Summary
Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.
Abstract
Die Wasserstoff-Deuterium-Austauschmassenspektrometrie (HDX-MS) ist eine leistungsfähige Methode zur biophysikalischen Charakterisierung von Enzymkonformationsveränderungen und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen. Unter seinen vielen Vorteilen verbraucht HDX-MS nur geringe Mengen an Material, kann unter nahezu nativen Bedingungen ohne Enzym-/Substratkennzeichnung durchgeführt werden und kann räumlich aufgelöste Informationen über Enzymkonformationsdynamik liefern – auch für große Enzyme und Multiproteinkomplexe. Die Methode wird durch die Verdünnung des enzyms von Interesse in Puffer inD2O vorbereitet initiiert. Dies löst den Austausch von Protium in Peptidbindungsamiden (N-H) mit Deuterium (N-D) aus. An den gewünschten Austauschzeitpunkten werden Reaktions-Aliquots abgeschreckt, das Enzym in Peptide proteolysiert, die Peptide durch ultra-performance liquid chromatography (UPLC) getrennt und die Veränderung der Masse jedes Peptids (aufgrund des Austauschs von Wasserstoff gegen Deuterium) wird von MS aufgezeichnet. Die Menge der Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid hängt stark von der lokalen Wasserstoffbindungsumgebung dieses Peptids ab. Peptide, die in sehr dynamischen Regionen des Enzymaustauschdeuteriums sehr schnell vorhanden sind, während Peptide aus gut geordneten Regionen viel langsamer austauschen. Auf diese Weise berichtet die HDX-Rate über die lokale Enzymkonformationsdynamik. Störungen der Deuteriumaufnahme in Gegenwart verschiedener Liganden können dann verwendet werden, um Ligandenbindungsstellen zu kartieren, allosterische Netzwerke zu identifizieren und die Rolle der Konformationsdynamik in der Enzymfunktion zu verstehen. Hier veranschaulichen wir, wie wir HDX-MS verwendet haben, um die Biosynthese einer Art von Peptid-Naturprodukten namens Lanthipeptide besser zu verstehen. Lanthipeptide sind genetisch kodierte Peptide, die posttranslational durch große, multifunktionale, konformational dynamische Enzyme modifiziert werden, die mit traditionellen strukturbiologischen Ansätzen schwer zu studieren sind. HDX-MS bietet eine ideale und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der mechanistischen Eigenschaften dieser Enzymtypen.
Introduction
Proteine sind strukturell dynamische Moleküle, die verschiedene Konformationen auf Zeitskalen abtasten, die von Bindungsschwingungen im Femtosekundenmaßstab bis hin zu Umlagerungen ganzer Proteindomänen reichen, die über viele Sekunden auftreten können1. Diese Konformationsschwankungen sind oft kritische Aspekte der Enzym-/Proteinfunktion. So sind beispielsweise konforme Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, oft von entscheidender Bedeutung für die Modulation der Enzymfunktion, entweder durch die Organisation aktiver Standortrückstände, die für die Katalyse benötigt werden, die Definition von Substratbindungsstellen in sequenziellen kinetischen Mechanismen, die Abschirmung reaktiver Zwischenprodukte von der Umgebung oder durch Modulation der Enzymfunktion über allosterische Netzwerke. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass die konforme Dynamik während der gesamten Evolution konserviert werden kann und dass Störungen zu konservierten molekularen Bewegungen mit Veränderungen der Substratspezifität und der Entstehung neuer Enzymfunktionenkorreliertwerden können 2,3.
In den letzten Jahren hat sich die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) schnell als eine leistungsstarke Technik entwickelt, um zu untersuchen, wie Proteinkonformationslandschaften auf Störungen wie Ligandenbindung oder Mutagenese4,5,6,7reagieren. In einem typischen HDX-MS-Experiment (Abbildung 1) wird ein inD2O hergestelltes Protein in einen Puffer gegeben, der den Austausch von lösungsmittelaustauschbaren Protonen durch Deuteria auslöst. Die Wechselkursrate der Amid-Feuchtigkeit der Peptidbindungen hängt stark vom pH-Wert, der lokalen Aminosäuresequenz und der lokalen strukturellen Umgebung des Amids8ab. Amide, die mit Wasserstoffbindungswechselwirkungen (wie sie in α-Helices und β-Blättern vorhanden sind) tätig sind, tauschen sich langsamer aus als Amide in unstrukturierten Regionen des Proteins, die Massenlösungsmitteln ausgesetzt sind. Somit spiegelt das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die Struktur des Enzyms wider. Enzyme, die konform dynamisch sind oder bei Ligandenbindung strukturelle Übergänge durchlaufen, würden eine messbare HDX-Antwort liefern.
Die mechanistische Grundlage für den langsamen Wechselkurs eines strukturierten Amids ist in Abbildung 25,8,9dargestellt. Um HDX zu durchlaufen, muss der strukturierte Bereich zunächst eine entfaltete Konformation vorübergehend abtasten, so dass die Lösungsmittelmoleküle, die den HDX-Austausch über einen bestimmten säure-basenchemischen Mechanismus katalysieren, Zugang zum austauschbaren Amid haben. Letztlich bestimmen die relativen Größen des chemischen Wechselkurses (kchem) und die Falt- und Umfaltraten (koffen und kschließen) die im ExperimentgemesseneHDX-Rate 5,8. Aus diesem einfachen kinetischen Modell geht klar hervor, dass das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die zugrunde liegende Konformationsdynamik widerspiegelt (wie definiert durch koffen und kclose). Die meisten HDX-MS-Experimente werden in einem Bottom-up-Workflow durchgeführt, bei dem nach der Austauschreaktion das von Interesse kommende Protein in Peptide verdaut wird und die Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid als Erhöhung der Masse7gemessen wird. Auf diese Weise ermöglicht HDX-MS die Zuordnung von Störungen der Enzym-Konformationsdynamik auf der lokalen räumlichen Skala von Peptiden, sodass der Forscher beurteilen kann, wie die Störung die Dynamik in verschiedenen Regionen des Enzyms von Interesse verändert.
Die Vorteile des HDX-MS-Ansatzes zur Aufklärung der Proteinstrukturdynamik sind zahlreich. Zunächst kann die Methode mit kleinen Mengen an nativem Protein oder auf Proteinkomplexen in Systemen mit quartärer Struktur10durchgeführt werden. Es ist nicht einmal notwendig, dass die im Test verwendete Enzympräparation hochgereinigt wird11,12, solange der Bottom-up-HDX-MS-Workflow eine ausreichende Anzahl von sicher identifizierten Peptiden bietet, die die Proteinsequenz von Interesse abdecken. Darüber hinaus kann HDX-MS Informationen über konforme Dynamiken unter nahezu nativen Bedingungen bereitstellen, ohne dass eine standortspezifische Proteinkennzeichnung erforderlich ist, wie sie in Einzelmolekülfluoreszenzstudien13verwendet würde, und es gibt keine Größenbeschränkung für den Protein- oder Proteinkomplex, die untersucht werden kann (was Ansätze wie Kernspinresonanz [NMR] Spektroskopie schwierig macht)7,14. Schließlich können zeitaufgelöste HDX-MS-Methoden eingesetzt werden, um intrinsisch ungeordnete Proteine zu untersuchen, die mit Röntgenkristallographie15,16,17,18schwer zu untersuchen sind. Die Hauptbeschränkung von HDX-MS ist, dass die Daten von geringer struktureller Auflösung sind. HDX-MS-Daten sind nützlich, um darauf hinzuweisen, wo sich die Konformationsdynamik ändert, und um gekoppelte Konformationsänderungen aufzudecken, aber sie bieten oft nicht viel Einblick in den genauen molekularen Mechanismus, der die beobachtete Veränderung antreibt. Jüngste Fortschritte in der Kombination von Elektronenfang-Dissoziationsmethoden mit Protein-HDX-MS-Daten haben gezeigt, dass Austauschstellen zu einzelnen Aminosäurerückständen19zugeordnet werden können, aber nachfolgende biochemische und strukturelle Studien sind immer noch häufig erforderlich, um Klarheit für Strukturmodelle zu schaffen, die von HDX-MS-Daten übermittelt werden.
Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung eines HDX-MS-Assays vorgestellt20. Die nachstehend vorgestellten Probenvorbereitungsprotokolle sollten allgemein für jedes Protein gelten, das eine gute Löslichkeit in wässrigen Puffern aufweist. Speziellere Probenvorbereitungsmethoden und HDX-MS-Workflows stehen für Proteine zur Verfügung, als in Gegenwart von Waschmitteln oder Phospholipiden21,22,23,24untersucht werden müssen. Instrumentale Einstellungen für die HDX-MS-Datenerfassung werden für ein hochauflösendes Quadrupol-Massenspektrometer beschrieben, das an das Flüssigchromatographiesystem gekoppelt ist. Daten von ähnlicher Komplexität und Auflösung könnten auf einem der handelsüblichen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Systeme (LC-MS) gesammelt werden. Wichtige Aspekte der Datenverarbeitung mit einem kommerziell erhältlichen Softwarepaket werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Wir stellen auch Richtlinien für die Datenerhebung und -analyse vor, die mit den Empfehlungen der breiteren HDX-MS-Community12übereinstimmen. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die dynamischen strukturellen Eigenschaften von HalM2 zu untersuchen, einer Lanthipeptid-Synthetase, die die mehrstufige Reifung eines antimikrobiellen Peptids20katalysiert. Wir veranschaulichen, wie HDX-MS verwendet werden kann, um Substratbindungsstellen und allosterische Eigenschaften aufzudecken, die einer vorherigen Charakterisierung entgangen sind. Mehrere andere Protokolle zum Protein HDX-MS wurden in den letzten Jahren veröffentlicht25,26. Zusammen mit der vorliegenden Arbeit sollten diese früheren Beiträge dem Leser eine gewisse Flexibilität im experimentellen Design bieten.
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Protocol
1. Herstellung von deuterated Reagenzien und Enzymstofflösungen
- Bereiten Sie Reagenzien für die HDX-Reaktionen (einschließlich pufferr, Salze, Substrate, Liganden usw.) als 100-200-fache konzentrierte Stofflösungen in D2O (99,9% Atomfraktion D) vor. Bereiten Sie mindestens 50 ml Pufferlagerlösung vor.
