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Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

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DOI:

10.3791/61118

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16 de agosto de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Neuroscience Center, HiLIFE, University of Helsinki, 3Department of Brain Biochemistry, Maj Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Resumo

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo robusto e reprodutível de acúmulo de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina. Combinado com a imunostainação e a análise automatizada de imagens imparcial, este modelo permite a análise dos efeitos das drogas e manipulações genéticas na agregação de α-sinucleína nas culturas neuronais. Culturas primárias de cérebro médio fornecem uma fonte confiável de neurônios embrionários de boa fé. Neste protocolo, a histopatologia marcante da doença de Parkinson, corpos de Lewy (LB), é imitada pela adição de fibrilas pré-formadas por α-sinucleína (PFFs) diretamente aos meios de cultura neuronal. O acúmulo de fosforilato fosfoilado α-sinucleína na soma dos neurônios da dopamina é detectado por imunostaining já em 7 dias após a adição de PFF. As condições de cultura in vitro também são adequadas para a aplicação e avaliação de tratamentos que previnem o acúmulo de α-sinucleína, como drogas de moléculas pequenas e fatores neurotróficos, bem como vetores de lentivírus para manipulação genética (por exemplo, com CRISPR/Cas9). A colheita dos neurônios em 96 placas de poço aumenta a robustez e o poder das configurações experimentais. No final do experimento, as células são fixadas com paraformaldeído para imunocitoquímica e imagens de microscopia de fluorescência. As imagens de fluorescência multiespectral são obtidas através de microscopia automatizada de 96 placas de poços. Esses dados são quantificados (por exemplo, contando o número de neurônios de dopamina contendo fosfo-α-sinucleína por poço) com o uso de software livre que fornece uma plataforma para análise de fenótipo de alto conteúdo imparcial. A modelagem induzida por PFF do acúmulo de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina fornece uma ferramenta confiável para estudar os mecanismos subjacentes que mediam a formação e eliminação de inclusões de α-sinucleína, com a oportunidade de triagem de medicamentos de alto rendimento e análise de fenótipo celular.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela morte dos neurônios de dopamina midbrain na substantia nigra (SN), perda subsequente de tom de dopamina em gânglios basais e consequentes prejuízos motores1,,2. Uma das principais características histopatológicas nos cérebros dos pacientes com DP são os agregados de proteína/lipídio intracelulares encontrados na soma neuronal, chamada corpos de Lewy (LB), ou em neurites, neuróides de Lewy (LN), coletivamente conhecidos como patologia lewy3. A patologia lascívia no cérebro parece progredir com o avanço da DP assemelhando-se à propagação de fatores patogênicos através de conexões neuronais. A abundante patologia lewy é encontrada em neurônios de dopamina no SN e células em outras áreas afetadas pela neurodegeneração4. No entanto, durante a progressão da doença, a disseminação e o início da agregação de proteínas nem sempre se correlacionam com a morte neuronal e a contribuição exata da patologia de Lewy para a morte neuronal ainda não está clara5.

LB e LN foram mostrados como componentes membranous e proteináceos3. Os primeiros são fragmentos de membrana, estruturas vesiculares (possivelmente lisosomos e autofagosos) e mitocôndrias3. Este último consiste em pelo menos 300 proteínas diferentes6. Um estudo marcante de Spillantini et al.7 demonstrou que o principal componente proteico da patologia lewy é a α-sinucleína. Altamente expressa em neurônios, e ligada à fusão de membrana e liberação de neurotransmissores, a α-sinucleína na patologia de Lewy está presente principalmente na forma fibrila amiloide, a maior parte da qual é fosfoilada em Ser129 (pS129-αsyn)4,8.

É importante ressaltar que também foi demonstrado que, devido às suas propriedades semelhantes à prída, a α-sinucleína descasada pode ter um papel causal na formação da patologia lewy4. As propriedades semelhantes à prion de α-sinucleína mal dobradas foram mostradas com ambos os extratos de cérebro médio de pacientes e fibrilas pré-formadas de α-sinucleína (PFFs) para induzir agregados de α-sinucleína em neurônios na cultura e in vivo9,10. Os PFFs apresentam um modelo confiável e robusto para estudar a progressão da patologia α-sinucleína em neurônios de dopamina. Quando os PFFs são aplicados a neurônios primários cultos ou injetados no cérebro animal, eles levam à formação de inclusões contendo α-sinucleína em neurites e somacelular 11 que recapitulam muitas características vistas na patologia lewy. As inclusões observadas são detergentes-insolúveis em Tritão X, ubiquitinados, manchados com o corante específico amiloide Thioflavin S, e contêm α-sinucleína hiperfosforilada em Ser12911,12. É importante ressaltar que essas inclusões não se formam em animais eliminatórios α-sinucleína11, indicando a dependência de sua formação em α-sinucleína endógena.

No entanto, é difícil comparar diretamente as inclusões induzidas pelo PFF e a patologia de Lewy encontrada em pacientes com DP porque os LBs e LNs humanos são altamente heterogêneos3. A heterogeneidade observada da patologia lewy pode ser causada por diferentes estágios da formação, localização anatômica diferente ou diferenças na conformação da α-sinucleína mal dobrada iniciando o processo de agregação. Os mesmos fatores podem influenciar as inclusões positivas induzidas pelo PFF pS129-αsyn. De fato, recentemente foi demonstrado que as inclusões positivas induzidas pelo PFF em culturas neuronais primárias representam estágios muito iniciais da patologia que podem amadurecer para estruturas próximas à LB após o período de incubação prolongada12,13.

A modelagem precoce da disseminação e acúmulo de α-sinucleína mal dobrada com FPS é valiosa para o desenvolvimento de medicamentos, uma vez que a propagação da patologia de Lewy é considerada um dos marcadores da doença em estágio inicial. Portanto, tratamentos preventivos de agregação podem ser promissores para parar ou retardar a progressão da DP em estágios muito iniciais. Vários ensaios clínicos destinados a retardar ou parar o acúmulo de α-sinucleína estão em andamento14. Para pacientes em estágio posterior, o transplante de progenitores neuronais de dopamina pode ser uma alternativa de melhor tratamento15. No entanto, a patologia de Lewy foi documentada em neurônios embrionários transplantados durante a análise pós-morte do cérebro do paciente dp16,17, indicando também a necessidade de proteção contra o acúmulo de α-sinucleína.

