilstand ved at skifte opladningstilstand øverst i det stablede spektrale plotvindue.
    4. Gentag trin 7.1.1−7.1.3 for hver biokemisk tilstand af interesse. Den biokemiske tilstand kan også skiftes øverst i det stablede spektrale plotvindue. For de mest nøjagtige målinger af deuteriumoptagelsesforskelle skal du sikre dig, at pinde tildeles for det samme sæt opladningstilstande for hver biokemisk tilstand.
    5. Gentag trin 7.1.1−7.1.4 for hver peptid på peptidlisten.
    6. Kontroller standardafvigelsen for peptidværdier for optagelse af deuterium ved hjælp af dækningskortet.
      1. Få adgang til dækningskortet fra menuen Visninger, som viser hver peptid på peptidlisten, der er kortlagt langs aminosyresekvensen af det pågældende protein (Figur 8C). Farve peptider i henhold til relativ standardafvigelse (enheder af Da).
      2. Søg visuelt på kortet efter afvigende peptider med høj relativ standardafvigelse. Klik på outlier peptider i dækningen kortet for at udfylde stablet spektrale parceller (Figur 8B) og data viewer vindue (Figur 8A) med målet peptid.
      3. Brug den stablede spektrale plot, omhyggeligt kontrollere, at alle afgift stater og alle tidspunkter af outlier peptid har passende tildelt pinde.
        BEMÆRK: Oftest har peptider med store standardafvigelser (>0,3 Da) isotoptoppe, der ikke blev tildelt korrekt af softwaren (som angivet i figur 8B). Tildeling af manglende pinde vil generelt gøre det muligt at reducere den relative standardafvigelse for en peptid til <0,3 Da.
      4. Skjul peptid fra listen, hvis den relative standardafvigelse ikke kan reduceres til mindre end 0,3 Da.
  2. Eksporter HDX-differencedata mellem to biokemiske tilstande til kortlægning på en strukturel model af det protein, der er af interesse.
    1. Få vist forskellen i interesse for dækningskortet. Højreklik på disponeringskortet for at eksportere differencedataene til en .csv fil. Eksportere tilstandsdataene (i .csv format) ved at navigere til data | Eksporter tilstandsdata på hovedværktøjslinjen.
      BEMÆRK: Der findes passende formatering af differencedata og tilstandsdatafiler i supplerende oplysninger.
    2. Importér differencedata, tilstandsdata og pdb-filen af det protein, der er af interesse, til Deuteros28. Vælg konfidensintervallet på 99 %, vælg aktiver sum, og behandl dataene.
      BEMÆRK: MATLAB skal installeres på pc'en for at køre Deuteros. Deuteros bruger replikatmålingerne i datasættet til at beregne standardafvigelsen for optagelsesdataene for hver peptid. Denne standardafvigelse vil blive brugt til at definere konfidensintervallet for betydelig udveksling, som vises på områderne.
    3. Vælg eksportoptagelse under PyMOL Options | eksport til at generere en Pymol script til at kortlægge regioner af betydelig udveksling forskel på pdb struktur af protein af interesse ved hjælp af PyMOL software.
      BEMÆRK: Ved hjælp af den arbejdsgang, der er beskrevet i denne protokol, er konfidensintervallet på 99 % for signifikant forskel i optagelse af deuterium for en given peptid på et enkelt tidspunkt typisk 0,3−0,5 Da. Konfidensintervallet på 99 % for forskellen, der lægges sammen over alle udvekslingstidspoint, er typisk 0,7−1,0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det er nødvendigt at vurdere kvaliteten af den proteolytiske fordøjelse og reproducerbarheden af arbejdsgangen for hvert sæt prøveinjektioner. Før der udføres HDX-MS-assays, er det således vigtigt at etablere effektive betingelser for proteolyse af det protein, der er af interesse, for adskillelse af peptider ved hjælp af omvendt fase flydende kromatografi og gasfaseionmobilitet og til påvisning af peptider ved hjælp af MS. Med henblik herpå bør referenceprøverne for det pågældende protein (indsamlet uden deuterium) undersøges først (afsnit 3). De kromatografiske data i figur 3A−C viser de samlede ionkromatogrammer (TIC' er) for tre referenceprøver af HalM2 lanthipeptidsynetase. TIC er den tidsafhængige ændring i summen af alle iontællinger ved alle m/z-værdier, der indgår i massespektralscanningen. Figur 3D-Fviser et nærmere billede af TIC'erne på mellem 3 og 8min . Massespektre vist i figur 3G−I repræsenterer en opsummering af alle massespektre over et lille tidsinterval (fra 5,0 til 5,1 min) for hver TIC. Der bør lægges særlig vægt på følgende elementer i figur 3.