HINWEIS: Für die Charakterisierung von HalM2 wurden folgende Lösungen vorbereitet: 500 mM MgCl2, 100 mM Tris (2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP), 750 mM ATP (in HEPES-Puffer), 800 mM HEPES pD 7,1, 500 m HalA2 und 500 mM AMPPNP. - Einfrieren und lyophilisieren Sie die Stammlösungen auf Trockenheit.
- Lösen Sie sich inD2O auf und wiederholen Sie den Lyophilisierungszyklus mindestens eine zusätzliche Zeit, um so viele der austauschbaren Protonen wie möglich durch Deuteronen zu ersetzen.
- Stellen Sie die pD des deuterated HEPES Pufferbestands auf den gewünschten Wert mit konzentriertem NaOD/DCl ein, wobei die folgende Beziehung zu berücksichtigenist 27:
HINWEIS: Die Amid-HDX-Rate ist stark vom pL der Lösung abhängig (pL = pH oder pD)5. Verschiedene Chargen von Pufferlagerlösungen müssen auf identische Weise vorbereitet, gelagert und verwendet werden, um eine leichte pL-Drift zwischen den Experimenten zu vermeiden. - Berechnen Sie die Menge jedes Reagenzes, das für einen 300-L-HDX-Assay benötigt wird, und speichern Sie sie als Einweg-Aliquots bei -80 °C.
- Bereiten Sie eine konzentrierte Enzymstofflösung (ca. 100 bis 200 M) im protiated Enzymspeicherpuffer mit einem Zentrifugalfilter(Materialtabelle) oder einer gleichwertigen Vorrichtung vor.
HINWEIS: Der genaue Puffer- und Zentrifugalfilter Molekulargewichts-Cutoff hängt vom Protein/Enzym ab. HalM2 wird in 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl und 10% Glycerin gelagert. Zur Herstellung des konzentrierten Enzyms wurden 10 kDa-Filter verwendet. - Aliquot das Enzym in Einzelgebrauchsportionen und speichern Sie bei -80 °C.
HINWEIS: Dies kann ein Haltepunkt sein. Alle in Abschnitt 1 beschriebenen Lagerlösungen können im Vorfeld der HDX-Reaktionen vorbereitet werden. Bei -80 °C gelagert, sind die meisten Enzyme/deuterated Stock-Lösungen für viele Monate stabil.
2. Kalibrierung des HDX-Abschreckvolumens
- Bereiten Sie eine 300-L-HDX-Reaktion inD2O mit den in Abschnitt 1 hergestellten deuterated Reagenzien und konzentrierten Enzymvorräten vor.
- Verwenden Sie eine endgültige Enzymkonzentration von 1 bis 5 m.
- Verwenden Sie eine abschließend euterated HEPES Pufferkonzentration von mindestens 50 x 100 mM.
- Stellen Sie sicher, dass die Konzentrationen anderer Komponenten ausreichen, um die gewünschte Enzymaktivität/-funktion aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie 1 L HDX-Quench-Lösung (100 mM Phosphat, 0,8 Mio. Guanidin-HCl, pH 1,9) vor. Einfrieren und Lagern in sowohl 50 ml Portionen (für langfristige Lagerbestände) als auch in 1 ml Portionen (für Einweg-Aliquots).
HINWEIS: Die genaue Zusammensetzung des Quench-Puffers hängt von dem Enzym ab, das im Proteolyseschritt des Bottom-up-HDX-MS-Workflows verwendet wird (Schritt 3.3.3). Der hier angegebene Quench-Puffer ist kompatibel mit Pepsin, der am häufigsten verwendeten Protease für HDX-MS. Wenn eine andere Protease verwendet wird, wenden Sie sich an den Protease-Lieferanten, um die Pufferkompatibilität sicherzustellen. - Kalibrieren Sie das Volumen des Löschpuffers, der benötigt wird, um den endgültigen pL des abgeschreckten HDX-Reaktionsgemisches auf einen pH-Meter-Messwert von 2,3 einzustellen.
HINWEIS: Der Lösungsmittel-H/D-Wechselkurs der Peptidamid-N-H-Bindung ist ein pH-abhängiges Verfahren, das sowohl einer Säure- als auch einer Basenkatalyse unterliegt. Der Mindestwechselkurs tritt bei einem Wert von pH 2,5 auf (pH-Meterstand = 2,3 für ein 50:50 H2O:D2O-Gemisch). So minimiert ein endgültiger pL-Wert nahe 2,5 den Wasserstoff-Rückaustausch, der während der Bottom-up-LC-MS-Analyse auftritt, wodurch das Deuterium-Etikett in den Peptiden erhalten bleibt.- Mischen Sie 50 l des HDX-Reaktionsgemisches aus Schritt 2,1 mit 50 l Löschpuffer und messen Sie den pL der abgeschreckten Mischung mit einer Mikrospitzenelektrode.
- Erhöhen Sie das Volumen der Quench-Lösung nach Bedarf, um den endgültigen pH-Meterstand auf einen Wert von 2,3 anzupassen.
- Nachdem das entsprechende Abschreckvolumen bestimmt wurde, wiederholen Sie den Abschreckvorgang mehrmals mit frischen 50 L-Aliquots aus der HDX-Reaktion (Schritt 2.1), um sicherzustellen, dass ein konsistentes endliches pL erreicht wird, wenn eine feste Menge an Quenchpuffer hinzukommt.
3. Erstellung von Referenzproben und Optimierung des Bottom-up LC-MS-Workflows
- Bereiten Sie undeuterated Referenzproben für das Protein von Interesse in Triplicate in 0,5 ml-Röhren vor. Stellen Sie sicher, dass die Bedingungen des Endreaktionsgemisches mit denen identisch sind, die in den authentischen HDX-Reaktionen (Schritt 2.1) verwendet werden, mit der Ausnahme, dass die Reaktionen in H2O mit Reagenzien-Stocklösungen hergestellt werden, die ebenfalls in H2O hergestellt sind.
- Quench die Proben wie in Schritt 2.3 durch Hinzufügen des entsprechenden Volumens des Quench-Puffers, um den endgültigen pH-Wert auf 2,5 einzustellen. Blitz einfrieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff und lagern Sie bei -80 °C, bis sie zur Analyse bereit sind.
- Analysieren Sie die protiated Enzymreferenzproben mit einem Bottom-up-LC-MS-Workflow.
HINWEIS: Vor der Ausführung dieser Schritte sollte das für die Datenerfassung zu verwendende LC-MS-System ordnungsgemäß kalibriert und einsatzbereit sein. Das Timing und die Temperatur aller Schritte im Bottom-up-LC-MS-Workflow müssen streng kontrolliert werden, um Unterschiede im Rückaustausch zwischen den Proben zu minimieren. Mit der in diesem Protokoll verwendeten MS-Instrumentierung (Materialtabelle Und Unterstützende Informationen), können die meisten Schritte über die Instrumentensoftware gesteuert werden. Um die Sammlung präziser Replikationen sicherzustellen, wird empfohlen, so viele Schritte im Workflow wie möglich zu automatisieren.- Entfernen Sie eine einzelne Enzymreferenzprobe (zubereitet wie in Schritt 3.2) aus dem Gefrierschrank und tauen Sie bei 37 °C für 1 min in einem Wasserbad auf.
- In genau 2 min nach dem Entfernen der Probe aus dem Gefrierschrank und dem Auftauen einen 40-L-Teil der abgeschreckten Referenzprobe in eine ultra-performance liquid chromeatography (UPLC) Kolonne (2,1 x 30 mm, 300 , 5 m) mit einer stationären Phase, die mit Pepsin (einer säurestabilen Protease) funktionalisiert ist.
- Verdauen Sie die Probe mit einer Durchflussrate von 100 l/min für 3 min bei 15 °C mit 0,1 % Ameisensäure inH2O (pH = 2,5) als Lösungsmittel.
- Sammeln Sie die Peptide, während sie von der Pepsinsäule auf eine C18-Falle-Säule bei 0,4 °C gehalten werden, um den Rückaustausch zu minimieren.
- Übergeben Sie die entsalzten Pepttide von der Trapsäule auf eine C18-Analysesäule (1 mm x 100 mm, 1,7 m, 130 °C), die bei 0,4 °C zur Trennung der Peptide gehalten und betrieben wird.
HINWEIS: Die Schritte 3.3.3-3.3.5 können von bestimmten LC-MS-Systemen automatisiert werden, die für die HDX-MS-Datenerfassung verwendet werden. Alternativ können diese Schritte unabhängig durchgeführt werden, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Timing und die Temperatur jedes Schritts sorgfältig kontrolliert werden müssen, um einen konstant niedrigen Rückenaustausch zu erreichen. - Elute die C18-Säule mit einem Acetonitril/Wasser/0,1% Ameisensäure-Lösungsmittelsystem. Optimieren Sie den LC-Gradienten für das Protein von Interesse, um die Trennung von zu maximieren und das Deuterium-Label in den Peptiden zu erhalten.
HINWEIS: Die Daten zur Gradientenelution finden Sie in den Unterstützenden Informationen. - Unterziehen Sie den Magenverdauungsindex der Elektrospray-Ionisation (ESI) Massenspektrometrie.
HINWEIS: Die in den Unterstützenden Informationen angegebenen Quellbedingungen bieten eine ausreichende Ionisierung für die meisten Peptide.- Nach der Ionisiertim MS-Instrument führen Sie eine Gasphasen-Ionen-Mobilitätstrennung mit Stickstoff als Puffergas durch, um die Spitzenkapazität der Methode zu erhöhen.
- Nach der Ionenmobilitätstrennung unterziehen Sie die Peptidvorläuferionen einem MSE-Workflow mit abwechselnden Zyklen mit geringer Kollisionsenergie (4 V) und hoher Kollisionsenergie (21-40 V).
HINWEIS: Die abwechselnden Systeme der niedrigen und hohen Kollisionsenergie ermöglichen die gleichzeitige Erfassung von MS-Daten (niedrige Kollisionsenergie) mit MSMS-Daten (hohe Kollisionsenergie). Dies wiederum ermöglicht die zeitliche Korrelation von Vorläuferionen mit ihren jeweiligen Fragmentionen. Diese Korrelation ist für die in Abschnitt 4 beschriebene sichere Peptididentifikation von entscheidender Bedeutung. - Erkennen Sie den Peptidvorläufer und die Fragmentionen mit einem Massenanalysator mit einer Auflösungskraft von mindestens 20.000.
