Artigo de método

Separação de Pequenas Moléculas Bioativas, Peptídeos de Fontes Naturais e Proteínas de Micróbios pelo Método De Foco Isoelétrico Preparatório (IEF)

DOI:

10.3791/61101

⸱

14 de junho de 2020

 ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University

Neste artigo

Resumo

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O objetivo é fracionar e isolar pequenas moléculas bioativas, peptídeos de um complexo extrato vegetal e proteínas de micróbios patogênicos, empregando o método de focalização isoelétrica de fase líquida (IEF). Além disso, as moléculas separadas foram identificadas e sua bioatividade confirmada.

Resumo

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Produtos naturais derivados de plantas e micróbios são uma rica fonte de moléculas bioativas. Antes de seu uso, as moléculas ativas de extratos complexos devem ser purificadas para aplicações a jusante. Existem vários métodos cromatográficos disponíveis para este fim, mas nem todos os laboratórios podem pagar métodos de alto desempenho e o isolamento de amostras biológicas complexas pode ser difícil. Aqui demonstramos que o foco isoelétrico de fase líquida (IEF) pode separar moléculas, incluindo pequenas moléculas e peptídeos de extratos de plantas complexas, com base em seus pontos isoelétricos (iI). Utilizamos o método para fracionamento e caracterização de amostras biológicas complexas. Como prova de conceito, fracionamos um extrato de planta gymnema sylvestre, isolando uma família de pequenas moléculas terpenoides de sapono e um peptídeo. Também demonstramos uma separação eficaz de proteína microbiana usando o fungo Candida albicans como um sistema modelo.

Introdução

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A purificação de biomoléculas a partir de amostras biológicas complexas é um passo essencial e muitas vezes difícil em experimentos biológicos1. O foco isoelétrico (IEF) é adequado para a separação em alta resolução de biomoléculas complexas onde os amfolitos portadores viajam de acordo com sua carga e estabelecem o gradiente de pH em um campo elétrico3. O primeiro ampholyte de transportadora comercial para IEF foi desenvolvido por Olof Vesterberg em 1964 e patenteado4,5. Os amfolitos portadores são moléculas de ácido oligo-carboxílico alifático de comprimento e ramificação6. Posteriormente, Vesterberg e outros melhoraram os amóglifos portadores para seu uso expandido na separação de biomoléculas6,7.

Os métodos para separar as biomoléculas incluem eletroforese de gel de agarose e poliacrilamida, eletroforese de gel bidimensional (2-DE), foco isoelétrico, eletroforese capilar, isotacoforese e outras técnicas cromatográficas (por exemplo, TLC, FPLC, HPLC)2. O IEF de fase líquida realizado em um instrumento chamado "Rotofor" foi inventado por Milan Bier8. Ele foi pioneiro no conceito e design deste instrumento e contribuiu extensivamente para a teoria da migração eletroforética. Sua equipe também desenvolveu um modelo matemático de processo de separação eletroforética para simulações computacional9.

O aparelho IEF de fase líquida é uma célula cilíndrica rotativa horizontal, consistindo de um núcleo de nylon dividido em 20 compartimentos porosos e uma haste de cerâmica de resfriamento de água circulante. As câmaras porosas permitem que as moléculas migrem através da fase aquosa entre os eletrodos e permitem a coleta de amostras purificadas sob vácuo em frações. Este sistema de purificação pode fornecer até 1000 vezes a purificação de uma molécula específica em <4 horas. Uma característica valiosa deste instrumento é que ele pode ser aplicado como um primeiro passo para purificação a partir de uma mistura complexa ou como um passo final para alcançar a pureza10. Se a molécula de interesse é uma proteína, outra vantagem é que sua conformação nativa será mantida durante a separação.

O uso de IEF de fase líquida tem sido amplamente relatado para proteínas, enzimas e purificação de anticorpos6,10,11,12,13,14. Aqui descrevemos o uso dessa abordagem para separar e purificar pequenas moléculas e peptídeos da planta medicinal Gymnema sylvestre. Este protocolo ajudará os pesquisadores a concentrar e purificar pequenas moléculas ativas de um extrato vegetal para aplicações a jusante a baixo custo. Além disso, também demonstramos que o enriquecimento de proteínas de um complexo extrato de proteína do fungo Candida albicans 15 neste sistema baseado em IEF como segundo exemplo.