In vitro, os PFFs de α-sinucleína são conhecidos por induzir agregação em linhas celulares imortalizadas, ou mais comumente, em neurônios hipocampais primários ou corticais. Nenhum deles está perto de recapitular neurônios de dopamina10. A colheita desses neurônios requer um revestimento denso de certos números de neurônios in vitro18. Para alcançar alta densidade de revestimento com material limitado (por exemplo, neurônios primários de dopamina), o método de cultivo de micro ilhas é comumente utilizado. Na micro ilha, as células são inicialmente banhadas em uma pequena gota de meio (geralmente alguns microliters) mantidos juntos pela tensão superficial no meio de um grande poço18. Após os neurônios se anexar, todo o poço é preenchido com o meio, enquanto as células permanecem confinadas em alta densidade na pequena área de revestimento. Além de atingir alta densidade de revestimento, as micro ilhas também impedem o revestimento perto das bordas dos poços, onde variações na densidade celular e sobrevivência são frequentes. Micro ilhas são frequentemente utilizadas em poços ou pratos relativamente grandes; no entanto, estabelecer culturas neuronais de cérebro médio em micro ilhas em formato de placa de poços em 96 bem permite o estudo da patologia lewy em neurônios de dopamina de boa fé com poder de médio a alto rendimento. Experimentos in vitro com esses neurônios nos permitiram descobrir o fator neurotrófico derivado da linha celular gliana (GDNF), que promove a sobrevivência de neurônios maduros de dopamina in vitro e in vivo19,20,,21,22 e também impede a formação de agregados de α-sinucleína nos neurônios de dopamina23. Os neurônios de dopamina pluripotentes pluripotentes induzidos pelo paciente humano constituem um modelo mais preciso devido à sua origem humana e ao maior tempo de sobrevivência in vitro. No entanto, a indução da patologia α-sinucleína nos neurônios humanos é observada após vários meses, em comparação com uma semana em neurônios embrionários de camundongos, e/ou com múltiplos estressores (por exemplo, combinação de superexpressão α-sinucleína e FPFs)24,25. Além disso, a manutenção de neurônios de dopamina humana é mais cara e trabalhosa quando comparada aos neurônios embrionários primários, essencialmente limitando seu uso em aplicações de alto rendimento.

Além disso, as culturas neuronais primárias da dopamina podem ser geneticamente modificadas (por exemplo, com CRISPR/Cas9) e/ou tratadas com agentes farmacológicos23. Eles constituem uma plataforma rápida e reprodutível para aplicações como dissecção de vias moleculares e triagem de bibliotecas de drogas. Embora o material limitado possa ser obtido a partir dessas culturas, ainda é possível realizar análises de genômica/proteômica de pequeno porte. A colheita de neurônios primários em formato de poço 96 é melhor para técnicas de microscopia de imunocytoquímica e fluorescência, seguida pela análise de fenótipo de alto teor. Imagens de fluorescência multiespectral derivadas de imagens automatizadas de 96 placas de poço podem ser convertidas em resultados quantitativos (por exemplo, o número de neurônios contendo LB por poço). Tais análises podem ser feitas com software livre, como CellProfiler26,27. No geral, as culturas primárias embrionárias do cérebro médio emplacadas em 96 placas de poço fornecem uma plataforma robusta e eficiente para estudar neurônios de dopamina e agregação de α-sinucleína com a oportunidade de triagem de fenótipo de alto rendimento.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Conselho Nacional finlandês de Experimentos com Animais e foram realizados de acordo com a legislação europeia sobre a proteção de animais usados para fins científicos.

1. Preparação

  1. Prepare o neurônio de dopamina médio (DPM) com 0,46% D-glicose, 1% L-glutamina, 1% N2, 0,2% primocina, completado com DMEM/F12. Filtre o DPM depois de misturar os ingredientes. Armazene DPM a 4 °C e aqueça cada alíquota apenas uma vez.
    NOTA: O DPM não deve conter GDNF, pois reduzirá o acúmulo de α-sinucleína nos neurônios de dopamina23.
  2. Prepare pipetas de vidro siliconadas que são extremamente hidrofóbicas, minimizando assim o apego à superfície e a perda de células durante o manuseio inicial de neurônios embrionários.
    1. Adicione 10 mL de fluido siliconante a 1 L de água destilada e misture mexendo em um vaso de 2 L. Deixe as pipetas de vidro imersas na solução de silício por 15 minutos.
    2. Enxágüe as pipetas 3-5x com água destilada. Seque as pipetas durante a noite à temperatura ambiente (RT) ou por 1-2 h a 100-120 °C espaço estéril aquecido para acelerar a secagem.
    3. Esterilize as pipetas por autoclavagem padrão em um saco de autoclave selado.
  3. Prepare a poli-L-ornithine (PO) revestida de 96 placas de poço com fundo transparente adicionando 60 μL de solução PO nos poços médios da placa de poço 96 a ser usada para semeadura dos neurônios, deixando pelo menos uma linha/coluna de poços nas bordas da placa para evitar efeitos de borda. Mantenha a placa revestida durante a noite a 4 °C ou 4 h no RT.
  4. Antes de emplacar as células, aspire PO completamente e lave as células três vezes com 100 μL de 1x PBS. Aspire 1x PBS dos poços e mantenha a tampa da placa aberta para secagem completa.
    NOTA: É possível coletar PO usado e filtrar para reutilização. Isso pode ser repetido duas vezes para a mesma solução PO.
  5. Adicione 50 μL de DPM a poços previamente revestidos. Aspire DPM dos poços com uma ponta plástica de 100 μL e, simultaneamente, arranhe a parte inferior do poço com movimentos circulares para remover o revestimento no perímetro de cada poço. Uma ilha revestida de PO permanecerá no meio do poço.
  6. Sob um capô laminar, adicione 10 μL de DPM ao meio de cada ilha revestida para criar micro ilhas.
    NOTA: Uma placa com microfinas cobertas de DPM pode ser mantida sob a capa de fluxo laminar por 1-2 h durante o isolamento das células.

2. Isolamento do piso ventral do cérebro médio dos embriões de camundongos E13.5

NOTA: Consulte a Figura 1 para as etapas de dissecção do piso midbrain.