- Erwerben Sie gleichzeitig mit der Datenerfassung MS-Daten für einen [Glu-1]-Fibrinopeptid B (GluFib) externen Standard.
HINWEIS: Der in Schritt 3.3.7 beschriebene MS-Workflow wird als MSE-Protokoll bezeichnet. Vollständige Instrumentasteneinstellungen für ein MSE-Protokoll, das für UNTEN-up-HDX-MS geeignet ist, finden Sie in der Support Information.
- Bewerten Sie die Qualität der LC-MS-Daten.
ANMERKUNG: Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls und der in den Unterstützenden Informationenangegebenen Instrumentaleinstellungen sollten die Referenzproben ein Gesamtionenchromatogramm mit einer maximalen Signalintensität von ca. 1 x 108erzeugen. Es sollten viele Peptide zwischen 3 und 9 min elutieren (Abbildung 3A-C). - Injizieren Sie 40 l Leerproben (0,1 % Ameisensäure in Wasser), um die Pepsin- und analytischen C18-Säulen zu reinigen.
ANMERKUNG: Im Allgemeinen sollten 2 x 3 Rohlinge ausreichen. - Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1-3.3.9 für jede der dreifachen Referenzproteinproben.
4. Verarbeitung der Referenzdaten und Definition einer Peptidliste
- Analysieren Sie die rohen MSE-Daten (Schritt 3.3.7) mit der Proteomik-Software (Tabelle der Materialien). Navigieren Sie mit der Proteomics-Software zu Bibliotheken | Protein Sequenz Datenbanken, um die Protein-Datenbank zu definieren, indem Sie die Aminosäuresequenz des Proteins von Interesse importieren.
HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts besteht darin, die Referenz-MS-Daten nach Peptiden zu durchsuchen, die aus dem Protein von Interesse abgeleitet wurden, und die MSMS-Daten (gleichzeitig mit den MS-Daten erfasst) zu verwenden, um alle vermeintlichen Peptid-Identifikationen zu validieren. - Geben Sie der Proteinsequenz einen Namen. Importieren Sie die Proteinsequenz (im FASTA-Format). Die Software wird eine in silico Verdauung des Datenbankproteins durchführen, um eine Liste von Peptiden zu generieren, die verwendet werden, um die LC-MS-Daten zu durchsuchen.
- Definieren Sie die Verarbeitungsparameter (unter dem Menü Bibliothek). Wählen Sie Electrospray MSE als Datenerfassungstyp aus. Geben Sie im Feld Sperrmasse für Ladung 2 785.8426 für das m/z für das 2+ Ion von [Glu-1]-Fibrinopeptid B (GluFib) ein und klicken Sie auf Fertig.
- Definieren Sie die Workflow-Parameter (unter dem Menü Bibliothek).
- Wählen Sie Electrospray MSE für den Suchtyp. Unter dem Workflow-| Datenbanksuchabfrageüberschrift, wählen Sie das Datenbankprotein aus, das in Schritt 4.2 im Feld Datenbank erstellt wurde.
- Ändern Sie das primäre Digest-Reagenz in unspezifisch, und löschen Sie das Feld "Fixed Modifier Reagent", indem Sie die Strg-Taste gedrückt halten, während Sie auf Carbamidomethyl Cklicken.
- Geben Sie das Ausgabeverzeichnis an, indem Sie zu Optionen navigieren, die | Automatisierungseinrichtung | Identität E. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Apex 3D und Peptide 3D Output und Ion Accounting Output und geben Sie das gewünschte Verzeichnis an.
- Verarbeiten Sie die Referenzstichprobendaten.
- Erstellen Sie auf der linken Werkzeugleiste des Proteomics-Plattform-Arbeitsbereichs eine neue Platte, indem Sie mit der rechten Maustaste auf Microtiter Plateklicken. Markieren Sie drei Brunnen in der Mikrotiterplatte (eine für jede in Abschnitt 3 entnommene Referenzprobe). Klicken Sie mit der linken Maustaste in einen Brunnen, halten und ziehen Sie ihn auf drei Bohrungen.
- Rechtsklick und wählen Sie Rohdaten hinzufügenaus. Navigieren Sie in dem angezeigten Fenster zu dem Verzeichnis, das die drei Referenzdateien aus Abschnitt 3 enthält, und wählen Sie sie gleichzeitig aus.
- Klicken Sie auf weiter und wählen Sie die in Schritt 4.3 definierten Verarbeitungsparameter aus. Klicken Sie auf weiter und wählen Sie die in Schritt 4.4 definierten Workflowparameter aus. Klicken Sie dann auf Fertigstellen.
- Sobald die Rohdaten, Verarbeitungsparameter und Workflowparameter jedem Brunnen auf der Platte zugewiesen wurden, erscheinen die Bohrungen blau. Wählen Sie die Brunnen, Rechtsklick und wählen Sie Prozess neuesten Rohdaten. Klicken Sie auf die rechte untere Ecke des Fensters, um die Verarbeitung der Daten nachzuverfolgen. Sobald die Meldung Kein auszuführender Auftrag angezeigt wird, ist die Verarbeitung vollständig abgeschlossen.
- Nach Abschluss der Datenverarbeitung werden die Brunnen in der Platte grün. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Brunnen und wählen Sie Workflow-Ergebnisse anzeigen. Für jede Referenzdatendatei wird ein separates Fenster geöffnet.
- Überprüfen Sie die Daten, um sicherzustellen, dass die Mehrheit der MS-Signale in den Referenzstichprobendaten erfolgreich Peptiden zugeordnet wurden, die aus der in-silico-Verdauung des von Interesse sindden Proteins vorhergesagt wurden. Abgestimmte Peptide werden im Ausgabespektrum blau gefärbt (Abbildung 4). Doppelklicken Sie auf den OK-Filter, und überprüfen Sie, ob die Prozentuale Abdeckung größer als 99 % ist.
HINWEIS: Bei der Verarbeitung wird die Datenausgabe automatisch mit der Dateierweiterung(raw_data_file_name_IA_final_peptide) in dem in Schritt 4.5 angegebenen Verzeichnis gespeichert. - Importieren Sie die Proteomics-Softwareausgabe in die HDX-Verarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) für zusätzliche Schwellenwerte.
- Klicken Sie in der linken Ecke des HDX-Verarbeitungssoftwarefensters auf Daten. Klicken Sie auf PLGS-Ergebnisse importieren und auf das Add-Symbol. Wählen Sie die verarbeiteten Datendateien aus Schritt 4.9 aus, indem Sie zum entsprechenden Verzeichnis navigieren.
- Klicken Sie auf Weiter und geben Sie die folgenden Parameter an: minimale aufeinander folgende Ionen ≥ 2, Massenfehler = 5 ppm und Dateischwellenwert = 3. Klicken Sie auf Fertigstellen.
- Sobald Sie mit den Schwellenwertparametern zufrieden sind, speichern Sie das HDX-Projekt. Alle HDX-Daten werden zur Analyse und Anzeige in dieses Projekt importiert.
HINWEIS: Die im nächsten Abschnitt beschriebenen Deuterium-Austauschbeispiele müssen mit einem identischen LC-MS-Workflow verarbeitet werden. Bevor Sie mit HDX-Assays (Abschnitt 5) fortfahren, stellen Sie daher sicher, dass die Probenvorbereitung (Abschnitt 2), der Bottom-up-LC-MS-Workflow (Abschnitt 3) und die Datenverarbeitungsworkflows (Abschnitt 4) die gewünschte Reproduzierbarkeit und Sequenzabdeckung des Zielproteins bieten. Wenn einer dieser Prozesse geändert werden muss, um die Abdeckung zu verbessern, wird empfohlen, zu Schritt 2.1 zurückzukehren, neue Referenzproben in Dreifacharbeit vorzubereiten und Abschnitte 2-4 (bei gleichzeitiger Anpassung des Protokolls) zu wiederholen, um sicherzustellen, dass jedes Peptid reproduzierbar erzeugt und erkannt werden kann.
5. Durchführung von HDX-Reaktionen
- Bereiten Sie den Arbeitsbereich auf HDX-Reaktionen vor.
- Vor-aliquot-Quench-Puffer in ordnungsgemäß beschrifteten 0,5 ml-Röhren. Bereiten Sie eine andere Röhre für jeden Zeitpunkt, jede Replikation und jeden zu analysierenden biochemischen Zustand vor. Verwenden Sie das entsprechende Volumen des Löschpuffers aus Schritt 2.2, der erforderlich ist, um den endgültigen pH-Meterstandeines eines 50-L-Anteils der HDX-Reaktion auf einen Wert von 2,3 einzustellen.
- Zentrifugieren Sie kurz die 0,5 ml-Wannen, um den gesamten Löschpuffer auf den Boden des Rohres zu übertragen. Legen Sie die Rohre auf Eis.
- Füllen Sie einen kleinen Dewar mit flüssigem Stickstoff und halten Sie neben arbeitsplatz.
- Bereiten Sie die HDX-Reaktionen vor. Stellen Sie sicher, dass ein ausreichendes Reaktionsvolumen vorhanden ist, um die gewünschte Anzahl von Austauschzeitpunkten zu sammeln (ein Aliquot von 50 L für jeden gewünschten Zeitpunkt). Sammeln Sie mindestens 4 bis 5 Zeitpunkte über 3 x 4 Größenordnungen in der Zeitskala (z. B. bieten Löschzeiten von 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min] und 14.400 s [4 h] eine angemessene Abdeckung der Austauschdynamik für die meisten Enzyme).
- Alle deuterated Komponenten (minus Enzym) aus Schritt 1.1 in D2O vormischen.
- Für jeden zu untersuchenden biochemischen Zustand (freies Enzym, Enzym + Liganden, Enzym + Inhibitor usw.) bereiten Sie HDX-Reaktionen zumindest in Dreifache vor.
- Inkubieren Sie die Reaktionsgemische in einem temperaturgeregelten Wasserbad bei 25 °C für 10 min vor Zugabe des Enzyms.