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Protocolo

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1. Configuração e pré-ressarificação da unidade IEF de fase líquida padrão

  1. Monte os eletrodos IEF de fase líquida (botão vermelho-ânodo e botão cathode-preto) com suas respectivas membranas de troca de acordo com o manual de instruções (ver Tabela de Materiais). Equilibre as membranas de troca de ânion com 0,1 M NaOH e as membranas de troca de cáção com 0,1 M H3PO4 pelo menos por 16 h quando novas membranas são usadas.
    1. Armazene as membranas em eletrólitos (0,1 M NaOH ou 0,1 M H3PO4) entre as corridas e não deixe secar.
  2. Monte a porção interna e externa do eletrodo alinhando três orifícios oblongos nas juntas de troca de íons. Encha os eletrodos com os respectivos eletrólitos (~25-30 mL) para evitar que suas membranas sequem.
    1. Não adicione excesso (mais de 1/3de volume de câmara de eletrodos) eletrólitos que possam aumentar a pressão dentro do eletrodo e causar vazamento.
  3. Cubra as portas de coleta de amostras com fita de vedação que vem com as peças de montagem do instrumento (ver Tabela de Materiais). O lado das portas de coleta de amostras pode ser identificado pelos dois pinos de alinhamento metálico vertical. Alternativamente, use fita de vedação padrão para selar as portas.
  4. Monte todas as partes do conjunto da câmara focal em sequência (eletrodo de ânodo, núcleo de membrana de nylon, câmara de foco e eletrodo de cátodo) sobre o dedo de resfriamento cerâmico.
  5. Encha a câmara de foco com água destilada pré-identificada (volume total de 60 mL para a célula IEF padrão) usando uma seringa de 50 mL.
  6. Conecte o instrumento IEF de fase líquida a uma água de resfriamento circulante a 4 ºC e pré-run a unidade a 15 W e 3.000 V por 3-5 min ou até que a tensão estabilize.
    NOTA: Geralmente, dentro de um minuto, a tensão atingirá os valores máximos definidos. A pré-corrida com água destilada ajuda a remover os íons residuais da câmara de foco e do núcleo da membrana de nylon.
  7. Desligue a fonte de energia e remova a água da célula usando o coletor de frações. Selar as portas de coleta com fita de vedação.
    NOTA: Agora o instrumento está pronto para uso na etapa 2.4.

2. Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato de Gymnema sylvestre

  1. Meça 0,6 g de extrato vegetal e dissolva em água destilada (60 mL) misturando-se em um tubo de rolo por 5 min.
    NOTA: Qualquer amostra biológica solúvel e livre de sal pode ser usada para separação e purificação usando este instrumento IEF. Podem ser utilizadas amostras com concentração de sal tampão de até 10 mM com resolução ligeiramente reduzida. Estamos interessados na família saponina de compostos triterpenóides, os ácidos gymnémicos, da planta G. sylvestre para suas propriedades antifúngicas únicas16.
  2. Centrifugar o extrato da planta solubilizada a 10.000 x g por 5 minutos para remover partículas insolúveis.
  3. Transfira o supernatante (~60 mL) para um tubo de centrífuga de 80 mL e misture-o com 0,6 mL de amfolito (pH 3-10) a 1% (v/v).
  4. Siga as etapas 1.1 – 1.7 para preparar a unidade IEF de fase líquida. A câmara está pronta para carregar a amostra.
  5. Use uma seringa de 50 mL com uma agulha final de 1-1/2 polegada 19 G (vem com o instrumento) e carregue a amostra preparada com amfolito (total de 60 mL) na célula através de portas de coleta.
  6. Remova bolhas de ar da célula amostra, removendo a célula focal do suporte e tocando na câmara de eletrodos para desalojar as bolhas. A presença de bolhas de ar causará flutuações de tensão e corrente e afetará a corrida.
  7. Conecte a unidade ao refrigerante de água (4 °C) e inicie o fracionamento com a fonte de alimentação a uma constante de 15 W.
  8. Execute o aparelho por 3h ou até que a tensão atinja um valor constante.
    NOTA: À medida que a amostra começa a se concentrar, a tensão começará a subir gradualmente até atingir um valor constante.
  9. Após a execução, prepare-se para coletar as frações na caixa de colheita (contendo 20 tubos plásticos, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL de volume) conectados à bomba de vácuo pressionando o botão de colheita ON na unidade IEF.
  10. Alinhe os pinos de 20 coleções com as portas de 20 coleções da célula focal que está lacrada com a fita.
  11. Empurre os pinos de coleta através da fita de vedação e gire a bomba de vácuo ON simultaneamente (ver Figura 2B, 2C & 2D).
    NOTA: Cerca de 3 mL frações de cada câmara serão coletadas nos tubos para cada vez. Frações podem ser usadas para aplicações a jusante subsequentes (SDS-PAGE para quantificação de peptídeos, TLC e bioensaio para pequenas moléculas).