  1. Antes da dissecação, encha uma placa de Petri de 10 cm com o tampão de Dulbecco e mantenha-a no gelo.
  2. Eutanize um rato fêmea grávida E13.5 de acordo com as diretrizes da instituição. Coloque o mouse de costas e pulverize o corpo anterior com 70% de etanol. Levante a pele acima do útero com fórceps e faça uma incisão com uma tesoura cirúrgica para expor o útero.
  3. Remova cuidadosamente o útero e coloque-o na placa de Petri previamente preparada no gelo.
  4. Usando uma tesoura cirúrgica sob a capa laminar em RT, remova cuidadosamente os embriões do útero. Remova todo o resíduo placentário dos embriões com fórceps e coloque-os em uma nova placa de Petri de 10 cm cheia de tampão de Dulbecco.
  5. Usando fórceps ou agulhas de dissecção, corte o traseiro da cabeça dos lugares marcados com setas pretas na Figura 1A. Retire a peça cortada do resto do embrião(Figura 1B).
  6. Coloque a parte posterior da peça de corte em direção ao observador(Figura 1C) e corte-a suavemente de caudal para craniana(Figura 1D). A partir de 0,5 mm abaixo da abertura craniana, corte uma região de2mm 2 -3 mm2, mostrada na Figura 1E.
  7. Colete o piso de cérebro médio ventral (ver Figura 1F) em um tubo vazio de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo de microcentragem no gelo até que todos os pisos do cérebro médio sejam coletados nele.
    NOTA: Alternativamente, os pisos do cérebro médio podem ser coletados com uma micropipette de 1 mL após dissecção de todos os cérebros de embriões.

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Figura 1: Dissecção do piso midbrain do embrião do rato E13.5. (A) Os locais de corte no traseiro da cabeça são marcados com setas pretas e linhas brancas tracejadas. (B) A peça foi removida do resto do embrião. A peça removida é circulada. (C) A peça foi virada 90° para enfrentar o posterior em direção ao observador. (D) A peça foi aberta a partir das setas pretas, do caudal ao craniano (marcado com linha branca tracejada). (E) A partir de 0,5 mm a 1 mm abaixo da abertura, a região de 2 mm2–4 mm2 foi cortada (marcada com linhas pretas). (F) O piso ventral do cérebro médio foi isolado (marcado com quadrado tracejado preto). Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Estabelecendo culturas primárias embrionárias de cérebro médio a partir de embriões de camundongos E13.5 em formato de placa de poços 96 bem

  1. Após a coleta de pisos de cérebro médio de todos os embriões no mesmo tubo de 1,5 mL, remova o tampão residual do Dulbecco e lave os pedaços de tecido três vezes com 500 μL de Ca2+, Mg2+-free Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
  2. Remova o HBSS e adicione 500 μL de 0,5% de trippsina ao tubo. Incubar a 37 °C por 30 min.
  3. Durante a incubação, aqueça 1,5 mL de soro bovino fetal (FBS) a 37 °C, adicione 30 μL de DNase I ao FBS e misture. Além disso, polir o fogo na ponta de uma pipeta de vidro siliconada. Certifique-se de que o orifício não tem bordas afiadas e está em torno do mesmo tamanho de uma ponta de micropipette de 1 mL.
    NOTA: Como alternativa, uma ponta de micropipette de baixa adesão de 1 mL pode ser usada para trituração. No entanto, as pipetas de vidro siliconadas parecem dar os melhores resultados.
  4. Assim que a incubação na etapa 3.2 terminar, adicione 500 μL da mistura FBS/DNase ao tecido parcialmente digerido. Use a pipeta de vidro para triturar o tecido na mistura FBS/trypsin. Triturar até que os tecidos se dissociem em partículas minúsculas e pouco visíveis. Evite bolhas durante a trituração.
  5. Deixe as partículas remanescentes precipitarem-se na parte inferior do tubo de microcentrifuuagem pela gravidade. Sem escoar o precipitado na parte inferior, colete o supernatante em um tubo vazio de polipropileno cônico de 15 mL.
  6. Diluir FBS/DNase I do passo 3.3 (98:2) com 1.000 μL de HBSS para obter FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Misture por pipetting para cima e para baixo. Adicione 1.000 μL da nova mistura às partículas restantes no tubo de microcentrifuuagem. Triturar novamente e repetir o passo 3.5.
  7. Repita a etapa anterior mais uma vez para usar todos os FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
  8. Uma vez que todo o supernaspe é coletado dentro do tubo de 15 mL (das etapas 3.5, 3.7 e 3.8), use uma centrífuga de mesa para girar o supernascido (~3 mL) a 100 x g,por 5 minutos. Remova o supernatante sem tocar nas células de pelotização na parte inferior.
  9. Lave a pelota celular adicionando 2 mL de DPM ao tubo e gire-a a 100 x g por 5 min. Remova o sobrenante e repita a lavagem 2x para minimizar os detritos nas células pelleted.
    NOTA: Use sempre DPM fresco e aquecido para os neurônios cultivados. Para as etapas de lavagem, o DPM não precisa ser fresco, mas deve ser pré-armado a 37 °C.
  10. Diluir as células com DPM fresco e quente e transferi-las para um tubo de microcentrífuga. A quantidade de DPM para diluição depende do número de embriões utilizados para dissecção tecidual. Por exemplo, use 150 μL de DPM para diluir as células obtidas a partir de dez embriões.
  11. Transfira 10 μL de células em DPM para um tubo de microcentrífuga. Misture-os com 10 μL de 0,4% de mancha azul trypan. Conte células ao vivo (ou seja, azul trypan negativo) usando um hemótmetro ou um contador de células automatizado.
    NOTA: Use 30.000 células para chapeamento por poço para obter ~1.000 neurônios de dopamina por poço. Se a densidade celular for superior a ~30.000 células por 6 μL, dilui ainda mais as células com DPM antes de chapeamento para que o volume de semeadura não seja inferior a 6 μL.
  12. Sem tocar na parte inferior dos poços, remova o DPM das micro ilhas criadas na etapa 1.6.
  13. Para obter densidade celular reprodutível em cada poço, misture as células por tubulação suave antes de chapeamento no poço. Com uma micropipette de 1 a 10 μL, adicione 6 μL de células ao meio do poço, na localização de cada antiga micro-ilha.
  14. Encha os poços vazios nas bordas da placa com 150 μL de água ou 1x PBS para minimizar a evaporação dos poços que contêm culturas neuronais. Incubar a placa em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 por 1 h.
  15. Depois de 1h, retire a placa da incubadora, adicione 100 μL de DPM em cada poço com células e coloque-a de volta na incubadora.
  16. Dois dias após o revestimento (dia in vitro 2, ou DIV2), remova 25 μL e adicione 75 μL de DPM fresco para levar o volume final de mídia a 150 μL e evitar a evaporação tanto quanto possível.
  17. Troque metade do meio com DPM fresco (ou seja, remova 75 μL e adicione 75 μL dpm fresco) no DIV5. Não realize alterações de mídia após o DIV5.

4. Indução de agregados de α-sinucleína em neurônios de dopamina embrionária primária por semeadura com fibrilas pré-formadas

Os protocolos de obtenção e validação de PFFs foram meticulosamente descritos e discutidos em diversas publicações recentes11,,28,,29,,30. Seguindo qualquer trabalho com PFFs, limpe o capô laminar ou qualquer equipamento que possa ter contatado os PFFs com 1% de SDS, depois com 70% de etanol31.