HINWEIS: Das Enzym sollte als konzentrierte Stofflösung (ca. 100 bis 200 M, Schritt 1,6) hergestellt werden, um die Zugabe von Protium in den HDX-Assay zu minimieren. - Wenn Sie das Enzym zu einer Endkonzentration von 1 bis 5 M hinzufügen, starten Sie den Timer. Mischen Sie die Lösung sorgfältig und schnell mit einer 200-L-Pipette, um sicherzustellen, dass das Enzym gleichmäßig in der Probe verteilt ist.
- An den gewünschten Austauschzeitpunkten 50 L-Aliquots aus der HDX-Reaktion entfernen und schnell und gleichmäßig mit dem voralizitierten, eiskalten Löschpuffer in einem 0,5 ml-Rohr mischen.
HINWEIS: Die Mischvolumina und das Mischverfahren müssen so präzise und reproduzierbar wie möglich sein, um sicherzustellen, dass die gewünschte Endabschreckung pL von 2,3 in allen Proben schnell erreicht wird. Die Eiseskälte des Abschreckpuffers wird helfen, den Rückaustausch nach Denaturierung des Enzyms zu minimieren. - Unmittelbar nach dem Löschen der HDX-Probe, kappen Sie die Röhre und Blitz einfrieren in flüssigem Stickstoff.
- Fahren Sie mit dem Sammeln von Zeitpunkten fort, bis alle Tests abgeschlossen sind, und übertragen Sie die Proben zur Lagerung in den -80 °C-Gefrierschrank.
HINWEIS: Dies kann ein Haltepunkt sein. Nach dem Sammeln aller HDX-Zeitpunkte können die Proben bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die LC-MS-Analyse bereit sind. Idealerweise sollten für alle biochemischen Zustände am selben Tag dreifache HDX-Reaktionen durchgeführt werden. Mindestens sollten alle replizierten HDX-Reaktionen für einen bestimmten biochemischen Zustand parallel am selben Tag ausgeführt werden.
- Nachdem Sie alle abgeschreckten HDX-Zeitpunkte gesammelt haben, unterwerfen Sie die Proben dem optimierten Bottom-up-LC-MS-Workflow, der wie in Schritt 3.3 beschrieben entwickelt wurde. Injizieren Sie HDX-Proben in einer randomisierten Reihenfolge mit einer angemessenen Anzahl von Rohlingen zwischen den Proben, um sicherzustellen, dass die Übertragung von Peptid minimal ist.
HINWEIS: HDX-Daten müssen nicht im MSE-Modus erfasst werden. Daher sollte das Segment der hohen Kollisionsenergie (Schritt 3.3.7.2) aus dem MS-Betriebszyklus entfernt werden. Dies sollte die einzige Änderung am Workflow sein, die in Schritt 3.3 beschrieben wird. - Bewerten Sie die Qualität der HDX-Daten, während sie gesammelt werden.
- Stellen Sie sicher, dass chromatographische Spitzen im gesamten Ionenchromatogramm der nicht euteierten Referenzproben zur gleichen Retentionszeit in den deuterated Samples erscheinen (wie in Abbildung 3D-F).
- Stellen Sie sicher, dass Massenspektren, die über bestimmte Zeitintervalle aus Referenz- und deuterated-Proben summiert werden, Hinweise auf eine Deuteration aufweisen (d. h. eine Verschiebung der Isotopenhülle einzelner Peptide auf höhere m/z-Werte in den deuterated Samples [Abbildung 6]).
6. Verarbeitung von HDX-Daten
- Importieren Sie die HDX-Daten in das in Schritt 4.11 erstellte HDX-Projekt, indem Sie auf Data | MS-Dateien in der oberen Werkzeugleiste.
- Klicken Sie bei Bedarf auf Neue Zustands- und Neue Exposition, um die biochemischen Zustände (z. B. freies Enzym, Enzym + Liganden usw.) bzw. Deuterium-Expositionszeiten zu definieren, die für die Analyse relevant sind.
- Klicken Sie auf Neu Roh, um die zu analysierenden HDX-Datendateien auszuwählen. Weisen Sie jeder importierten Rohdatendatei die entsprechenden Austauschzeiten und den biochemischen Zustand zu.
HINWEIS: Die Daten können importiert und in Batches oder auf einmal verarbeitet werden. Durch das Hinzufügen von Daten zum Projekt werden keine Analysen rückgängig gemacht, die zuvor in diesem Projekt durchgeführt wurden.
- Nachdem die Datendateien hinzugefügt wurden, klicken Sie auf Fertig stellen, um mit der Datenverarbeitung zu beginnen. Nach einer kurzen Verzögerung fragt die Software, ob der Benutzer die Daten speichern möchte, bevor er fortfährt. Klicken Sie auf ja.
HINWEIS: Die anfängliche Verarbeitung kann bis zu mehreren Stunden dauern, je nachdem, wie viele Proben analysiert werden, wie viele Peptide in der endgültigen Peptidliste (Schritt 4.10), die Größe des chromatographischen Fensters und die Häufigkeit der spektralen Erfassung sind. - Ändern Sie bei Bedarf die Verarbeitungsparameter im Menü Konfiguration, um die Ion-Suchparameter zu ändern. Stellen Sie sicher, dass Sie dieselben Ionensuchparameter für alle Daten in einem bestimmten Projekt verwenden.
7. Analyse und Visualisierung der HDX-Daten
HINWEIS: Sobald die erstmalige Verarbeitung der Rohdaten abgeschlossen ist (Schritt 6.2), wird die HDX-Verarbeitungssoftware Peptide aus der Peptidliste (generiert in Schritt 4.10) in jeder der analysierten Rohdatendateien gefunden haben. Sobald sich die Isotopenverteilung für ein Peptid in der Liste in einer Rohdatendatei befindet, stellt die HDX-Verarbeitungssoftware jedes Isotop mit einem "Stick" dar (wie in Abbildung 6C-E). Die relativen Intensitäten der Stäbe für ein bestimmtes Peptid werden dann verwendet, um die Deuteriumaufnahme relativ zu den Referenzspektren zu berechnen. Während die HDX-Verarbeitungssoftware eine bewundernswerte Aufgabe der korrekten Zuweisung von "Sticks" zu den meisten Peptiden leistet, ist weiterhin eine signifikante manuelle Kuration der Deuterium-Aufnahmewerte erforderlich.
- Analyse der Aufnahmewerte von Peptiddeuterium
- Wählen Sie das erste Peptid in der Peptidliste aus, und öffnen Sie das gestapelte Spektraldiagramm im Menü Ansichten. Scrollen Sie im gestapelten Spektrendiagrammfenster nach oben und unten, um die Massenspektren für das ausgewählte Peptid als Funktion der Deuterium-Austauschzeit zu sehen (Abbildung 7D,E).
- Weisen Sie Sticks nach Bedarf mit Mausklicks zu und dezuweisen, um sicherzustellen, dass die richtige Isotopenverteilung in den Daten gefunden wurde und dass jeder Isotopenspitzen zugewiesen wurde (zugewiesene Sticks werden blau angezeigt). Wenn Sie auf eines der Spektren im gestapelten Spektraldiagramm klicken (Abbildung 7D,E), kann der Benutzer Sticks im aktiven Datenbetrachterfenster zuweisen/entordnen ( Abbildung7C).
- Überprüfen Sie die Stickzuweisungen für jeden Ladezustand, indem Sie den Ladezustand oben im gestapelten Spektralplotfenster umschalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1.1-7.1.3 für jeden biochemischen Zustand von Interesse. Der biochemische Zustand kann auch oben im gestapelten Spektraldiagrammfenster umgeschaltet werden. Stellen Sie für die genauesten Deuteriumaufnahmedifferenzmessungen sicher, dass Stöcke für jeden biochemischen Zustand für den gleichen Ladungssatz zugewiesen werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1.1-7.1.4 für jedes Peptid in der Peptidliste.
- Überprüfen Sie die Standardabweichung der Peptid-Deuterium-Aufnahmewerte mithilfe der Abdeckungskarte.
- Greifen Sie über das Menü Ansichten auf die Abdeckungskarte zu, die jedes Peptid in der Peptidliste anzeigt, die entlang der Aminosäuresequenz des von Interesse sindden Proteins abgebildet ist (Abbildung 8C). Färben Sie die Peptide nach relativer Standardabweichung (Einheiten von Da).
- Suchen Sie die Karte visuell nach Ausreißerpeptiden mit hoher relativer Standardabweichung. Klicken Sie auf die Ausreißerpeptide in der Coverage-Karte, um die gestapelten Spektraldiagramme (Abbildung 8B) und das Datenbetrachterfenster (Abbildung 8A) mit dem Zielpeptid aufzufüllen.
- Überprüfen Sie mit dem gestapelten Spektraldiagramm sorgfältig, ob alle Ladezustände und alle Zeitpunkte des Ausreißerpeptids entsprechend zugeordnete Sticks haben.
HINWEIS: Am häufigsten weisen Peptide mit großen Standardabweichungen (>0,3 Da) Isotopspitzen auf, die von der Software nicht angemessen zugeordnet wurden (siehe Abbildung 8B). Durch das Zuweisen fehlender Sticks kann in der Regel die relative Standardabweichung eines Peptids auf <0,3 Da reduziert werden. - Ausblenden des Peptids aus der Liste, wenn die relative Standardabweichung nicht auf weniger als 0,3 Da reduziert werden kann.
- Exportieren Sie HDX-Differenzdaten zwischen zwei biochemischen Zuständen für die Kartierung auf ein strukturelles Modell des Proteins von Interesse.
- Zeigen Sie die Interessendifferenz in der Abdeckungskarte an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Abdeckungskarte, um die Differenzdaten in eine .csv Datei zu exportieren. Exportieren der Zustandsdaten (im Format .csv), indem Sie zu Data | Exportieren von Statusdaten in der Hauptsymbolleiste.
HINWEIS: Eine angemessene Formatierung der Differenzdaten und Zustandsdatendateien finden Sie in der Unterstützungsinformation. - Importieren Sie die Differenzdaten, die Zustandsdaten und die pdb-Datei des von Interesse sindden Proteins in Deuteros28. Wählen Sie das 99%-Konfidenzintervall aus, wählen Sie Summe aktivierenaus, und verarbeiten Sie die Daten.