For det første repræsenterer den store top nær 9,3 min for enden af gradienten ufuldstændigt fordøjede (og dermed store og mere hydrofobe) fragmenter af HalM2 (Figur 3A−C). Fordøjelsen kunne gøres mere effektiv ved at reducere HalM2-koncentrationen, men dette vil reducere peptidsignalintensiteten og signal:støjforholdet. Fordøjelsen kunne også gøres mere effektiv ved at øge kontakttiden (fra 3 min. protokoltrin 3.3.3) med pepsinkolonnen. Øget kontakttid vil dog resultere i mere back exchange. I sidste ende skal disse parametre afbalanceres for det protein af interesse for at give den ønskede sekvens dækning, signal intensitet, og deuterium fastholdelse. For det andet skal TIC-profilernes form og intensitet være ens (som i figur 3D−F). Dette tyder på, at halM2's proteolytiske fordøjelse er reproducerbar og har samme effektivitet i alle tre referenceprøver. Forventningen er, at en lignende fordøjelse af en deuterium-udvekslet prøve vil producere det samme sæt peptider med lignende retentionstider. For det tredje bør massespektre over et givet tidsinterval også være ens(figur 3G−I). En hurtig visuel sammenligning af de opsummerede massespektre over tidsintervallet på 5,0−5,1 min. i den kromatografiske adskillelse viser, at massespektralsignalerne i hver prøve faktisk er meget ens, hvilket giver tillid til, at lignende peptider er til stede i hver prøve og eluerer på lignende tidspunkter fra C18-kolonnen. En lignende hurtig visuel inspektion bør udføres over andre tidsintervaller på tværs af kromatogrammet.

Efter visuelt at have kontrolleret ligheden i LC-MS-dataene i referenceprøverne anvendes proteomics-softwaren til at søge i MS-dataene efter peptider, der stammer fra aminosyresekvensen af det pågældende protein. Efter at have defineret proteinsekvensdatabanken (aminosyresekvensen af det pågældende protein), behandlingen og arbejdsgangsparametrene som beskrevet i protokoltrin 4.2−4.4, behandles hver enkelt referenceprøve for at detektere peptiske peptider, der matcher forudsagte peptider afledt af det protein, der er af interesse. Et eksempel på proteomics-softwareoutputtet for en ikke-angivet HalM2-referenceprøve er vist i figur 4. Der bør lægges særlig vægt på følgende træk. For det første vil ethvert MS-signal, der matches med en bestemt peptid inden for det protein af interesse i henhold til de værdier, der er defineret i behandlings- og arbejdsgangsparametrene, blive farvet blåt i det nederste spektrum. Hvis en referenceprøve behandles "med succes", vises de fleste signaler blå (som det er tilfældet for dataene i figur 4). I øverste venstre panel skal du desuden sikre dig, at "OK-filteret" skiftes til det grønne flueben. Når dette er gjort, vil statistikkerne i øverste bjælke i øverste højre panel (fremhævet med blåt i figur 4) kun afspejle de peptider, der giver høj tillid score. Disse peptider udviser lav ppm massenøjagtighed, flere fragmentioner og god korrelation mellem fragment- og forældreionfastholdelsestider og anses for at være sikre identifikationer. For den viste HalM2-referenceprøve blev der påvist 1.421 peptider med høj score, der dækkede 99,6% af HalM2-sekvensen. Der bør opnås næsten 100 % sekvensdækning for de fleste proteiner ved hjælp af den bottom-up LC-MS-arbejdsgang, der er beskrevet i protokolafsnit 3. Desuden er yderligere nyttige statistikker for hver peptid tabuleret i øverste højre panel, herunder massefejl, prækursor retention tid, antallet af fragment (produkt ioner), den komplette liste over fragmentioner ved navn, og ion mobilitet drift tid. Disse oplysninger er nyttige til fortolkning af resultater, som altid bør fokuseres på de mest selvsikkert identificerede peptider.

Den endelige peptidliste bør bestemmes ved yderligere tærskelværdi i HDX-behandlingssoftwaren. Efter at have analyseret referencedataene for at generere peptidlisten (protokolafsnit 4), skal outputtet importeres til HDX-behandlingssoftwaren for yderligere tærskelværdi. Outputfilerne gemmes i en mappe som defineret i protokoltrin 4.5 med filtypenavnet "..._IA_final_peptide.csv". Når du uploader outputtet til HDX-behandlingssoftwaren , vises den komplette liste over peptider i panelet "peptideksempel" (Figur 5), og antallet af peptider, sekvensdækning og redundans vises i nederste højre hjørne af vinduet. Disse værdier ændres i realtid, efterhånden som der anvendes yderligere tærskelværdier. Når du har klikket på næstegang , kan der angives tærskelværdier i de angivne felter. De mest kritiske filtre er "filtærsklen", som kræver, at alle peptider skal være placeret i hver af de tre referenceprøver den "maksimale MH+-fejl (ppm)", som skal indstilles til en værdi <10 ppm, og "minimum på hinanden følgende produkter", som kræver, at peptiden genererer mindst to på hinanden følgende fragmentioner i MSMS-fasen (dvs. høj kollisionsenergi) i MS E-arbejdsprocessen (protokoltrin 3.3.7.2).