  1. Antes do experimento, diluir os PFFs com 1x PBS para uma concentração final de 100 μg/mL. Sonicar os PFFs diluídos em tubos de microcentrifuge com um sônico de banho em alta potência com resfriamento de banho de água a 4 °C para 10 ciclos, 30 s ON/30 s OFF.
    NOTA: É fundamental que as fibrilas sejam devidamente sônicas para gerar fragmentos de ~50 nm de comprimento. O tamanho dos PFFs sonicados pode ser medido diretamente a partir de imagens de microscópio eletrônico de transmissão de PFFs manchadas como descrito por Patterson et al.30. A sônica pode ser alcançada como descrito acima em um sônico de banho de alta potência. Alternativamente, um sônico de ponta pode ser usado30. Os PFFs sonicados podem ser armazenados a -80 °C em pequenas alíquotas para evitar vários ciclos de congelamento/descongelamento.
  2. No DIV8, adicione 3,75 μL de 100 μg/mL de PFFs por poço aos 150 μL de médio no poço a uma concentração final de 2,5 μg/mL. Use a mesma quantidade de 1x PBS para o grupo de controle.
  3. Prepare 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS e armazene as alíquotas a -20 °C. Para isso, siga os passos abaixo.
    NOTA: A PFA é tóxica; usar máscara e luvas durante a preparação, trabalhar sempre sob um capô laminar e descartar todos os resíduos de PFA sólidos e líquidos de acordo com as instruções da instituição.
    1. Aqueça 500 mL de 1x PBS em um vaso 1 L. Coloque uma barra de mexida no vaso e coloque o vaso em um agitador magnético com uma função de aquecimento. Ajuste a temperatura entre 40-60 °C para evitar a ebulição, mantendo a solução aquecida.
    2. Meça 20 g de pó PFA sob o capô em um recipiente de medição de plástico descartável. Cuidadosamente, adicione o pó PFA no vaso cheio de 1x PBS. Comece a mexer na solução.
    3. Adicione 200 μL de hidróxido de sódio de 5 M na solução e continue mexendo por ~15 min, até que o PFA se dissolva completamente.
    4. Após a solução parecer homogênea, adicione 168 μL de cloreto de hidrogênio de 5 M para equilibrar o pH a ~7. Verifique o pH com tiras de indicador de pH fixas de cor descartáveis.
    5. Remova o vaso do aquecedor e deixe esfriar para RT. Filtre a solução e a alíquota para armazenamento a -20 °C. Descongele as alíquotas no RT antes do uso e não congele novamente depois.
  4. No DIV15, remova todas as mídias dos poços por pipetação. Adicione 50 μL de 4% de PFA a cada poço para corrigir as células e incubar por 20 min na RT. Após a incubação, remova o PFA dos poços e adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço para lavar as células. Remova 1x PBS e lave 2x a mais.
  5. Deixe 100 μL de 1x PBS em cada poço para evitar a secagem. Armazene a placa a 4 °C até que a imunoquímica seja realizada.

5. Coloração imunofluorescente e imagem automatizada de neurônios de dopamina embrionária primária em 96 placas de poço

  1. Remova 1x PBS e permeabilize as células adicionando 100 μL de 0,2% Triton X-100 em PBS (PBST) por poço e incubando em RT por 15 minutos.
  2. Remova o PBST e adicione 50 μL de 5% de soro de cavalo normal (NHS) por poço ao PBST. Para bloquear a atividade de antígeno inespecífico, incubar na RT por 1h.
  3. Diluir os anticorpos primários contra TH e pS129-αsyn (1:2.000) em 5% DE NHS no PBST. Adicione 50 μL de anticorpos diluídos a cada poço e incubar durante a noite a 4 °C.
  4. Remova os anticorpos e adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço para lavar as células. Remova 1x PBS e repita a lavagem 2x.
  5. Para evitar o branqueamento de moléculas fluorescentes, comece a trabalhar em condições mínimas de luz. Diluir os anticorpos rotulados fluorescentes secundários (1:400) em PBST. Adicione 50 μL de anticorpos diluídos a cada poço e incubar em RT por 1h.
  6. Remova a solução de anticorpos e adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço para lavar as células. Remova 1x PBS e repita a lavagem 2x.
  7. Remova 1x PBS, adicione 50 μL de 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) por poço para manchar os núcleos das células cultivadas e incubar na RT por 10 minutos.
  8. Lave as células 3x com 100 μL de 1x PBS por 5 min cada. Mantenha 100 μL de 1x PBS em cada poço após a última lavagem. Cubra a placa com papel alumínio e armazene-a a 4 °C até a imagem.
  9. Imagem neurônios embrionários primários de dopamina em uma placa de visão de poço 96 com um scanner de placa de alto teor (ver Tabela de Materiais) equipado com um objetivo de 10x.
  10. Ajuste as configurações com base nas especificações da placa 96, como tipo de placa, fabricante, tamanho, distância entre os poços, bem como tipo e quantidade de meio.
  11. Selecione a área de imagem do poço para cobrir todas as células em uma micro ilha. Escolha bem um exemplo para ajustar o foco automático. Basear o foco inicial no DAPI.
  12. Calibrar o tempo de aquisição de cada canal fluorescente, com base na intensidade das manchas nos poços de controle. Ajuste os parâmetros para que em poços de controle tratados com PFF se possa distinguir claramente células de dopamina que abrigam agregados pS129-αsyn em soma celular permitindo quantificação inequívoca de células positivas pS129-αsyn e pS129-αsyn.
    NOTA: Os poços que não contêm PFFs não devem ter nenhuma mancha para pS129-αsyn; portanto, esses poços podem ser usados como controle negativo para ajustar a intensidade pS129-αsyn.
  13. Imagem todos os poços selecionados com um objetivo de 10x simultaneamente para todos os canais com coloração de imunofluorescência com exatamente os mesmos parâmetros.
  14. Opcionalmente, as inclusões de α-sinucleína em um subconjunto dos poços com anticorpos específicos para fismotorias α-sinucleína para confirmar que mudanças no número de inclusões pS129-αsyn-positivas refletem a redução do acúmulo de proteínas em vez de inibição de fosforilação ou desfosforilação de pS129-αsyn.
  15. Repita o passo 5.3 substituindo pS129-αsyn anticorpo com anticorpo filamento α-sinucleína (1:2.000). Imagem a α-sinucleína manchada agregada como na etapa 5.13.