HINWEIS: MATLAB muss auf dem PC installiert sein, um Deuteros ausführen zu können. Deuteros verwendet die Replikationsmessungen im Datensatz, um die Standardabweichung der Aufnahmedaten für jedes Peptid zu berechnen. Diese Standardabweichung wird verwendet, um das Konfidenzintervall für einen signifikanten Austausch zu definieren, der auf den Diagrammen angezeigt wird. - Wählen Sie unter PyMOL-Optionen exportaufnahme- | Exportieren, um ein Pymol-Skript zu generieren, um Regionen mit signifikanten Austauschunterschieden auf die pdb-Struktur des Proteins von Interesse mit PyMOL-Software abzubilden.
ANMERKUNG: Bei Verwendung des in diesem Protokoll beschriebenen Workflows beträgt das 99 %-Konfidenzintervall für signifikante Deuteriumaufnahmedifferenz für ein bestimmtes Peptid zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Regel 0,3 x 0,5 Da. Das 99%-Konfidenzintervall für die Differenz, die über alle Wechselkurszeitpunkte summiert wird, beträgt in der Regel 0,7 bis 1,0 Da.
- Zeigen Sie die Interessendifferenz in der Abdeckungskarte an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Abdeckungskarte, um die Differenzdaten in eine .csv Datei zu exportieren. Exportieren der Zustandsdaten (im Format .csv), indem Sie zu Data | Exportieren von Statusdaten in der Hauptsymbolleiste.
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Representative Results
Es ist notwendig, die Qualität der proteolytischen Verdauung und die Reproduzierbarkeit des Workflows für jeden Satz von Probeninjektionen zu bewerten. Daher ist es vor der Durchführung von HDX-MS-Assays wichtig, wirksame Bedingungen für die Proteolyse des Proteins von Interesse, für die Trennung von Peptiden mittels Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie und Gasphasenionenmobilität sowie für den Nachweis von Peptiden mit MS zu schaffen. Zu diesem Zweck sollten zunächst die Referenzproben für das Protein von Interesse (gesammelt in Abwesenheit von Deuterium) untersucht werden (Abschnitt 3). Die chromatographischen Daten in Abbildung 3A-C zeigen die gesamten Ionenchromatogramme (TICs) für drei Referenzproben der HalM2-Lanthipeptid-Synthetase. Das TIC ist die zeitabhängige Änderung der Summe aller Ionenzählungen bei allen m/z-Werten, die im Massenspektralscan enthalten sind. Nähere Ansichten der TICs zwischen 3 und 8 min sind in Abbildung 3D-Fdargestellt. Die in Abbildung 3G-I dargestellten Massenspektren stellen eine Summe aller Massenspektren über ein kleines Zeitintervall (von 5,0 bis 5,1 min) jedes TIC dar. Besondere Aufmerksamkeit ist den folgenden Merkmalen in Abbildung 3zu widmen.
Erstens stellt der große Gipfel in der Nähe von 9,3 min am Ende des Gradienten unvollständig verdaute (und damit große und hydrophobere) Fragmente von HalM2 dar (Abbildung 3A-C). Die Verdauung könnte effizienter gemacht werden, indem die HalM2-Konzentration reduziert wird, aber dies wird die Peptidsignalintensität und das Signal-Rausch-Verhältnis reduzieren. Die Verdauung könnte auch effizienter gestaltet werden, indem die Kontaktzeit (ab 3 min, Protokollschritt 3.3.3) mit der Pepsinsäule erhöht wird. Eine erhöhte Kontaktzeit führt jedoch zu mehr Rückaustausch. Letztlich müssen diese Parameter für das Protein von Interesse ausbalanciert werden, um die gewünschte Sequenzabdeckung, Signalintensität und Deuteriumretention zu gewährleisten. Zweitens sollten Form und Intensität der TIC-Profile ähnlich sein (wie in Abbildung 3D-F). Dies deutet darauf hin, dass die proteolytische Verdauung von HalM2 reproduzierbar ist und in allen drei Referenzproben von ähnlicher Effizienz ist. Die Erwartung ist, dass eine ähnliche Verdauung einer Deuterium-ausgetauschten Probe den gleichen Satz von Peptiden mit ähnlichen Retentionszeiten produzieren wird. Drittens sollten die Massenspektren über ein bestimmtes Zeitintervall ebenfalls ähnlich sein(Abbildung 3G-I). Ein schneller visueller Vergleich der summierten Massenspektren über das Zeitintervall von 5,0 bis 5,1 min der chromatographischen Trennung zeigt, dass die Massenspektralsignale in jeder Probe in der Tat sehr ähnlich sind, was die Zuversicht bietet, dass in jeder Probe ähnliche Peptide vorhanden sind und zu ähnlichen Zeiten aus der C18-Säule eluieren. Eine ähnliche schnelle visuelle Inspektion sollte über andere Zeitintervalle im Chromatogramm durchgeführt werden.
Nach der visuellen Überprüfung der Ähnlichkeit in den LC-MS-Daten der Referenzproben wird die Proteomik-Software verwendet, um die MS-Daten nach Peptiden zu durchsuchen, die aus der Aminosäuresequenz des von Interesse sindden Proteins abgeleitet wurden. Nach der Definition der Proteinsequenzdatenbank (der Aminosäuresequenz des von Interesse sindproteins), der Verarbeitung und der Workflow-Parameter, wie in den Protokollschritten 4.2-4.4 beschrieben, wird jede einzelne Referenzprobe verarbeitet, um Peptide zu erkennen, die mit vorhergesagten Peptiden übereinstimmen, die aus dem Protein von Interesse abgeleitet sind. Ein Beispiel für die Proteomik-Softwareausgabe für ein nicht euterated HalM2-Referenzbeispiel ist in Abbildung 4dargestellt. Besondere Aufmerksamkeit sollte den folgenden Merkmalen gewidmet werden. Erstens wird jedes MS-Signal, das mit einem bestimmten Peptid innerhalb des Voninteressesproteins gemäß den in den Verarbeitungs- und Workflowparametern definierten Werten abgeglichen wird, im unteren Spektrum blau gefärbt. Wenn eine Referenzstichprobe "erfolgreich" verarbeitet wird, erscheinen die meisten Signale blau (wie bei den Daten in Abbildung 4). Stellen Sie außerdem im oberen linken Bereich sicher, dass der "OK-Filter" auf das grüne Häkchen umgeschaltet wird. Wenn dies geschehen ist, spiegeln die Statistiken in der oberen rechten Leiste (blau hervorgehoben in Abbildung 4) nur die Peptide wider, die hohe Konfidenzwerte ergeben. Diese Peptide weisen eine geringe ppm-Massengenauigkeit, mehrere Fragmentionen und eine gute Korrelation zwischen Fragment- und Elternionenretentionszeiten auf und gelten als sichere Identifikationen. Für die gezeigte HalM2-Referenzprobe wurden 1.421 Peptide mit hohen Werten nachgewiesen, die 99,6 % der HalM2-Sequenz abdeckten. Nahezu 100 % Sequenzabdeckung sollte für die meisten Proteine erreichbar sein, die den im Protokollabschnitt 3 beschriebenen BOTTOM-up-LC-MS-Workflow verwenden. Darüber hinaus werden zusätzliche nützliche Statistiken für jedes Peptid im oberen rechten Bereich tabellarisch dargestellt, einschließlich des Massenfehlers, der Vorstufenzeit, der Anzahl der Fragmente (Produktionen), der vollständigen Liste der Fragmentionen nach Namen und der Driftzeit der Ionenmobilität. Diese Informationen sind nützlich für die Interpretation von Ergebnissen, die sich immer auf die am sich ersten identifizierten Peptide konzentrieren sollten.
Die endgültige Peptidliste sollte durch zusätzliche Schwellenwerte in der HDX-Verarbeitungssoftware bestimmt werden. Nach der Analyse der Referenzdaten zur Generierung der Peptidliste (Protokollabschnitt 4) sollte die Ausgabe für zusätzliche Schwellenwerte in die HDX-Verarbeitungssoftware importiert werden. Die Ausgabedateien werden in einem Verzeichnis gemäß Protokollschritt 4.5 mit der Dateierweiterung "..._IA_final_peptide.csv" gespeichert. Beim Hochladen der Ausgabe in die HDX-Verarbeitungssoftware wird die vollständige Liste der Peptide im Bedienfeld "Peptidvorschau" (Abbildung 5) angezeigt, und die Anzahl der Peptide, die Sequenzabdeckung und die Redundanz werden in der unteren rechten Ecke des Fensters angezeigt. Diese Werte ändern sich in Echtzeit, wenn zusätzliche Schwellenwerte angewendet werden. Nachdem Sie auf weitergeklickt haben, können schwellenwertweise Werte in den angegebenen Feldern festgelegt werden. Die kritischsten Filter sind der "Dateischwellenwert", bei dem alle Peptide in jeder der drei Referenzbeispiele lokalisiert werden müssen, der "maximale MH+-Fehler (ppm)", der auf einen Wert <10 ppm festgelegt werden sollte, und "minimale aufeinander folgende Produkte", bei denen das Peptid während der MSMS-Phase (d. h. hohe Kollisionsenergie) des MSE-Workflows (Protokollschritt 3.3.7.2) mindestens zwei aufeinander folgende Fragmentionen erzeugt.