Den mest markante tekniske begrænsning af HDX-MS-analysen er rygudvekslingen af deuterium til protium, der opstår, så snart deuterium-udvekslede prøver slukkes (med protiated buffer). Back exchange fortsætter under protease fordøjelsen og LC-MS dele af arbejdsgangen. Tilbage udveksling er uundgåelig, men hvis pH, temperatur og timing af alle post-quench trin er omhyggeligt kontrolleret som beskrevet i protokollen, 60%−70% af deuterium etiketten kan opretholdes. Af denne grund er det vigtigt at kontrollere i de tidlige stadier af assay udvikling, at de fleste af peptider bevarer deuterium. Dette kan opnås hurtigt ved at sammenligne de rå data fra en deutereret prøve med dataene fra en referenceprøve. Som det blev gjort for at sikre reproducerbarheden af referenceprøverne (figur 3), sammenlignes TIC'erne for de deuteriumvekslede og ikke-deutererede referenceprøver, hvilket sikrer, at profilernes former ligner hinanden. Desuden lægges massespektre over det samme kromatografiske tidsinterval i begge prøver. De fleste peptider i den deuterium, der udveksles prøve, bør udvise tydelige forskydninger i deres isotopfordelinger i retning af højere m/z-værdier (som i figur 6). Disse data indikerer, at en betydelig del af deuteriumetiketten opretholdes i løbet af syrespærren, pepsin fordøjelsen og LC-MS dataindsamlingen.

Når det er kontrolleret, at arbejdsprocessen giver tilstrækkelig deuteriumretention, skal optagelsen af deuterium kvantificeres. Således importeres de rå data til deuterium-udvekslede prøver til HDX-behandlingssoftwaren. Ved hjælp af referenceprøverne og den færdige peptidliste finder HDX-behandlingssoftwaren peptider fra peptidlisten i hver af de rå datafiler og tildeler "pinde" til hver af isotoptoppene. I de repræsentative data for HalM2, der er vist i figur 7, er de korrekt tildelte pinde farvet blå i alle spektre. Efter tildeling af pinde bestemmes centroid m/z-værdien for isotopfordelingen af softwaren og bruges til at beregne deuteriumoptagelsen i forhold til den ikke-deutererede referenceprøve. Deuteriumbytningsværdien for hver peptid skal kontrolleres manuelt. I figur 7vises den aktuelt valgte peptid (HIDKLTVGL, der spænder over HalM2-restkoncentrationer 110−118) i venstre panel af hoveddatafremviseren (Figur 7A). De andre paneler viser HDX-data, der er forbundet med denne peptid. Hvis du klikker på en peptid på peptidlisten, udfyldes de andre paneler med HDX-data fra den peptid. Figur 7B viser deuteriumoptagelsesområderne for peptid 110−118. Dette datasæt indeholder fire udvekslingstidspunkter: 0,5, 5, 30 og 240 min (indsamlet i tre eksemplarer). Der blev indsamlet udvekslingsdata for to biokemiske tilstande: frit HalM2-enzym (rødt) og HalM2-enzymet, der er komplekst med AMPPNP og dets substrat peptid HalA2 (blå). Bemærk den betydelige forskel i deuteriumoptagelse i peptid 110−118 på tværs af hele tidsforløbet og replikatmålingernes høje præcision (fejllinjer vises på plottet i figur 7B). Generelt vil der blive opnået en lignende præcision i optagelsesmålingen for de fleste peptider, hvilket understreger reproducerbarheden af den arbejdsgang, der præsenteres i denne protokol. Ved ligandbinding (blå kurve i figur 7B) gennemgår peptidbindingen midt i 110-118-regionen HalM2 tilsyneladende betydelig beskyttelse mod deuteriumudveksling, hvilket tyder på, at aminosyrerne i 110−118-regionen bliver mere stabilt struktureret ved ligandbinding. Efterfølgende tilblivelse af denne region indikerede en rolle i bindingen til forløberen peptid, HalA220. Vist også i figur 7 er de stablede spektrale observationsområder for tilstanden HalM2 (Figur 7D) og tilstanden HalM2:AMPPNP:HalA2 (figur 7E). I disse parceller øges udvekslingstiden fra bunden til toppen. Masseforøgelsen af peptid 110−118 ved deuteriumudveksling på længere tidspunkter fremgår tydeligt af visuel inspektion. Det er også tydeligt, at peptid 110−118 tager mere deuterium i HalM2-staten (figur 7D) end i fuld liganded tilstand (Figur 7E). Hvis det er nødvendigt, vil et klik på et af delpunkterne i figur 7D eller figur 7Egive brugeren mulighed for manuelt at ændre tildelingen af pinde i hoveddatafremviseren (Figur 7C). Ved stick opgave / unassignment, hdx-behandling software vil genberegne deuterium optagelse værdier, og alle de parceller vil blive opdateret i realtid. På samme måde udfylder du datafremviseren i panel C til manuel stick-opgave ved at klikke på individuelle datapunkter i panel B.