6. Análise de imagem de alto conteúdo

NOTA: Esta etapa é realizada com o software de acesso aberto CellProfiler versão 3.15 e CellProfiler Analyst versão 2.2.1. 27,32. No entanto, com alguma experiência, os pipelines de análise de imagem análogos poderiam ser definidos em uma versão diferente ou software semelhante. Consulte a página do software para obter uma explicação detalhada (ver Tabela de Materiais).

  1. Baixe e instale o software CellProfiler e CellProfiler Analyst.
  2. Abra cellProfiler. Selecione Arquivo| Importação| Pipeline a partir de arquivo e carregar o pipeline de exemplo fornecido, arquivo TH_LB_V1.cpipe (ver os Arquivos Suplementares).
    NOTA: Os pipelines de exemplo exigirão ajustes específicos dependendo das propriedades das imagens adquiridas e da plataforma de aquisição de imagens. Example_Imagespode ser usado para o teste inicial do software.
  3. Carregue imagens a serem analisadas arrastando-as para o módulo Imagens. Use opções de filtro para selecionar apenas arquivos de imagem da pasta carregada.
    1. Use o módulo Metadados para extrair bem, campo de exibição e informações do canal a partir do nome do arquivo da imagem. Clique no símbolo da lupa e digite a expressão regular para extrair informações de placa, bem, site de imagem e canal de nomes de arquivos.
      NOTA: A expressão regular dependerá da convenção de nomeação de arquivos do microscópio de placa. Clicar no ponto de interrogação ao lado da lupa fornecerá detalhes da sintaxe.
    2. Em NamesAndTypes módulo, selecione os números de canais corretos para manchas DAPI, TH e pS129-αsyn(canais padrão 1, 2e 3). No módulo Grupos, selecione "Não".
  4. Use módulos IdentifyPrimaryObjects para segmentar neurônios de dopamina usando a coloração th da soma celular.
    NOTA: Valores específicos exigirão otimização inicial com base na forma como as placas são manchadas e imagens. Se as placas subsequentes forem processadas de forma semelhante, nenhum ou mínimo ajustes adicionais serão necessários.
  5. Use o módulo MeasureObjectIntensity para adquirir informações de intensidade de fluorescência dos canais TH e DAPI.
  6. Use o módulo MeasureObjectSizeShape para medir as características de tamanho e forma dos neurônios de dopamina do segmento.
  7. Use o módulo MeasureTexture para medir as informações do recurso de textura do canal TH de neurônios segmentados de dopamina.
  8. Use o módulo ExportToDatabase para salvar medições no banco de dados.
    1. Arquivo de banco de dados de nome de acordo com o esquema de nomeação do experimento (por exemplo, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Selecione Pasta de saída para o arquivo de banco de dados. O arquivo de banco de dados pode ser vários gigabytes grandes e deve ser salvo preferencialmente na pasta pai dos arquivos de imagem.
  9. Abra o CellProfiler Analyst e selecione o arquivo V1_THCells.properties criado na etapa 6.8. Ferramentas Abertas| Classificador.
  10. Classificar células segmentadas em duas categorias: positiva (ou seja, corpos celulares de neurônios de dopamina corretamente segmentadas) e negativa (ou seja, artefatos de segmentação e coloração) Ver Figura 2A e 2B.
    1. Defina o número de células buscadas para 50 células aleatórias e clique em Buscar (isso carrega imagens das células segmentadas na etapa 6.4). Classifique pelo menos 30 células em cada lixeira arrastando-as para a caixa correspondente na parte inferior da janela. Busque mais células conforme necessário.
    2. No menu suspenso selecione Usar o Fast Gentle Boosting com 50 regras máximas e clique em Trem.
    3. Defina "Buscar" para 50 células positivas e pressione Buscar para obter células TH positivas de acordo com o classificador (Figura 2A). Utilize o resultado obtido para avaliar a qualidade do classificador treinado.
    4. Repetição de passos 6.10.1-6.10.3, adicionando novas células de exemplo para treinar o classificador até que os resultados sejam satisfatórios.
    5. Selecione Avançado| Editar regras... e em uma nova janela selecione todo o texto (Ctrl+a) e copie-o (Ctrl-c) para bloco de notas (Ctrl-v). Salvar como TH_rules.txt arquivo.
      NOTA: Dependendo da densidade da cultura neuronal e da qualidade da coloração e imagem, esta etapa pode não ser necessária, pois pode ser possível definir parâmetros na etapa 6.4 para segmentar apenas células TH positivas com alta precisão. Se esse for o caso, não é necessário um TH_LB_V1.cpipe completo, e os parâmetros corretos dos módulos IdentifyPrimaryObjects devem ser colocados diretamente no módulo correspondente em TH_LB_V2.cpipe.

figure-protocol-2
Figura 2: Quantificação de neurônios de dopamina e neurônios pS129-αsyn positivos de dopamina com software cellprofiler analyst baseado em DAPI, TH e pS129-αsyn imunofluorescence. ( A )Ascélulas TH na caixa positiva foram selecionadas com base na coloração DAPI (azul) marcada com um pequeno quadrado na primeira célula selecionada na imagem e a coloração th circundante (cinza) em soma. (B) Artefatos não celulares foram colocados na lixeira negativa. (C) pS129-αsyn neurônios TH positivos foram selecionados com base na grande inclusão da coloração pS129-αsyn (vermelho) marcada com um pequeno quadrado na primeira célula selecionada na imagem, em torno dos núcleos ou na soma celular. (D) Células TH sem tais inclusões pS129-αsyn foram colocadas na lixeira negativa. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Abra o CellProfiler e selecione Arquivo| Importação| Pipeline de arquivo e carga TH_LB_V2 arquivo.cpipe. Repetição de passos 6.3-6.7. Esta parte do gasoduto deve ser idêntica à TH_LB_V1.cpipe.
  2. Use o módulo FilterObjects para passar apenas células verdadeiras th positivas para análise posterior.
    1. Defina selecionar modo de filtragem para Regras. Em Regras ou nome de arquivo classificador selecione o arquivo TH_rules.txt criado na etapa 6.10.5.
    2. Defina o campo de número classe para 1 se as células TH positivas foram classificadas na janela inferior esquerda.
  3. Use o módulo MeasureObjectIntensity para adquirir informações de intensidade de fluorescência do canal pS129-αsyn.
  4. Use o módulo MeasureTexture para medir as informações do recurso de textura do canal TH a partir de células filtradas.
  5. Use o módulo MeasureObjectSizeShape para medir o tamanho e os recursos de forma das células filtradas.
  6. Use o módulo ExportToDatabase para salvar medições no banco de dados.
    1. Arquivo de banco de dados de nomeação de nomeação de nomeação de seu experimento (por exemplo, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Selecione a pasta de saída para arquivo de banco de dados.
  7. Abra o CellProfiler Analyst e selecione arquivo V2_THpos.properties.
    1. Classificar células segmentadas em duas categorias – pS129-αsyn positiva e pS129-αsyn células negativas(Figura 2C,D).
    2. Defina o número de células buscadas para 50 células aleatórias e clique em Buscar (isso carrega imagens de células segmentadas na etapa 4). Classifique pelo menos 30 células em cada lixeira arrastando-as para a caixa correspondente na parte inferior da janela.
    3. No menu suspenso, selecione Usar o Fast Gentle Boosting com 50 regras máximas rules ou classificadores random forest. Clique em Trem.
    4. Defina "Buscar" para 50 células positivas e pressione Fetch para obter células pS129-αsyn positivas de acordo com o classificador(Figura 2C). Defina "Buscar" para 50 células negativas e pressione Buscar para obter células negativas pS129-αsyn de acordo com o classificador(Figura 2D). Avalie a qualidade do classificador treinado.
    5. Repetição de passos 6.17.2-6.17.4, adicionando novas células de exemplo para treinar o classificador até que os resultados sejam satisfatórios.
  8. Clique em Score All para obter resultados tabela resumindo número de neurônios pS129-αsyn positivos e negativos dopamina em cada poço.