Die bedeutendste technische Einschränkung des HDX-MS-Assays ist der Rückaustausch von Deuterium gegen Protium, der auftritt, sobald deuteriumsgetorgetierte Proben gelöscht werden (mit protited buffer). Der Rückaustausch wird während der Protease-Verdauung und LC-MS-Teile des Workflows fortgesetzt. Der Rückaustausch ist unvermeidbar, aber wenn der pH-Wert, die Temperatur und das Timing aller Schritte nach dem Ablöschen sorgfältig kontrolliert werden, wie im Protokoll beschrieben, können 60 % bis 70 % des Deuterium-Etiketts beibehalten werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, in den frühen Stadien der Assay-Entwicklung zu überprüfen, dass die meisten Peptide Deuterium behalten. Dies kann schnell erreicht werden, indem die Rohdaten einer deuterated Probe mit denen einer Referenzstichprobe verglichen werden. Wie bereits getan, um die Reproduzierbarkeit der Referenzproben zu gewährleisten (Abbildung 3), vergleichen Sie die TICs der deuterium-ausgetauschten und nicht euteierten Referenzproben, um sicherzustellen, dass die Formen der Profile einander ähneln. Summieren Sie außerdem die Massenspektren über das gleiche chromatographische Zeitintervall in beiden Proben. Die meisten Peptide in der ausgetauschten Deuteriumprobe sollten offensichtliche Verschiebungen in ihrer Isotopenverteilung in Richtung höherer m/z-Werte aufweisen (wie in Abbildung 6). Diese Daten deuten darauf hin, dass ein erheblicher Bruchteil des Deuterium-Etiketts im Laufe der Säureabschreckung, der Pepsinverdauung und der LC-MS-Datenerfassung gepflegt wird.
Nachdem Überprüft wurde, ob der Workflow eine ausreichende Deuteriumaufbewahrung bietet, muss die Deuteriumaufnahme quantifiziert werden. So werden die Rohdaten für deuterium-ausgetauschte Proben in die HDX-Verarbeitungssoftware importiert. Anhand der Referenzproben und der endgültigen Peptidliste lokalisiert die HDX-Verarbeitungssoftware die Peptide aus der Peptidliste in jeder der Rohdatendateien und weist jedem der Isotopenspitzen "Sticks" zu. In den repräsentativen Daten für HalM2 in Abbildung 7sind die erfolgreich zugewiesenen Sticks in allen Spektren blau gefärbt. Nach der Zuweisung von Stöcken wird der Zentroid-m/z-Wert für die Isotopenverteilung von der Software bestimmt und zur Berechnung der Deuteriumaufnahme relativ zur undeuterated Referenzprobe verwendet. Der Deuterium-Austauschwert für jedes Peptid sollte manuell überprüft werden. In Abbildung 7wird das aktuell ausgewählte Peptid (HIDKLTVGL, über HalM2-Rückstände 110-118) im linken Bereich des Hauptdatenbetrachters(Abbildung 7A)dargestellt. Die anderen Panels zeigen HDX-Daten, die mit diesem Peptid verknüpft sind. Wenn Sie auf ein beliebiges Peptid in der Peptidliste klicken, werden die anderen Panels mit HDX-Daten aus diesem Peptid befüllt. Abbildung 7B zeigt die Deuteriumaufnahmeplots für Peptid 110-118. Dieser Datensatz enthält vier Austauschzeitpunkte: 0,5, 5, 30 und 240 min (in Dreifachausführung gesammelt). Austauschdaten wurden für zwei biochemische Zustände gesammelt: das freie HalM2-Enzym (rot) und das HalM2-Enzym, das zu AMPPNP und seinem Substratpeptid HalA2 (blau) komplexiert wurde. Beachten Sie die signifikante Deuteriumaufnahmedifferenz in Peptid 110-118 über den gesamten Zeitverlauf und die hohe Präzision der Replikationsmessungen (Fehlerbalken sind auf dem Diagramm in Abbildung 7Bdargestellt). Im Allgemeinen wird für die meisten Peptide eine ähnliche Genauigkeit bei der Aufnahmemessung erreicht, was die Reproduzierbarkeit des in diesem Protokoll vorgestellten Workflows unterstreicht. Bei Der Ligandenbindung (blaue Kurve in Abbildung 7B)werden die Peptidbindungsamide im Bereich von 110-118 HalM2 offenbar einem erheblichen Schutz vor Deuteriumaustausch unterzogen, was darauf hindeutet, dass die Aminosäuren im 110-118-Bereich stabiler auf Ligandenbindung strukturiert werden. Die anschließende Mutagenese dieser Region deutete auf eine Rolle bei der Bindung an das Vorläuferpeptid HalA220hin. Auch in Abbildung 7 sind die gestapelten Spektraldiagramme für den HalM2-Zustand ( Abbildung7D) und den Zustand HalM2:AMPPNP:HalA2 (Abbildung 7E) dargestellt. In diesen Diagrammen erhöht sich die Austauschzeit von unten nach oben. Die Massenzunahme des Peptids 110-118 bei Deuteriumaustausch zu längeren Zeitpunkten zeigt sich bei der Sichtprüfung. Es ist auch offensichtlich, dass Peptid 110-118 mehr Deuterium im HalM2-Zustand aufnimmt (Abbildung 7D) als im vollliganden Zustand (Abbildung 7E). Wenn dies erforderlich ist, kann der Benutzer durch Klicken auf eines der Unterplots in Abbildung 7D oder Abbildung 7Edie Zuweisung von Sticks im Hauptdatenbetrachter manuell ändern (Abbildung 7C). Bei der Stickzuweisung/-entwidmung summieren die HDX-Verarbeitungssoftware die Deuterium-Aufnahmewerte neu, und alle Plots werden in Echtzeit aktualisiert. In ähnlicher Weise wird durch Klicken auf einzelne Datenpunkte in Panel B der Datenbetrachter in Panel C für die manuelle Stickzuweisung aufgedünnt.
Nachdem für jedes Peptid und jeder Austauschzeitpunkt für alle biochemischen Zustände Stöcke zugeordnet wurden, sollte die Standardabweichung der gemessenen Aufnahmewerte überprüft werden. Dies ist am einfachsten mit der Abdeckungskarte und dem gestapelten Spektraldiagramm durchzuführen (Abbildung 8). Wählen Sie in der Abdeckungszuordnung (Abbildung 8C) den Status und die Austauschzeit aus, und wählen Sie dann die Standardabweichung der relativen Aufnahme aus. Die Peptide in der Abdeckungskarte werden entsprechend der Standardabweichung im gemessenen Deuterium-Aufnahmewert eingefärbt. Auf diese Weise wird es sehr einfach sein, Peptide mit Isotopenstick-Fehlzuweisungen visuell zu identifizieren. Wenn Sie auf das Ausreißerpeptid (mit hoher Standardabweichung) in der Coverage-Karte klicken, werden der Hauptdatenbetrachter und das gestapelte Spektrendiagramm mit HDX-Daten aus dem Ausreißerpeptid auffüllen. Die Stickzuweisungen für jeden Zeitpunkt- und Ladezustand können dann bei Bedarf geändert werden, um den gemessenen Aufnahmewert zu korrigieren. Auch hier aktualisiert die HDX-Verarbeitungssoftware alle Datenanzeigen in Echtzeit, wenn die Stick-Zuweisungen geändert werden.
Nach vollständiger Kuratierung des HDX-Datensatzes muss die Bedeutung der Deuteriumaufnahmedifferenzmessung für jedes Peptid vor der Dateninterpretation berücksichtigt werden. Mit einem von Engen und Kollegen29beschriebenen Ansatz haben wir einen durchschnittlichen Aufnahmewert von 0,1 ± 0,1 Da für das HalM2-Protein unter Verwendung des im obigen Protokoll20beschriebenen Workflows geschätzt. Dieser Wert stimmt mit den Fehlern überein, die von anderen für ähnliche Bottom-up-, continuous Exchange-HDX-Workflows29,30gemeldet wurden. Kürzlich haben Politis und Mitarbeiter Deuteros entwickelt, ein nützliches Open-Source-Tool (implementiert in MATLAB), um signifikante Aufnahmeunterschiede in HDX-Datensätzen schnell zu ermitteln28. Repräsentative Eingabedateien für Deuteros ("State_Data_for_Deuteros" und "Difference_Data_for_Deuteros") sind in den Unterstützenden Informationenenthalten. Wenn sie direkt aus der in diesem Protokoll beschriebenen HDX-Verarbeitungssoftware (Materialtabelle)exportiert werden, haben die Differenz- und Zustandsdatendateien das entsprechende Format für das Lesen von Dateien durch Deuteros. Wenn HDX-Daten auf einem anderen LC-MS-System generiert werden, müssen Datendateien, die denen in den Unterstützenden Informationen ähneln, manuell erstellt werden.
Der Dueteros-Arbeitsbereich ist in Abbildung 9dargestellt. Sobald die Daten in Deuteros importiert wurden, wählt der Benutzer das gewünschte Konfidenzlimit aus (>98% empfohlen) und klickt auf Importieren & Berechnen. Wählen Sie für die abgeflachte Datenzuordnung die Abdeckung für den Datentyp und die absolute Abdeckung für die Farbskala aus. Klicken Sie auf Plot. Wählen Sie für die Holzdiagramme den binären Filter als Datentyp, den gewünschten Konfidenzfilter aus, und aktivieren Sie die Summe. Durch Anklicken der Darstellungwird Deuteros alle Peptide zu jedem Austauschzeitpunkt als Funktion ihrer Position in der Aminosäuresequenz und ihrer Deuteriumaufnahmewerte darstellen. Peptide, die einen signifikanten Austausch aufweisen, werden entweder rot oder blau gefärbt, je nachdem, ob das Peptid mehr bzw. weniger Deuterium einnimmt, je nach der differenzierten Differenz. Der in jedem Diagramm ausgewiesene Signifikanzwert (von 0,39 bis 0,72 Da in den in Abbildung 9dargestellten Daten) wird aus den Standardabweichungen der Aufnahmedifferenzen berechnet, die für jedes Peptid gemessen werden, wie aus den im Datensatz vorhandenen Replikationsmessungen ermittelt. Die Konfidenzintervalle werden als gestrichelte Balken in jedem einzelnen Diagramm angezeigt. Wenn aktiviert, addiert die "Summe" einfach die Aufnahmedifferenz, die zu jedem Zeitpunkt für jedes Peptid gemessen wird. Schließlich, für die Visualisierung der Aufnahmedaten auf die dreidimensionale Struktur des Proteins von Interesse, wählen Sie Exportaufnahme unter PyMOL Optionen, dann exportieren. Deuteros generiert ein PyMOL-Skript, das in den PyMOL-Arbeitsbereich gezogen und abgelegt werden kann, der die geöffnete pdb-Datei des von Interesse ist.