3. Separação e purificação de proteínas de C. albicans

  1. Cresça colônia única de C. albicans em levedura-peptone-dextrose (YPD) caldo16 a 30 °C com agitação (200 rpm) durante a noite.
  2. Coletar as células de levedura por centrifugação (10.000 x g por 5 min).
  3. Suspender as células de levedura C. albicans em carbonato de amônio (1,89 g/L) tampão contendo 1% (v/v) beta-mercaptoethanol (β-ME) (1/10º do volume cultural) e girar em um tubo de rolo por 1 h a 5 °C15.
  4. Remova as células de levedura por centrifugação (10.000 x g por 5 min) e filtre o extrato de proteína através de um filtro de 0,45 μm.
    NOTA: Amostras de proteínas de C. albicans cytosol, membrana ou parede celular podem ser preparadas e usadas para fracionamento de IEF. Da mesma forma, proteínas de bactérias ou outras amostras biológicas (extrato de tecido animal) podem ser usadas após a remoção de qualquer sal por métodos apropriados ( porexemplo,por diálise ou usando colunas de desalização).
  5. Dique o extrato de proteína em um tubo de diálise (3.500 MWCO) contra a água por 15 h a 4 °C. Estime a concentração proteica pelo método de ligação de corante de Bradford usando globulina gama como padrão17.
  6. Use 500 mg de proteína total em 60 mL de água contendo 1% (v/v) ampholyto (pH 5-8) para o fracionamento.
    NOTA: Uma vez que um amfolito de larga alcance (pH 3-10) não enriquece certas proteínas de parede celular não-glucanas de C. albicans bem, use um amfolito de alcance estreito (pH 5-8). Uma concentração de amfolitos de até 2% pode ser usada se a concentração de proteínas amostrais for superior a 2 mg/mL; isso minimiza a agregação de proteínas durante o foco. Mantenha sempre as amostras, amólitos e água pré-cozido no gelo.
  7. Repita os passos 1.1- 1.7 para preparar a unidade IEF e use a solução proteica da etapa 3.6 para carregar na célula IEF.
  8. Após 4h de foco em 15 W constantes, colher frações de proteína (1-20) conforme descrito acima (etapas 2,9-2,11) e analisar em 12,5% SDS-PAGE após reduzir e ferver as amostras de proteína18.
  9. Manche as proteínas resolvidas manchando o gel SDS-PAGE com o corante azul Coomassie (0,01%) solução para 2-3 h à temperatura ambiente em um roqueiro. Destain o gel e gravar a imagem em gel usando um imager gel.
    NOTA: Corante azul coomassie (0,01%) pode ser preparado misturando 0,01 g de pó azul Coomassie em uma solução desestabilizadora contendo 40% de metanol e 10% ácido acético.