Resultados

Poucos dias após o revestimento (DIV1-DIV3), foi feita a microscopia de campo brilhante para avaliar a saúde e a disseminação homogênea das células cultivadas, e a uniformidade dessas condições nos poços individuais(Figura 3). As células de cérebro médio cultivadas foram espalhadas de forma homogênea dentro da micro-ilha criada antes do revestimento (Figura 3A,B). Os neurônios primários tinham se estabelecido no solo revestido de forma homogênea e estabeleceu projeções neuronais(Figura 3B). Uma pequena aglomeração de células (diâmetro menor que 150 μm) foi observada no poço e mostrada como exemplo(Figura 3C).

figure-results-1
Figura 3: Poucos dias após o revestimento (por exemplo, DIV3), a condição das culturas primárias do cérebro médio foram observadas com microscopia de campo brilhante. (A) Células cultivadas espalhadas pelo meio do poço dentro da micro-ilha revestida de PO com um raio aproximado de 4,4 mm (mostrado com setas brancas) criadas por arranhar PO de aproximadamente 1 mm de perímetro bem (mostrado com setas pretas). (B) Foram observadas neurônios primários cultivados homogeneamente espalhados dentro da área e foram observadas projeções neuronais (marcadas com pontas de flechas vermelhas). (C) Uma célula moída com diâmetro menor que 150 μm é marcada com pontas de flecha azul. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As culturas primárias do cérebro médio do camundongo foram imunos detidas com anticorpos anti-TH e anti-pS129-αsyn e imagens com um microscópio automatizado após 15 dias in vitro. Microestudos revestidos forneceram área restrita para a fixação de células no meio de poços (Figura 4A,B). Os neurônios de dopamina imunolabeled com marcador TH foram espalhados ao redor da micro ilha em uma monocamada, separados um do outro, sem qualquer clumping(Figura 4A' e 4B').

figure-results-2
Figura 4: No DIV15, 800-1.000 células de dopamina foram quantificadas de cada micro-ilha, com ou sem tratamento PFF. Imagens representativas de culturas embrionárias do cérebro médio imonustained com anticorpos anti-TH e anti-pS129-αsyn. (A, A', A'') Células de controle sem tratamento PFF. (B, B', B'') Células tratadas com PFF com inclusões pS129-αsyn. (C) Quantificação de números de células TH-positivos em poços tratados com veículos (controle), PFFs ou PFFs com 50 ng/mL GDNF. (D) Quantificação de agregados pS129-αsyn em células TH-positivas tratadas com veículo (controle), PFFs ou PFFs com 50 ng/mL GDNF. A significância estatística foi calculada com o desenho de blocos aleatórios ANOVA. **p < 0,01, n = 4 placas individuais (réplicas biológicas), cada uma com 3-6 poços por grupo de tratamento (repetições técnicas). Barras de escala = 300 μm para A, B; 50 μm para A', B'; 25 μm para A'', B''. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enquanto as culturas sem tratamento de PFF não tinham nenhum sinal pS129- αsyn(Figura 4A' e 4A',culturas tratadas com PFFs α-sinucleína desenvolveram inclusões positivas pS129-αsyn(Figura 4B' e 4B''). O tratamento in vitro de PFF por 7 dias não causou nenhuma diminuição significativa no número de neurônios TH positivos, em comparação com outros grupos experimentais(Figura 4C). As culturas tratadas com PFF tinham uma população de ~40% dos neurônios de dopamina th positivos pFF. O tratamento com controle positivo, GDNF, reduziu o percentual de neurônios de dopamina TH positivos com inclusões positivas pS129-αsyn(Figura 4D,veja também os dados brutos e as imagens de exemplo nos Arquivos Suplementares).

Arquivos suplementares: Exemplos de pipelines para análise de imagens de alto conteúdo com o CellProfiler e os pacotes de software CellAnalyst, imagens de exemplo e dados brutos para figura 4E, F. (1-9) Example_Images. Abra essas imagens com ImageJ ou CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Etapas 6.2-6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Etapas 6.11-6.18) Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A disseminação da patologia lewy, da qual pS129-αsyn é um dos principais constituintes, é uma marca histopatológica da DP. Parar ou retardar o acúmulo de pS129-αsyn agregado pode retardar a degeneração dos neurônios da dopamina e a progressão da alfa-sinucleinopatia. No entanto, uma compreensão mecanicista de como a agregação pS129-αsyn contribui para o fim dos neurônios de dopamina ainda precisa ser estabelecida. Evidências de estudos pós-morte humanos em amostras cerebrais de pacientes em diferentes estágios da doença, bem como observação da inclusão positiva de pS129-αsyn em neurônios fetais transplantados sugerem fortemente a disseminação da patologia lewy entre as células16,,17,,33. Consequentemente, a disseminação em forma de prímion de pS129-αsyn foi recentemente recapitulada usando PFFs α-sinucleína9,,10. Estabelecer um modelo robusto, econômico e relativamente alto ou médio de difusão e acumulação de pS129-αsyn, especificamente em neurônios de dopamina, pode acelerar consideravelmente a busca por novos tratamentos e compostos que modifiquem esse processo.