Når der er tildelt pinde for hver peptid og udvekslingstid for alle biokemiske tilstande, skal standardafvigelsen for de målte optagelsesværdier kontrolleres. Dette er nemmest at udføre med dækning kort og stablet spektral plot (Figur 8). Vælg rentetilstanden og udvekslingstiden i dækningsoversigten (Figur 8C), og vælg derefter den relative optagelsesstandardafvigelse. Peptider på dækningskortet vil blive farvet i henhold til standardafvigelsen i den målte deuteriumoptagelsesværdi. På denne måde vil det være meget nemt at visuelt identificere peptider, der har isotop stick mis-opgaver. Hvis du klikker på den outlier peptid (med høj standardafvigelse) i dækningskortet, udfyldes hoveddatafremviseren og det stablede spektreplot med HDX-data fra den outlier peptid. Sticktildelingerne for hvert tidspunkt og opladningstilstand kan derefter ændres efter behov for at korrigere den målte optagelsesværdi. Igen opdaterer HDX-behandlingssoftwaren alle datadisplays i realtid, når stick-opgaverne ændres.

Efter fuld kuratering af HDX-datasættet skal betydningen af deuteriumoptagelsesforskelsmålingen for hver peptid overvejes forud for datafortolkning. Ved hjælp af en metode beskrevet af Engen og kolleger29har vi anslået en gennemsnitlig optagelsesværdi på 0,1 ± 0,1 Da for HalM2-proteinet ved hjælp af den arbejdsgang, der er beskrevet i ovenstående protokol20. Denne værdi stemmer overens med de fejl, som andre har rapporteret for lignende HDX-arbejdsprocesser for bund op- og løbende udveksling29,30. For nylig udviklede Politis og kolleger Deuteros, et nyttigt open source-værktøj (implementeret i MATLAB) til hurtigt at bestemme betydelige optagelsesforskelle i HDX-datasæt28. Repræsentative inputfiler til Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" og "Difference_Data_for_Deuteros") er inkluderet i de understøttende oplysninger. Hvis de eksporteres direkte fra den HDX-behandlingssoftware, der er beskrevet i denne protokol (Table of Materials), vil forskellen og tilstandsdatafilerne have det rette format til fillæsning af Deuteros. Hvis HDX-data genereres på et andet LC-MS-system, skal datafiler, der ligner dem, der findes i de understøttende oplysninger, konstrueres manuelt.

Arbejdsområdet Dueteros vises i Figur 9. Når dataene er importeret til Deuteros, vælger brugeren den ønskede konfidensgrænse (>98% anbefales) og klikker på Importer og beregn. For den samkopierede datatilknytning skal du vælge dækning for datatype og absolut for farveskala. Klik på plot. For skovområderne skal du vælge binært filter som datatype, det ønskede konfidensfilter og aktivere summen. Ved atklikke plot , vil Deuteros plot alle peptider på hver udveksling tid punkt som en funktion af deres position i aminosyre sekvens og deres deuterium optagelse værdier. Peptider, der udviser betydelig udveksling, vil blive farvet enten rød eller blå, afhængigt af om peptid fylder henholdsvis mere eller mindre deuterium i henhold til den forskel, der beregnes. Den signifikansværdi, der rapporteres i hvert område (fra 0,39 til 0,72 Da i de data, der er afbildet i figur 9), beregnes ud fra standardafvigelserne for de målte optagelsesforskelle for hver peptid som bestemt ud fra de replikatmålinger, der findes i datasættet. Konfidensintervallerne vises som stiplede søjler på tværs af hvert enkelt plot. Hvis den er aktiveret, tilføjer "Sum" blot optagelsesforskellen målt på hvert tidspunkt for hver peptid. Endelig skal du vælge eksportoptagelse under PyMOL-indstillinger og derefter eksporterefor at visualisere optagelsesdataene om den tredimensionale struktur af det pågældende protein. Deuteros genererer et PyMOL-script, der kan trækkes og slippes ind i PyMOL-arbejdsområdet, der indeholder den åbne pdf-fil af interesseproteinet.