4. Bioatividade de pequenas moléculas purificadas do extrato vegetal Gymnema sylvestre

  1. Cresça C. albicans em células de levedura como na etapa 3.1.
  2. Para preparar a suspensão celular, diluir a cultura noturna das células de levedura de C. albicans (diluição de 1/1000) em um meio de cultura celular RPMI fresco complementado com 50 mM de glicose.
    NOTA: C. albicans converte do crescimento da levedura em hifa sob condições de indução de hifa (RPMI a 37 °C). Pequenas moléculas de ácido gymnêmico são mostradas para inibir a conversão de células de levedura em hifas sob condições indutoras de higiais16. Nosso objetivo era determinar se o extrato G. sylvestre separado por fase líquida-IEF contém essas moléculas bioativas.
  3. Da suspensão celular preparada, adicione 90 μL a cada poço da placa de 96 poços.
  4. A partir de cada fração (1-20 frações colhidas de extrato g. sylvestre obtidos a partir de IEF de fase líquida, Figura 4), adicione 10 μL nos poços com 90 μL da suspensão celular acima (etapa 4.2). Realize o ensaio em triplicado.
  5. Adicione 10 μL de água que contenha amfolito (1%) em poços separados com 90 μL de suspensão de células de levedura C. albicans como um controle negativo.
    NOTA: Os ampholytes têm potencial de bioatividade e, por isso, é essencial incluir um controle de amólise durante a realização de qualquer bioensaio19.
  6. Incubar a placa de 96-well a 37 °C por 12 h e observar a inibição da conversão de leveduras de C. albicans sob o microscópio16. Além disso, determine a porcentagem de inibição da conversão de levedura para hifa.

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Resultados

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Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato vegetal de Gymnema sylvestre
Usando o método de IEF de fase líquida preparatória, fracionamos extratos de plantas medicinais e proteínas da superfície celular de um fungo patogênico humano, C. albicans. Um esquema desses protocolos de fracionamento é mostrado na Figura 1.

A partir de 20 frações de extrato g. sylvestre obtidos a partir de IEF de fase ...

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Discussão

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Pequenas moléculas de fontes de produtos naturais (por exemplo, plantas) incluem metabólitos secundários complexos que são altamente diversos em estrutura química. Acredita-se que estejam envolvidos em mecanismos de defesa de plantas. Além disso, os polipeptídeos também estão presentes nos tecidos vegetais22. Essas pequenas moléculas de produtos naturais são fontes ricas de moléculas de teste para descoberta e desenvolvimento de drogas. No entanto, os métodos difíceis e tediosos necessários para s...

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Divulgações

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Os autores gostariam de declarar que não há interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Somos gratos pelas fontes de financiamento da Divisão de Biologia e johnson Cancer Research Center para prêmios BREVE e IRA, respectivamente para gv. Agradecemos também o prêmio de pós-doutorado K-INBRE à RV. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de bolsas P20 GM103418. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos aos revisores anônimos por seus comentários úteis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 µ m filtro de seringaFisher scientfic09-720-004
2-MercaptoetanolSigmaM3148
Carbonato de amônioSigma-Aldrich207861-500
Bio-Lyte 3/10 AnfólitoBio-Rad163-1113
Bio-Lyte 5/8 AnfólitoBio-Rad163-1192
Termostato compacto de baixa temperaturaLauda - BrinkmannRM 6TDefina o resfriamento a água para 4 oC e pode ser executado mesmo a 0 oC, pois quando passa pelo núcleo de resfriamento Rotofor, a temperatura da água circulante será de cerca de 5 ou mais, dependendo da tensão.
Coomassie Brilliant Blue RSigma-AldrichB7920
(3,500 MWCO)Spectrum Spectra/Por132112T
Extrato de folha de planta Gymnema em pó (>25% de ácidos gimnêmicos)Suan Farma, NJ EUA
IncubadoraCompanheiro de laboratórioSI 300R
MicroscópioLeicaDM 6B
Mini proteano medidor de pH para eletroforeseBio-Rad
Mettler ToledoS20Útil para determinar o pH das frações Rotofor (IEF em fase líquida)
RotoforBio-Rad170-2972http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Manual de instruções para montagem da unidade)
RPMI-1640 MediumHyCloneDH30255.01
Fita de vedaçãoBio-Rad170-2960A fita adesiva também pode ser usada.
Sorvall legend micro 17 centrífugaThermo scientific75002432
TPP placa de cultura de tecidos -96 poços fundo planoTPPTP92696
Tubo de diálise

Referências

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  1. Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
  2. Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
  3. Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
  4. Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
  5. Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
  6. Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1(1983).
  7. Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
  8. Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
  9. Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
  10. Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
  11. Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
  12. Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
  13. Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
  14. Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
  15. Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
  16. Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189(2013).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
  20. Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
  21. Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
  22. Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
  23. Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
  24. Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
  25. Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328(2019).
  26. Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).

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