Der in diesem Protokoll vorgestellte HDX-MS-Workflow wurde verwendet, um die biochemischen Eigenschaften eines Enzyms (HalM2) zu charakterisieren, das eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen auf ein genetisch codiertes Peptid (HalA2) katalysiert20. In Abbildung 10sind repräsentative HDX-MS-Ergebnisse für die Bindung des HalA2-Vorläuferpeptids an den HalM2:AMP-PNP-Komplex dargestellt. Panel A zeigt die HalM2-Abdeckungskarte, in der die Farbe den relativen Aufnahmeunterschied zwischen dem biochemischen Zustand [HalM2:AMPPNP] und dem Zustand [HalM2:AMPPNP:HalA2] angibt. Deuteros wurde verwendet, um diese Aufnahmeunterschiede auf einem Homologiemodell des HalM2-Enzyms abzubilden (Abbildung 10B,C). Peptide, die rot gefärbt sind, deuten auf eine Abnahme der Deuteriumaufnahme auf HalA2-Bindung hin, was darauf hindeutet, dass diese Regionen von HalM2 direkt an der Bindung des Vorläuferpeptids beteiligt sein können. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden die Regionen I-III mutiert und die kinetischen Eigenschaften der Variantenenzyme untersucht. Mutationen in Region I und III führten beide zu signifikanten Störungen in der HalA2-Peptidbindungsaffinität, was darauf hindeutet, dass diese Regionen von HalM2 entweder direkt mit dem Peptidsubstrat interagieren oder Strukturen bilden müssen, die eine HalA2-Bindung ermöglichen. Im Gegensatz dazu hatte die Mutation der Region II keinen Einfluss auf die HalA2-Bindungsaffinität, aber diese Mutante war fast ohne katalytische Aktivität. Eine Erklärung für diese Feststellung ist, dass die Organisation der Region II, die bei Der HalA2-Bindung beobachtet wurde, eine Konformationsänderung auslöst, die das Enzym aktiviert. Es sei darauf hingewiesen, dass vor dieser Studie keine Informationen über den Bindungsmodus HalM2-HalA2 oder über die katalytisch relevanten Konformationsänderungen im System verfügbar waren, vor allem weil die große Größe und Flexibilität sowohl von HalM2 als auch von HalA2 Strukturellen Studien ausschlossen. So veranschaulichen diese repräsentativen Daten zur HalM2-Lanthipeptid-Synthetase, wie HDX-MS auch ohne hochauflösende Strukturdaten funktionell relevante Regionen strukturdynamischer Enzymsysteme schnell lokalisieren kann.
Abbildung 1: Ein kontinuierlicher Austausch, Bottom-up-HDX-MS-Workflow. Weitere Informationen finden Sie im Text. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der HDX-Kurs hängt von der Protein-Konformationsdynamik (koffen und kschließen) und der pH-abhängigen Rate des chemischen Austauschs der N-H-Bindungen im Protein-Backbone für N-D-Bindungen ab (kchem). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative LC-MS-Daten für die dreifachen HalM2-Referenzproben. Die Zahl in der oberen rechten Ecke jedes Bedienfelds stellt die Gesamtzahl der Ionen dar. Jede Zeile zeigt Daten für ein anderes Referenzbeispiel an. Die erste Spalte (A-C) zeigt die gesamten Ionenchromatogramme (TICs). Der große Gipfel mit 9,3 min stellt große, unverdaute Peptide dar. Die mittlere Spalte (D-F) zeigt einen näheren Blick auf die TICs zwischen 3 und 8 min. Beachten Sie die gute Übereinstimmung der Formen der Profile, die auf eine ähnliche darunter liegende Mischung von Peptidsignalen in jeder Referenzprobe über das gesamte Chromatogramm hinweist. Die dritte Spalte (G-I) zeigt Massenspektren für jede Referenzprobe, die durch Summierung aller zwischen Demtime 5.0 und 5,1 min des chromatographischen Laufs aufgezeichneten Massenspektren erzeugt wird. Die visuelle Überprüfung dieser Daten zeigt, dass viele der gleichen Peptide in jeder Probe erkannt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Proteomik-Softwareausgabe für eine HalM2-Referenzstichprobe. Das obere linke Bedienfeld zeigt die vollständige Liste der HalM2-abgeleiteten Peptide, die in den MS-Daten erkannt wurden. Beachten Sie, dass im "OK-Filter" das grüne Häkchen angezeigt wird. Dadurch werden die Daten entsprechend dem Konfidenzwert filtert und Peptididentifikationen mit geringem Vertrauen entfernt. Die obere Leiste des rechten Bereichs (blau hervorgehoben) zeigt kumulative Statistiken für den Satz von Peptiden mit hohen Punktzahlen an. Die wichtigsten Statistiken sind die Anzahl der entdeckten Peptide (in diesem Fall 1.421) und die Sequenzabdeckung (in diesem Fall 99,6%). Zusätzliche Statistiken für jedes Peptid werden auch im oberen rechten Bereich angezeigt. Jede Spalte in dieser Datentabelle ist sortierbar. Das untere Panel zeigt alle MS-Signale, die mit einem vorhergesagten HalM2-abgeleiteten Peptid abgestimmt wurden. Beachten Sie, dass die meisten MS-Signale zugewiesen wurden und blau gefärbt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zusätzliche Schwellenwerte in der HDX-Verarbeitungssoftware. Die Proteomics-Softwareausgabe für jedes der drei HalM2-Referenzbeispiele wird in die HDX-Verarbeitungssoftware (linkes Panel) importiert. Nach dem Importieren von Daten wird eine zusätzliche Schwellenwertierung durchgeführt (rechtes Bedienfeld). Das Feld "Minimum consecutive products" bezieht sich auf Fragmentionen, die durch Spaltung benachbarter Peptidbindungen im Peptid erzeugt werden. Der Parameter "Minimum MH+ error" ermöglicht es dem Benutzer, die akzeptable Massengenauigkeit zu definieren, und der "Dateischwellenwert" ermöglicht es dem Benutzer, Peptide nur auf die Peptide zu beschränken, die in allen drei Referenzdateien erkannt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Daten für eine HalM2-Referenzstichprobe (rot) und eine HalM2-Probe, die inD2O-Puffer für 5 min (grün) inkubiert wurde. Beide Beispiele wurden dem unten nach oben beschriebenen LC-MS-Workflow unterzogen, der in Protokollabschnitt 3 beschrieben ist. Die linke Spalte zeigt Massenspektren, die über das Zeitfenster von 6,0 bis 6,1 min summiert werden. Die drei rechten Spalten zeigen nähere Ansichten der gleichen Massenspektren, wobei die Verschiebung auf höhere m/z-Werte in der deuterated Probe (grün, oben) für die meisten Peptidsignale offensichtlich ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Screenshot des Arbeitsbereichs in der HDX-Verarbeitungssoftware. (A) Die Liste der HalM2-abgeleiteten Peptide, die aus der Analyse von HalM2-Referenzproben mit der Proteomik-Software (Abbildung 3) und der anschließenden Schwellenwertierung in der HDX-Verarbeitungssoftware ( Abbildung4) gewonnen wurden. Das aktuell ausgewählte Peptid (HIDKLTVGL, über halM2-Rückstände 110-118) ist blau hervorgehoben. (B) Die Deuteriumaufnahmekurven (als Funktion der Austauschzeit) für die beiden biochemischen Zustände von Interesse: das freie HalM2-Enzym und das HalM2-Enzym, das an AMPPNP gebunden ist, und das Vorläufer-Lanthipeptid HalA2. (C) Massenspektrum der aktiv ausgewählten Probe (in diesem Fall eine der nicht-euterated HalM2-Referenzproben). Die blue sticks im Panel C können bei Bedarf manuell zugewiesen/nicht zugewiesen werden, wenn sie von der HDX-Verarbeitungssoftware bei der ersten Datenverarbeitung nicht ordnungsgemäß zugewiesen wurden. (D,E) Gestapelte Spektraldiagramme für den HalM2-Zustand (D) und den HalM2:AMPPNP:HalA2-Zustand (E). Die zeitabhängige Zunahme der Deuteriumaufnahme ist leicht sichtbar, ebenso wie der Aufnahmeunterschied zwischen den beiden biochemischen Zuständen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Minimierung der Standardabweichung der gemessenen Aufnahmewerte. Die Abdeckungskarte in der HDX-Verarbeitungssoftware (Panel C) bietet eine bequeme Möglichkeit, Peptide mit großen Standardabweichungen in ihren gemessenen Deuterium-Aufnahmewerten schnell zu identifizieren. In diesem hypothetischen Fall sind einige der Isotopenspitzen (blaue Stöcke) für die HalM2 abgeleiteten Peptid-Spannrückstände 110-118 für die 5 min Austauschzeitpunkte (die grauen Sticks in Panel B) nicht zugeordnet. Dies führt zu einer großen Standardabweichung des Deuterium-Aufnahmewertes, gemessen für den 5 min Austauschzeitpunkt. Die große Standardabweichung ist leicht ersichtlich von der blauen Farbe des 110-118-Peptids in der Coverage-Map (Panel C) und der Datenpunktstreuung und der großen Fehlerleiste im Aufnahmediagramm (Panel A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Der Deuteros-Arbeitsbereich. In diesem Beispiel wurden die Aufnahmedifferenzwerte in der HDX-Verarbeitungssoftware berechnet, indem die Deuteriumaufnahme des HalM2:AMPPNP:HalA2-Status vom Zustand HalM2:AMPPNP subtrahiert wurde. Ziel des Vergleichs war es, zu visualisieren, wie Peptidbindung (HalA2) die strukturelle Dynamik des HalM2:AMPPNP-Komplexes veränderte. Der Datensatz enthielt 4 Austauschzeitpunkte (0,5, 5, 30 und 240 min). Der Aufnahmeunterschied für jedes Peptid zu jedem Austauschzeitpunkt wird in den Woods-Plots veranschaulicht. Die farbigen Peptide in den Woods-Plots zeigen Peptide, die einen signifikanten Aufnahmeunterschied aufweisen, wie durch die Standardabweichung der im Datensatz vorhandenen Replikationsmessungen und die in Deuteros ausgewählten benutzerdefinierten Konfidenzgrenzen definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: HDX-MS-Daten leiten die funktionelle Analyse der Peptidbindung und der allosterischen Aktivierung in der Lanthipeptid-Synthetase HalM2. Die Deuteriumaufnahmeänderung nach Bindung des HalA2-Vorläuferpeptids an die HalM2-Lanthipeptid-Synthetase wurde untersucht. Die Aufnahmedifferenz für jedes Peptid