HDX-MS-arbejdsgangen, der præsenteres i denne protokol, blev brugt til at karakterisere de biokemiske egenskaber ved et enzym (HalM2), der katalyserer en række postoversættelsesændringer på en genetisk kodet peptid (HalA2)20. I figur 10vises repræsentative HDX-MS-resultater for bindingen af HalA2-prækursorens peptid til HalM2:AMP-PNP-komplekset. Panel A viser HalM2-dækningskortet, hvor farven angiver den relative optagelsesforskel mellem den biokemiske tilstand [HalM2:AMPPNP] og tilstanden [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros blev brugt til at kortlægge disse optagelsesforskelle på en homologimodel af HalM2-enzymet (Figur 10B, C). Peptider, der er farvede røde indikerer et fald i deuterium optagelse på HalA2 bindende, tyder på, at disse regioner i HalM2 kan være involveret direkte i bindingen af forløberen peptid. For at undersøge denne hypotese blev region I-III muteret, og de kinetiske egenskaber af varianten enzymer blev undersøgt. Mutationer i region I og III førte begge til betydelige perturbationer i HalA2 peptid bindende affinitet, hvilket tyder på, at disse regioner i HalM2 enten interagerer med peptid substrat direkte, eller er forpligtet til at danne strukturer, der muliggør HalA2 bindende. I modsætning hertil havde mutation af region II ingen effekt på HalA2 bindende affinitet, men denne mutant var næsten blottet for katalytisk aktivitet. En forklaring på dette fund er, at organiseringen af region II observeret på HalA2 binding udløser en kropsbygningsændring, der aktiverer enzymet. Det skal bemærkes, at der forud for denne undersøgelse ikke forelå oplysninger om HalM2-HalA2-bindingsmåden eller om de katalytisk relevante kropsbygningsændringer i systemet, primært fordi både HalM2's og HalA2's store størrelse og fleksible karakter har udelukket strukturelle undersøgelser. Disse repræsentative data om HalM2 lanthipeptidsynetase illustrerer således, hvordan HDX-MS hurtigt kan anvendes til at lokalisere funktionelt relevante regioner i strukturelt dynamiske enzymsystemer – selv i mangel af strukturelle data med høj opløsning.

