Este protocolo descreve um sistema de cultura dinâmica para produzir agregados de tamanho controlado de células-tronco pluripotentes humanas e estimular ainda mais a diferenciação em organoides cerebelares sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores usando um bioreator de uso único.
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Artigo de método
Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining
Neste artigo
Resumo
Resumo
O cerebelo desempenha um papel crítico na manutenção do equilíbrio e coordenação motora, e um defeito funcional em diferentes neurônios cerebelares pode desencadear disfunção cerebelar. A maior parte do conhecimento atual sobre fenótipos neuronais relacionados à doença é baseado em tecidos pós-morte, o que dificulta a compreensão da progressão e desenvolvimento da doença. Modelos animais e linhas celulares imortalizadas também têm sido usados como modelos para distúrbios neurodegenerativos. No entanto, eles não recapitulam totalmente a doença humana. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) têm grande potencial para modelagem de doenças e fornecem uma fonte valiosa para abordagens regenerativas. Nos últimos anos, a geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs derivados do paciente melhorou as perspectivas de modelagem de doenças neurodegenerativas. No entanto, faltam protocolos que produzam um grande número de organoides e um alto rendimento de neurônios maduros em sistemas de cultura 3D. O protocolo apresentado é uma nova abordagem para a geração reprodutível e escalável de organoides derivados do iPSC humanos em condições quimicamente definidas usando bioreatores escaláveis de uso único, nos quais os organoides adquirem identidade cerebelar. Os organoides gerados são caracterizados pela expressão de marcadores específicos tanto no nível mRNA quanto no nível da proteína. A análise de grupos específicos de proteínas permite a detecção de diferentes populações de células cerebelares, cuja localização é importante para a avaliação da estrutura organoide. Criosectioning organoide e imunostaining de fatias organoides são usados para avaliar a presença de populações específicas de células cerebelares e sua organização espacial.
Introdução
O surgimento de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) representa uma excelente ferramenta para a medicina regenerativa e modelagem de doenças, pois essas células podem ser diferenciadas na maioria das linhagens celulares do corpo humano1,,2. Desde sua descoberta, a diferenciação do PSC utilizando diversas abordagens tem sido relatada para modelar diferentes doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recentemente, houve relatos de cultu....
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Protocolo
1. Passagem e manutenção de iPSCs humanos na cultura monocamadas
- Preparação de placas
- Descongele a matriz de membrana do porão (ver Tabela de Materiais) estocar a 4 °C e preparar alíquotas de 60 μL. Congele as alíquotas a -20 °C.
- Para revestir os poços de uma placa de 6 poços, descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão no gelo. Uma vez descongelado adicione 60 μL a 6 mL de DMEM-F12. Levemente resuspend por pipetting para cima e para baixo.
- Adicione 1 mL de solução de matriz de membrana de porão diluída a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar na RT por pelo menos 1 h antes de passar ou armazenar....
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Resultados
O protocolo foi iniciado pela promoção da agregação celular utilizando os bioreatores 0,1 L (Figura 1A). Foi realizada a inoculação de célula única dos iPSCs, com 250.000 células/mL semeadas em 60 mL de médio com velocidade de agitação de 27 rpm. Isso foi definido como o dia 0. Após 24 h, as células formaram eficientemente agregados em forma de esfóide (dia 1, Figura 1B), e a morfologia foi bem mantida até o dia 5, com um aumento gradual de tamanho, demonstrando.......
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Discussão
A necessidade de grandes números de células, bem como condições de cultura definidas para gerar tipos de células específicas para triagem de medicamentos e aplicações de medicamentos regenerativos tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas de cultura escalável. Nos últimos anos, vários grupos relataram a geração escalável de progenitores neurais e neurônios funcionais32,,33,34, proporcionando avanços significativos no desenv.......
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Divulgações
Os autores YH e SJ são funcionários da PBS Biotech. O autor BL é CEO e co-fundador da PBS Biotech, Inc. Esses autores colaboradores participaram do desenvolvimento dos bioreatores utilizados no manuscrito. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas da revista sobre o compartilhamento de dados e materiais. Todos os outros autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho contou com o apoio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 através do Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projeto Nº 007317, PD/BD/105773/2014 para T.P.S e PD/BD/128376/2017 para D.E.S.N.), projetos co-financiados pelo FEDER (POR Lisboa 2020 —Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT através da concessão PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Geração de Organoides Cerebelares para Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. O financiamento também foi recebido do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia, sob o Acordo de Subvenção nº 739572 — O Centro....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| papel de 3MM | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - | meio do desprendimento da pilha | de 500mL Sigma |
| Anticorpo Anti-BARHL1 Anticorpo | HPA004809 | Atlas Anticorpos | |
| Anti-Calbindina D-28k Anticorpo | CB28 | Millipore | |
| M4403 | Sigma | Anti-N-Caderina | |
| 610921 | de transdução | ||
| MAB1259-SP | R& D | ||
| Anti-OLIG2 Anticorpo | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 | PRB-278P | Anticorpo Covance | |
| Anti-SOX2 | MAB2018 | R& D | |
| Anticorpo anti-TBR1 | AB2261 | Anticorpo | |
| ab183991 | Anticorpo Abcam | ||
| Anti-TUJ1 | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrina | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Meio neuronal N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Tecnologias de células estaminais | |
| quimicamente definido | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| 5470 | purificado | cristalização Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Soro fetal bovino | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatina de pele bovina | G9391 | Sigma | |
| E94 | ThermoFisher | ||
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | Presunto NZYtech | |
| ' s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T. B | WiCell | ||
| Iso-pentano | PHR1661-2ML | Sigma | |
| Ácido L-ascórbico | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Matriz de membrana basal | Corning |
| Monotioglicerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Meio de montagem | Millipore |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | de células-tronco | |
| Suplemento N2 | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldeído | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Recipiente de uso único | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Humano | |
| recombinante BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Humano recombinante bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Humano recombinante FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Humano recombinante GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| humano recombinante SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inibidor Y-27632 | 72302 | de células-tronco | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sacarose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost | 12372098 | lâminas de microscópio de adesão | ThermoFisher |
| Composto Tissue-Tek O.C.T. | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
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Reimpressões e permissões