nach einer 5 min Austauschreaktion wird dargestellt (A). Dieses Diagramm wurde in der HDX-Verarbeitungssoftware generiert. Peptide, die rot und blau gefärbt sind, unterliegen in Gegenwart des HalA2-Peptids immer mehr deuteriumsaufnahme. Diese HDX -"Hotspots" werden einem HalM2-Homologiemodell zugeordnet (B,C). Die Identifizierung von Peptiden, die signifikante Wechselkursunterschiede aufweisen, wurde in Deuteros bestimmt. Das PyMOL-Skript, das zum Zuordnen der Differenzwerte zum Homologiemodell verwendet wird, wurde in Deuteros generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der in diesem Protokoll vorgestellte HDX-MS-Workflow bietet eine bemerkenswert robuste Plattform zur Kartierung der räumlichen Verteilung strukturdynamischer Elemente in Proteinen und zur Untersuchung, wie sich diese Dynamik als Reaktion auf Störungen (Ligandenbindung, Enzym-Mutagenese usw.) ändert. HDX-MS bietet mehrere deutliche Vorteile gegenüber anderen strukturbiologischen Ansätzen, die häufig zur Untersuchung der Konformationsdynamik verwendet werden. Vor allem werden nur geringe Mengen Aniis benötigt. Mithilfe des hier beschriebenen Workflows liefert eine 1 ml-Probe mit 1 M Protein genügend Material für die Dreifach-HDX-Reaktionen, die jeweils 5 Austauschzeitpunkte enthalten. Darüber hinaus gibt es praktisch keine Größenbeschränkung für das Protein von Interesse, und Proteinkomplexe sind gleichermaßen für den HDX-MS-Ansatz zugänglich. Die Größenbeschränkung wird nur durch das Ausmaß begrenzt, in dem die Peptide chromatographisch gelöst werden können, sowie in den Dimensionen m/z und Ionenmobilität. So liefert HDX-MS für viele Protein-/Proteinkomplexe wertvolle Informationen über Protein-Protein-Interaktionsschnittstellen, Ligandenbindungsstellen, Konformationsdynamik und allosterische Netzwerke. Schließlich wird die HDX-Reaktion unter sanften, nahezu nativen Bedingungen durchgeführt, ohne dass eine ortsspezifische Kennzeichnung/Engineering des Proteins erforderlich ist, was dazu beitragen soll, dass die endogene Aktivität erhalten bleibt. Die Hauptbeschränkung des Ansatzes (in Bezug auf die mechanistischen Informationen, die er über das Protein von Interesse liefert) ist, dass die Peptid-Ebene HDX-Daten von inhärent niedriger räumlicher Auflösung sind. Daher reichen die Daten aus, um daraus abzuleiten, dass eine Veränderung der sekundären Struktur auftritt, aber die mechanistischen Auswirkungen der strukturellen Störung erfordern eine höhere Auflösung (z. B. NMR-, KryoEM- oder Röntgenkristall-Strukturen), Rechenstudien und/oder biochemische Studien, um vollständig zu interpretieren.
Um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, sollten mehrere kritische Aspekte des Protokolls berücksichtigt werden. Erstens sind das Ausmaß des Deuteriumaustauschs während der HDX-Reaktion und das Ausmaß des Rückenaustauschs während der Aufarbeitung und Analyse stark von pH, Zeit und Temperatur abhängig. Daher müssen die Verfahren zur Vorbereitung von Puffern, HDX-Reaktionen und LC-MS-Methoden so systematisch wie möglich sein, um die Variation dieser physikalischen Parameter über Datensätze hinweg zu minimieren. Wann immer möglich, sollten HDX-Reaktionen für zu vergleichende biochemische Zustände von demselben Forscher am selben Tag durchgeführt werden, und die LC-MS-Daten für diese Proben sollten über aufeinander folgende Tage mit derselben Charge Lösungsmittel gesammelt werden. Im Laufe der Zeit wird auch die Effizienz der Pepsin-Verdauung abnehmen, so dass es optimal für Proben ist, die verglichen werden, um innerhalb eines relativ engen Zeitfensters verdaut und analysiert zu werden – vor allem, wenn die Pepsin-Säule verwendet wird, um viele andere Arten von Proben zu verdauen. Es ist eine gute Praxis, die Verdauungseffizienz der Pepsinsäule regelmäßig mit einem Standardprotein zu überprüfen. Um dies zu erreichen, kann ein dediziertes HDX-Verarbeitungssoftwareprojekt eingerichtet werden, bei dem neu verdaute Proben mit älteren Proben verglichen werden können, um sicherzustellen, dass die gleichen Zielpeptide mit ähnlichen Intensitäten erkannt werden.
Während der in diesem Protokoll vorgestellte Workflow ausreichende Daten für viele Enzym-/Proteinsysteme liefern sollte, gibt es mehrere potenzielle Optimierungspunkte. Zunächst kann die Zeitskala der HDX-Reaktion geändert werden, um Dynamiken zu erfassen, die schneller/langsamer sind. Vor allem enthalten viele Enzyme hochdynamische Elemente, die innerhalb weniger Sekunden vollständig ausgetauscht werden. Wenn diese extrem dynamischen Elemente von Interesse sind, wurden Methoden für den vorstationären Zustand, kontinuierlichen Austausch HDX-MS in der Literatur31berichtet. Zweitens können die Bedingungen der LC-Methode leicht geändert werden, um die Verdauungseffizienz (die letztlich die Sequenzabdeckung bestimmt) und die Deuteriumretention (die letztlich die Empfindlichkeit der Methode bestimmt) zu verändern. Unter Berücksichtigung der Dauer und Temperatur der Pepsin-Verdauung, langsamere Durchflussraten und höhere Temperatur wird eine gründlichere Verdauung des Proteins bevorzugen. Die Proteinkonzentration im HDX-Assay kann auch erhöht werden, wenn die Signalintensität zu niedrig ist, oder verringert, wenn die Pepsinverdauung zu ineffizient ist. Unter Berücksichtigung des Acetonitrilgradienten, der zur Trennung der Peptide auf der analytischen C18-Säule verwendet wird, wird ein schnellerer Gradient das Deuterium-Etikett beibehalten, jedoch auf Kosten der chromatographischen Auflösung der Peptide, die in der verdauten Reaktionsmischung vorhanden sind. Bei kleineren Proteinen (ca. 200 Aminosäuren), bei denen weniger Peptide im Digest vorhanden sind, kann ein schnellerer LC-Gradient einfacher umzusetzen sein. Für größere Proteine wie HalM2 (ca. 1.000 Aminosäuren) ist ein längerer Gradient erforderlich, um die zusätzliche spektrale Komplexität zu beheben, die durch die größere Anzahl von Peptiden in der Mischung erzeugt wird. In letzterem Szenario kann die Einbeziehung einer Trennung der Gasphase-Ionen-Mobilität dazu beitragen, die Spitzenkapazität der Analyse drastisch zu verbessern. Die Einbeziehung der Ionenmobilitätstrennung kostet ein leicht reduziertes Signal-Rausch-Verhältnis. Schließlich ist zu beachten, dass die MS-Daten für die HDX-Beispiele nicht im MSE-Modus gesammelt werden müssen. Der MSMS-Teil des MS E-Betriebszyklus (d. h. das Segment der hohen Kollisionsenergie, Schritt 3.3.7.2) ist nur für die Referenzproben erforderlich, um die Peptidliste zu definieren (Protokollabschnitt 4). Daher sollten HDX-Samples im reinen MS-Modus analysiert werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
Wenn der in diesem Protokoll beschriebene Workflow ordnungsgemäß funktioniert, sollten vollständig austauschende Peptide einen relativen Deuteriumaufnahmewert von 60 % bis 70 % aufweisen. Wenn die Deuteriumaufnahme wesentlich niedriger ist (für ein lösungsmittelexponiertes, ungeschütztes Peptid), ist die wahrscheinlichste Erklärung, dass sich der pH-Wert der Probe während eines Teils der Aufarbeitung/Analyse ändert. In diesem Szenario sollte eine Mikrospitzenelektrode verwendet werden, um den pH-Wert des HDX-Assays und der abgeschreckten Reaktionsaliquot sorgfältig zu überwachen. Der pH-Wert der LC-MS Lösungsmittel sollte ebenfalls überprüft werden. Um das Auftreten dieses Problems zu minimieren, wird dringend empfohlen, konzentrierte Lagerlösungen aller Puffer und Reagenzien vorzubereiten und zu speichern, die für den Test benötigt werden (wie in Protokollabschnitt 1 beschrieben).
In den letzten Jahren hat sich HDX-MS zu einem leistungsstarken Analyseinstrument entwickelt, um die Strukturelle Dynamik von Proteinen zu untersuchen. Die Entwicklung kommerziell erhältlicher LC-MS-Systeme, die für HDX-Experimente entwickelt und optimiert wurden (wie das in dieser Studie verwendete und in den Materialien aufgeführte System) in Verbindung mit leistungsstarken Softwarepaketen, hat den HDX-MS-Ansatz in viele akademische und industrielle Labore erweitert und die einstige Nischentechnik in eine benutzerfreundlichere Analyseplattform umgewandelt. Trotz der Einschränkungen in der räumlichen Auflösung bietet HDX-MS hochquantitative und reproduzierbare Messungen an Proteinbewegungen und eignet sich ideal für die Untersuchung konform dynamischer Enzyme, die mit anderen Ansätzen schwer zu untersuchen sind. Aufgrund dieser Eigenschaften füllt HDX-MS eine wesentliche Nische in der Strukturbiologie ungeordneter und dynamischer Proteinsysteme, die in vielen grundlegenden Bereichen der Biologie und Medizin relevant sind. Daher dürften HDX-MS-Analysen auf absehbare Zeit ein wichtiges Instrument im Arsenal des Strukturbiologen bleiben.
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Disclosures
Wir haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dem Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, der Canadian Foundation for Innovation und den Start-up-Fonds der McGill University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
| potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
| DynamX | Waters | version 3.0 | |
| MassLynx | Waters | version 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Instrument and equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
References
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