Como a perda de neurônios de dopamina é a principal causa dos sintomas motores em DP e essas células possuem muitas propriedades únicas2,,34,35, modelagem de propagação de pS129-αsyn em neurônios de dopamina é o tipo de modelo mais relevante da perspectiva translacional. Protocolos utilizando culturas micro-ilhas de neurônios midbrain embrionários em 4 placas de poço e quantificação semiautomática foram descritos anteriormente18. O protocolo descrito aqui foi adaptado a 96 placas de poços e fornece uma preparação menos trabalhosa de micro ilhas, permitindo a preparação de até quatro placas contendo 60 poços cada por um pesquisador experiente durante um dia de trabalho. A colheita de neurônios de dopamina em 96 placas de poço permite testar drogas em quantidades mais baixas e permite altas taxas de transdução com vetores de lentivírus. Também é possível combinar diferentes tratamentos para realizar experimentos mais complexos.

Antes de aplicar quaisquer tratamentos (incluindo FPF), a qualidade da cultura deve ser verificada com microscopia de campo brilhante. Se o sistema de microscopia não utilizar uma câmara de CO2 com aquecimento, as células não devem ser mantidas fora da incubadora por mais de alguns minutos, porque os neurônios primários de dopamina do rato são delicados e facilmente estressados. Pelo mesmo motivo, é aconselhável que a primeira imagem deve ser feita após 24 horas de incubação (entre DIV1-DIV3). As células devem parecer estar vivas com corpos celulares atuais e se espalharem homogêneamente dentro da micro-ilha. Neurônios primários teriam se estabelecido no solo revestido de PO e começado a estabelecer projeções neuronais. É possível observar uma pequena moita de células (ou seja, diâmetro menor que 150-200 μm) que podem ser formadas se o processo de trituração não for feito corretamente ou a densidade de revestimento for maior do que o recomendado. Esses pequenos aglomerados não afetariam o experimento, a menos que sejam mais do que alguns por poço e/ou maiores. Células agrupadas tornam muito difícil identificar marcadores imunohistoquímicos e células individuais durante a análise da imagem. É essencial evitar tais aglomerados por meio de revestimento cuidadoso, trituração e controle da densidade de revestimento. Se a uniformidade dessas condições não pode ser observada em certos poços, não inclua esses poços defeituosos no experimento. Tal exclusão deve ser feita antes da execução de qualquer tratamento.

Além disso, a utilização de 96 placas de poço permite o uso conveniente de pipeta multicanal durante os procedimentos de coloração e visualização direta com microscópios automáticos de placa, aumentando ainda mais o rendimento. A utilização da quantificação automatizada de imagens é indispensável para a análise dos dados de plataformas de imagem de alto conteúdo. Além da capacidade de processar milhares de imagens obtidas a partir de cada experimento, garante quantificação imparcial e idêntica de todos os grupos de tratamento. O fluxo de trabalho proposto para a análise de imagem baseia-se em princípios simples de segmentação de neurônios de dopamina, filtragem corretamente segmentada por aprendizado de máquina supervisionado e, posteriormente, quantificação de fenótipos (pS129-αsyn positivo e pS129-αsyn negativo), novamente por aprendizado de máquina supervisionado. Embora várias abordagens diferentes para esta tarefa possam ser imaginadas, descobrimos que a combinação de segmentação com aprendizado de máquina é a mais robusta para culturas de dopamina devido à alta densidade de chapeamento, as diversas formas de neurônios de dopamina e a presença de neurites fortemente manchados. O algoritmo de análise de imagem proposto foi implementado no CellProfiler e no CellProfiler Analyst, de código aberto, disponível gratuitamente no software de análise de imagens de alto conteúdo26,27. O algoritmo também pode ser implementado com outros softwares de análise de imagem, seja de código aberto (por exemplo, ImageJ/FIJI, KNIME) ou proprietários. No entanto, em nossa experiência, essas capacidades de personalização muitas vezes sacrificam para facilitar o uso e, portanto, podem não ter um bom desempenho em análises complicadas. Descobrimos que os pacotes de software CellProfiler e CellProfiler Analyst dão resultados particularmente confiáveis, combinando um número substancial de algoritmos implementados, extrema flexibilidade na concepção do fluxo de trabalho e, simultaneamente, manipulando e processando eficientemente dados de imagem de alto conteúdo.

O protocolo descrito também poderia ser adaptado para quantificação de outros fenótipos celulares caracterizados por imunostaining com diferentes anticorpos, como marcadores de outras populações neuronais (por exemplo, DAT, GAD67, 5-HT etc.) e agregados proteicos (por exemplo, fospo-Tau, ubiquitina). Múltiplos marcadores fluorescentes também poderiam ser combinados para distinguir vários fenótipos (por exemplo, células com inclusões em diferentes estágios de maturação). A classificação automatizada de vários fenótipos também deve ser fácil de implementar nos pipelines de análise de imagem descritos, apenas adicionando um canal contendo imagens imunofluorescentes de marcadores adicionais para medidas e células de classificação em várias lixeiras. A utilização de múltiplos marcadores ao mesmo tempo exigiria, no entanto, a otimização das condições de imunossuagem e imagem. Além disso, para uma melhor qualidade em imagens de imunofluorescência, recomenda-se o uso de placas especiais de 96 poços de paredes pretas explicitamente projetadas para o microscópio fluorescente. No entanto, estes podem ser consideravelmente mais caros do que as placas de cultura celular padrão, que são suficientes para a análise descrita em nosso protocolo.

O tipo e a qualidade dos PFFs utilizados são fundamentais para o resultado dos experimentos. Os PFFs podem tanto afetar a robustez do ensaio quanto a interpretação dos resultados. As condições de preparação podem afetar a eficiência de semeadura dos PFFs e, de fato, foram relatadas "cepas" de PFF com diferentes propriedades fisiológicas36. No entanto, a preparação e validação dos PFFs estão fora do escopo deste artigo e foram descritas em diversas publicações11,,28,,29,,30. Além do protocolo de preparação, devem ser consideradas as espécies de origem da α-sinucleína em PFFs (por exemplo, camundongo, humano) e o uso de proteína silvestre ou mutada (por exemplo, a α-sinucleína humana A53T) e as condições experimentais particulares. A indução do acúmulo de pS129-αsyn por PFFs mostrou-se dependente da idade da cultura (ou seja, dias in vitro), com culturas mais maduras mostrando indução mais pronunciada11. Isso provavelmente se deve ao aumento do número de conexões neuronais em culturas mais maduras, e ao aumento dos níveis de proteína α-sinucleína. Em nossas mãos, o tratamento com FPFs em DIV8 deu os resultados mais robustos, com acúmulo pronunciado de pS129-αsyn em dopamina neurônio soma, sem comprometer a sobrevivência neuronal. O protocolo descrito é adequado para estudar tratamentos que modificam eventos precoces que levem à agregação de α-sinucleína endógena porque quantificamos as inclusões positivas pS129-αsyn em um ponto de tempo relativamente precoce, 7 dias após a inoculação com PFFs. Neste momento, as inclusões intrassômicas estão presentes em uma fração significativa de células e podem ser facilmente distinguidas pela imunostaining enquanto nenhuma morte celular induzida por PFF é observada, simplificando a interpretação dos resultados. É importante ressaltar que, como a morfologia e a composição das inclusões induzidas pelo PFF podem mudar ao longo do tempo12,13, o protocolo descrito poderia, em princípio, ser modificado para estudar inclusões mais maduras por fixação e imunossuagem em momentos posteriores. No entanto, manter os neurônios de dopamina na cultura por mais de 15 dias requer cuidados extremos, e pode induzir variação adicional devido às células que não sobrevivem independentemente da inoculação de PFF. Além disso, culturas mais estendidas complicam os horários de tratamento de drogas. Muitos compostos têm estabilidade limitada ou não mal caracterizada no meio da cultura celular, e a reposição de uma droga não é trivial porque a troca completa de meio compromete a sobrevivência das culturas de dopamina.