Figure 1
Figur 1: En kontinuerlig udveksling, bottom-up HDX-MS workflow. Yderligere oplysninger finder du i teksten. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: HDX-satsen afhænger af proteinformationsdynamikken (kåben og ktæt )og den pH-afhængige kemiske ombytningshastighed for N-H-bindingerne i protein backbone for N-D-bindinger (kchem). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative LC-MS-data for triplicatet HalM2-referenceprøverne. Tallet i øverste højre hjørne af hvert panel repræsenterer det samlede antal ioner. Hver række viser data for et andet referenceeksempel. Den første kolonne (A−C) viser de samlede ionkromatogrammer (TIC'er). Den store top på 9,3 min repræsenterer store, ufordøjede peptider. Den midterste kolonne (D−F) viser et nærmere billede af TIC'erne mellem 3 og 8 min. Bemærk den gode tilslutning af profilernes former, hvilket indikerer en lignende underliggende blanding af peptidsignaler i hver referenceprøve på tværs af hele kromatogrammet. Den tredje kolonne (G−I) viser massespektre for hver referenceprøve, der frembringes ved at summere alle de massespektre, der er registreret mellem tid punkt 5.0 og 5.1 min. i kromatografisk kørsel. Visuel inspektion af disse data indikerer, at mange af de samme peptider opdages i hver prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ proteomics softwareoutput for en HalM2-referenceprøve. Det øverste venstre panel viser den komplette liste over HalM2-afledte peptiske peptider, der er registreret i MS-dataene. Bemærk, at "OK-filteret" viser det grønne flueben. Dette filtrerer dataene i henhold til konfidensscoren og fjerner peptididentifikationer af lav konfidens. Den øverste bjælke i højre panel (fremhævet med blåt) viser kumulative statistikker for sættet af peptider med høje scores. De vigtigste statistikker er antallet af påviste peptider (i dette tilfælde 1.421) og sekvensdækningen (i dette tilfælde 99,6%). Yderligere statistikker for hver peptid vises også i øverste højre panel. Hver kolonne i denne datatabel kan sorteres. Det nederste panel viser alle de MS-signaler, der blev matchet til en forudsagt HalM2-afledt peptisk peptid. Bemærk, at størstedelen af MS-signalerne blev tildelt og er farvet blå. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Yderligere tærskelværdi i HDX-behandlingssoftwaren. Proteomics-softwareoutputtet for hvert af de tre HalM2-referenceeksempler importeres til HDX-behandlingssoftwaren (venstre panel). Når du har importeret data, udføres der yderligere tærskler (højre panel). Feltet "minimum på hinanden følgende produkter" henviser til fragmentioner, der genereres ved kavalergang af tilstødende peptidbindinger i peptid. Parameteren "minimum MH+-fejl" giver brugeren mulighed for at definere den acceptable massenøjagtighed, og "filtærsklen" giver brugeren mulighed for at begrænse peptider til kun de peptider, der blev registreret i alle tre referencefiler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative data for en HalM2-referenceprøve (rød) og en HalM2-prøve, der inkuberes i D2O-buffer i 5 minutter (grøn). Begge eksempler blev udsat for den nederste LC-MS-arbejdsproces, der er beskrevet i protokolafsnit 3. Den venstre kolonne viser massespektre opsummeret over tidsvinduet på 6,0−6,1 min. De tre højre kolonner viser et nærmere overblik over de samme massespektre, hvor skiftet til højere m/z-værdier i den deutererede prøve (grøn, top) er indlysende for de fleste peptidsignaler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Skærmbillede af arbejdsområdet i HDX-behandlingssoftwaren. (A) Listen over HalM2-afledte peptider opnået ved analyse af HalM2-referenceprøver med proteomics-softwaren (figur 3) og efterfølgende tærskelværdi i HDX-behandlingssoftwaren (Figur 4). Den aktuelt valgte peptid (HIDKLTVGL, der spænder over HalM2 rester 110−118) er fremhævet med blåt. (B) Deuteriumoptagelseskurverne (som en funktion af udvekslingstiden) for de to biokemiske tilstande af interesse: det frie HalM2-enzym og HalM2-enzymet bundet til AMPPNP og prækursoren lanthipeptide, HalA2. (C) Massespektret af den aktivt udvalgte prøve (i dette tilfælde en af de ikke-deutererede HalM2-referenceprøver). De blå pinde i panel C kan tildeles manuelt/ikke tildeles efter behov, hvis de ikke er korrekt tildelt af HDX-behandlingssoftwaren under den indledende databehandling. (D,E) Stablede spektrale plots for tilstanden HalM2 (D) og tilstanden HalM2:AMPPNP:HalA2 (E). Den tidsafhængige stigning i deuteriumoptagelsen er let synlig, ligesom optagelsesforskellen mellem de to biokemiske tilstande. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Minimering af standardafvigelsen i målte optagelsesværdier. Dækningskortet i HDX-behandlingssoftwaren (panel C) giver et praktisk middel til hurtigt at identificere peptider med store standardafvigelser i deres målte værdier for optagelse af deuterium. I dette hypotetiske tilfælde er nogle af isotoptoppene (blå pinde) for halM2 afledt peptid, der spænder over rester 110−118, ikke tildelt for de 5 minutters udvekslingstidspunkter (de grå pinde i panel B). Dette fører til en stor standardafvigelse i den deuteriumoptagelsesværdi, der måles for 5 min. udvekslingstid. Den store standardafvigelse er let tydelig fra den blå farve på 110−118-peptid i dækningskortet (panel C) og fra datapunktsspredningen og den store fejllinje i optagelsesplottet (panel A). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Deuteros-arbejdsområdet. I dette eksempel blev indspilningsdifferenceværdierne beregnet i HDX-behandlingssoftwaren ved at trække deuteriumoptagelsen af tilstanden HalM2:AMPPNP:HalA2 fra tilstanden HalM2:AMPPNP. Målet med sammenligningen var at visualisere, hvordan peptid (HalA2) binding ændrede den strukturelle dynamik i HalM2:AMPPNP-komplekset. Datasættet indeholdt 4 udvekslingstidspunkter (0,5, 5, 30 og 240 min). Optagelsesforskellen for hver peptid på hvert udvekslingstidspunkt er illustreret i Woods-plottene. De farvede peptider i Woods-plottene indikerer peptider, der udviser en betydelig optagelsesforskel, som defineret ved standardafvigelsen for de replikerede målinger, der findes i datasættet, og de brugerdefinerede konfidensgrænser, der er valgt i Deuteros. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: HDX-MS data guider funktionel analyse af peptidbinding og allosterisk aktivering i lanthipeptidsynetase HalM2. Ændringen af optagelsen af deuterium ved bindingen af HalA2-prækursorens peptid til HalM2 lanthipeptidsynetase blev undersøgt. Optagelsesforskellen for hver peptid efter en 5 minutters udskiftningsreaktion afbildes (A). Denne plot blev genereret i HDX-behandling software. Peptider farvet rød og blå gennemgår henholdsvis mindre og mere deuteriumoptagelse i nærværelse af HalA2 peptid. Disse HDX "hot spots" er kortlagt på en HalM2 homologi model (B, C). Identifikationen af peptider under betydelige udvekslingsforskelle blev bestemt i Deuteros. PyMOL-scriptet, der blev brugt til at kortlægge differenceværdierne på homologimodellen, blev genereret i Deuteros. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HDX-MS-arbejdsgangen, der præsenteres i denne protokol, giver en bemærkelsesværdig robust platform til kortlægning af den rumlige fordeling af strukturelt dynamiske elementer i proteiner og til at undersøge, hvordan disse dynamikker ændrer sig som reaktion på forstyrrelse (ligandbinding, enzym mutagenese osv.). HDX-MS har flere forskellige fordele i forhold til andre strukturelle biologi tilgange, der er almindeligt anvendt til at undersøge kropsbygning dynamik. Mest bemærkelsesværdigt er der kun behov for små mængder protein. Ved hjælp af den arbejdsgang, der er beskrevet heri, giver en 1 mL prøve på 1 μM protein nok materiale til triplicate HDX-reaktioner, der hver indeholder 5 udvekslingstidspunkter. Desuden er der stort set ingen størrelsesgrænse for det protein, der er af interesse, og proteinkomplekser er lige så modtagelige for HDX-MS-tilgangen. Størrelsesgrænsen er kun begrænset af, i hvilket omfang de peptiske peptider kan løses kromatografisk og i m/z- og ionmobilitetsdimensionerne. For mange proteiner/proteinkomplekser vil HDX-MS således give værdifuld information om proteinproteininteraktionsgrænseflader, ligandbindingssteder, kropsbygningsdynamik og allosteriske netværk. Endelig udføres HDX-reaktionen under blide, nær-indfødte forhold uden behov for stedsspecifik mærkning / teknik af proteinet, hvilket skal bidrage til at sikre, at den endogene aktivitet bevares. Den vigtigste begrænsning af tilgangen (med hensyn til de mekanistiske oplysninger, den giver om det protein af interesse) er, at peptidniveauet HDX-data er af i sagens natur lav rumlig opløsning. Dataene er således tilstrækkelige til at udlede, at der sker en ændring i den sekundære struktur, men de mekanistiske virkninger af den strukturelle forgiftning kræver højere opløsning (f.eks. NMR, kryoEM eller røntgenkrystal) strukturer, beregningsundersøgelser og / eller biokemiske undersøgelser for fuldt ud at fortolke.