A fosforilação da α-sinucleína em Ser129 é consistentemente relatada em modelos baseados em PFF de agregação de α-sinucleína e colocalize com marcadores de dobras e agregação incorretas como Thioflavin S, ubiquitina ou anticorpos específicos de conformação11,12. Em nossas mãos, a imunostaining para pS129-αsyn também dá o sinal mais forte com o menor fundo e é mais simples de analisar, dando resultados robustos quando múltiplos tratamentos são rastreados. É importante ressaltar que a imunostaining com anticorpo pS129-αsyn não detecta PFFs que permanecem fora das células, reduzindo significativamente o fundo. No entanto, é importante lembrar que a fosforilação ser129 é provavelmente um dos processos mais antigos ligados ao descomposto da α-sinucleína e pode ser regulada de forma diferente em condições específicas. Portanto, quaisquer achados que mostrem efeitos positivos sobre pS129-αsyn devem ser confirmados por outros marcadores.

A análise estatística deve ser adaptada correspondentemente ao design experimental. É essencial realizar experimentos em pelo menos três réplicas biológicas independentes (ou seja, culturas neuronais primárias separadas). Estas réplicas devem ser banhadas em diferentes placas e tratadas de forma independente. Analisamos os dados obtidos a partir de réplicas em diferentes placas com design de bloco aleatório ANOVA37 para levar em conta o emparelhamento de dados para diferentes placas experimentais.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Prof. Kelvin Luk por seu generoso dom de PFFs de α-sinucleína, Conjung Zheng por estabelecer eculturar células neuronais, e a Unidade de Microscopia Leve do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Helsinque, por imagens de células imunossuculturais. Este trabalho foi apoiado por subsídios da 3i-Regeneration by Business Finland (Agência Finlandesa de Financiamento para Inovação), Academia da Finlândia #309489, #293392, #319195; Fundação Sigrid Juselius, e os fundos estatutários do Instituto Maj de Farmacologia, PAS, Polônia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% de mancha azul de tripanoGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA15250061
Tubo de polipropileno CELLSTAR de 15 mlGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA10236276001
5 M HClN/AN/ACozinha de mídia, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsinque
5 M NaOHN/AN/ACozinha de mídia, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsinque
96 poços ViewPlate (Preto)PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA6005182
99,5% de etanol (EtOH)Altia Oyj, Rajamä ki, FinlândiaN/A
AquaSil Siliconizing FluidThermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USATS-42799
Tubo de microcentrífuga autoclavado de 1,5 mlN/A N/AMedia kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia Dispositivo de
sonicação BioruptorDiagenode, Liège, BélgicaB01020001
Ca2+, Mg2+ free Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA14175-053
Pacotes de software CellProfiler e CellAnalystN/AN/Asoftware livre de código aberto
Centrifuge 5702Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha5702000019
Incubadora de CO2HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUAN/A
Câmara de contagemBioRad Inc., Hercules, Califórnia, EUA1450015
Microscópio de ultra-alta resolução DeltaVision com mesa de ar e gabineteGE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, EUA29254706
Desoxirribonuclease-I (Dnase I)Roche, Basel, Suíça22098700
D-glicoseSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUAG8769
DMEM/F12Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA21331– 020
burro anti-rato AlexaFluor 488Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUAA21202
burro anti-coelho AlexaFluor 647Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUAA31573
burro anti-ovelha AlexaFluor 488Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUAA11015
Tampão de DulbeccoN/AN/AMedia kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsínquia
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Barfisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA11507582
ImageXpress Nano Automated Imaging SystemMolecular Devices, San Jose, Califórnia, EUAN/A
L-glutaminaGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA25030– 032
camundongo monoclonal anti-tirosina hidroxilaseMillipore, Merck KGaA, Darmstadt, alemãoMAB318
N2 suplementoGibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA17502– 048
Normal Horse SerumVector Laboratories Inc., Burlingame, Califórnia, Estados UnidosS-2000
paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA158127
pó de paraformaldeído, 95%Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA158127
pH-Fix, tiras indicadoras de cor fixaMacherey-Nagel, Dü ren, Alemanha92110
Tampão de fospoato salino (PBS)N / AN / AMedia kitchen, Instituto de Biotecnologia, Universidade de Helsinque
poli-L-ornitinaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUAP4957
PrimocinInvivoGen, San Diego, Califórnia, EUAant-pm-1, filamento
Abcam, Cambridge, Reino Unidoab209538
coelho monoclonal anti-fosfo-serina129-alfa-sinucleínaAbcam, Cambridge, Reino Unidoab51253
RCT Basic, IKA Magnetic StirrerIKA®-Werke GmbH, Staufen, Alemanha3810000
fator neurotrófico derivado da glia humana recombinante (hGDNF)PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA ou Prospec, Ness-Ziona, Israel450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
alfa sinucleína de camundongo recombinante Fibrilas pré-formadas (PFFs)N / AN / APresente do colaborador, Prof. Kelvin C Luk
Research Stereomicroscope SystemOlympus Corporation, Tóquio, JapãoSZX10
ovelhas policlonal anti-tirosina hidroxilaseMillipore, Merck KGaA, Darmstadt, alemãoab1542
TC 20 Automatizado Contador de célulasBioRad Inc., Hércules, Califórnia, EUA1450102
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA11332481001
tripsinaMP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China2199700
monoclonal anti-alfa-sinucleína de coelho ant-pm-2

Referências

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