For at sikre, at resultaterne reproducerbarheden og pålideligheden er pålidelige, bør der tages hensyn til flere kritiske aspekter af protokollen. For det første er omfanget af deuteriumudveksling under HDX-reaktionen og omfanget af rygudveksling under opstart og analyse stærkt afhængig af pH, tid og temperatur. Procedurerne for forberedelse af buffere, HDX-reaktioner og LC-MS-metoder skal således være så systematiske som muligt for at minimere variationen i disse fysiske parametre på tværs af datasæt. Når det er muligt, skal HDX-reaktioner for biokemiske tilstande, der skal sammenlignes, udføres af den samme forsker samme dag, og LC-MS-dataene for disse prøver skal indsamles i løbet af på hinanden følgende dage med det samme parti opløsningsmiddel. Over tid vil effektiviteten af pepsin fordøjelsen også falde, så det er optimalt for prøver, der vil blive sammenlignet, der skal fordøjes og analyseres inden for et relativt smalt tidsvindue- især hvis pepsinkolonnen bruges til at fordøje mange andre typer prøver. Det er god praksis med jævne mellemrum at kontrollere fordøjelseseffektiviteten af pepsinkolonnen ved hjælp af et standardprotein. For at opnå dette kan der oprettes et dedikeret HDX-behandlingssoftwareprojekt, hvor nyligt fordøjede prøver kan sammenlignes med ældre prøver for at sikre, at det samme sæt målpeptider opdages med lignende intensiteter.

Mens arbejdsgangen præsenteret i denne protokol bør give tilstrækkelige data for mange enzym / protein systemer, der er flere potentielle optimeringspunkter. For det første kan tidsskalaen for HDX-reaktionen ændres for at fange dynamikker, der er hurtigere / langsommere. Mest bemærkelsesværdigt vil mange enzymer indeholde meget dynamiske elementer, der bliver fuldt udvekslet inden for flere sekunder. Hvis disse ekstremt dynamiske elementer er af interesse, metoder til præ-steady tilstand, kontinuerlig udveksling HDX-MS er blevet rapporteret i litteraturen31. For det andet kan LC-metodebetingelserne let ændres for at ændre fordøjelseseffektiviteten (som i sidste ende bestemmer sekvensdækning) og deuteriumretentionen (som i sidste ende bestemmer metodens følsomhed). I betragtning af varigheden og temperaturen af pepsin fordøjelsen, langsommere strømningshastigheder og højere temperatur vil favorisere en mere grundig fordøjelse af proteinet. Proteinkoncentrationen i HDX-analysen kan også øges, hvis signalintensiteten er for lav eller nedsat, hvis pepsin fordøjelsen er for ineffektiv. I betragtning af den acetonitrilegradient, der bruges til at adskille de peptiske peptider på den analytiske C18-kolonne, vil en hurtigere gradient bevare deuteriumetiketten, men på bekostning af den kromatografiske opløsning af de peptiske peptider, der er til stede i den fordøjede reaktionsblanding. For mindre proteiner (~200 aminosyrer), hvor færre peptiske peptider er til stede i fordøjet, kan en hurtigere LC-gradient være lettere at implementere. For større proteiner som HalM2 (~1.000 aminosyrer) er der behov for en længere gradient for at løse den yderligere spektrale kompleksitet, der genereres af det større antal peptider i blandingen. I sidstnævnte scenario kan inddragelsen af en adskillelse af gasfasens mobilitet bidrage til en drastisk forbedring af analysens topkapacitet. Inddragelsen af ionmobilitetsseparationen sker på bekostning af et let reduceret signal til støjforhold. Endelig skal det bemærkes, at MS-dataene for HDX-prøverne ikke behøver at blive indsamlet i MS E-tilstand. MSMS-delen af MS E-arbejdscyklussen (dvs. det høje kollisionsenergisegment, trin 3.3.7.2) er kun påkrævet for referenceprøverne for at definere peptidlisten (protokolafsnit 4). Således bør HDX-prøver analyseres i MS-only-tilstand for at øge signalet: støjforholdet.

Hvis den arbejdsproces, der er beskrevet i denne protokol, fungerer korrekt, skal peptider til fuld udveksling udvise en relativ værdi for optagelse af deuterium på 60%−70%. Hvis det konstateres, at optagelsen af deuterium er væsentligt lavere end dette (for en opløsningsmiddeleksponeret, ubeskyttet peptid), er den mest sandsynlige forklaring, at prøvens pH-værdi ændrer sig under en del af workup/analyse. I dette scenario bør der anvendes en mikrotipelektrode til omhyggeligt at overvåge pH-værdi for HDX-analysen og for den slukkede reaktion aliquot. PH-opløsningsmidlerne i LC-MS bør også kontrolleres. For at minimere forekomsten af dette problem anbefales det kraftigt at forberede og opbevare koncentrerede stamopløsninger af alle buffere og reagenser, der er nødvendige for analysen (som skitseret i protokolafsnit 1).

I de senere år har HDX-MS vist sig som et kraftfuldt analytisk værktøj til at undersøge proteinstrukturel dynamik. Udviklingen af kommercielt tilgængelige LC-MS-systemer designet og optimeret til HDX-eksperimenter (såsom det system, der anvendes i denne undersøgelse og opført i materialerne) kombineret med kraftfulde softwarepakker, har udvidet HDX-MS-tilgangen til mange akademiske og industrielle laboratorier og har omdannet det, der engang var en nicheteknik for 15 år siden, til en mere brugervenlig analytisk platform. På trods af begrænsningerne i rumlig opløsning giver HDX-MS meget kvantitative og reproducerbare målinger på proteinbevægelser og er ideel til at studere kropsbygningsdynamiske enzymer, der er vanskelige at undersøge med andre tilgange. På grund af disse egenskaber udfylder HDX-MS en væsentlig niche i den strukturelle biologi af uordnede og dynamiske proteinsystemer, som har relevans inden for mange grundlæggende områder af biologi og medicin. Som sådan forventes HDX-MS-analyser at forblive et vigtigt redskab i strukturbiologens arsenal i en overskuelig fremtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Canadian Foundation for Innovation og McGill University start-up fonde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		 Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522 (1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883 (2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Tags

Biokemi Hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri biokemi enzymologi biosyntese naturlige produkter peptider
En platform for hydrogendeuteriumudvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) til undersøgelse af peptidbiosyntetiske enzymer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A… More

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter