Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

Resumo

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (<50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Resumo

O isolamento de miócitos cardíacos ventriculares de corações animais e humanos é um método fundamental na pesquisa cardíaca. Cardiomiócitos animais são comumente isolados por perfusão coronária com enzimas digestivas. No entanto, isolar os cardiomiócitos humanos é um desafio porque os espécimes do miocárdio humano geralmente não permitem perfusão coronária, e protocolos alternativos de isolamento resultam em baixos rendimentos de células viáveis. Além disso, as amostras de miocárdio humano são raras e só estão disponíveis regularmente em instituições com cirurgia cardíaca no local. Isso dificulta a tradução de achados de cardiomiócitos animais para humanos. Descrito aqui é um protocolo confiável que permite o isolamento eficiente de miócitos ventriculares do miocárdio humano e animal. Para aumentar a relação superfície-volume, minimizando os danos celulares, as fatias de tecido miocárdio de 300 μm de espessura são geradas a partir de amostras do miocárdio com um vibratome. As fatias de tecido são então digeridas com protease e colagem. O miocárdio de rato foi usado para estabelecer o protocolo e quantificar os rendimentos de miócitos viáveis e tolerantes ao cálcio por contagem de células citométricas de fluxo. A comparação com o método de pedaço de tecido comumente utilizado mostrou rendimentos significativamente maiores de cardiomiócitos em forma de haste (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). O protocolo foi traduzido para o miocárdio humano falha e não falha, onde os rendimentos foram semelhantes aos do miocárdio de rato e, novamente, notavelmente maior do que com o método de pedaço de tecido (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 células/mg, p < 0,05). Notavelmente, com o protocolo apresentado é possível isolar números razoáveis de cardiomiócitos humanos viáveis (9-200 células/mg) de quantidades mínimas de tecido (<50 mgs). Assim, o método é aplicável ao miocárdio saudável e falhado tanto do coração humano quanto do animal. Além disso, é possível isolar miócitos excitáveis e contratuais de amostras de tecido humano armazenadas por até 36 h em solução cardioplégica fria, tornando o método particularmente útil para laboratórios em instituições sem cirurgia cardíaca no local.

Introdução

Uma técnica seminal que abriu caminho para importantes insights sobre a fisiologia do cardiomiócito é o isolamento de cardiomiócitos ventriculares vivos de corações intactos¹. Cardiomiócitos isolados podem ser usados para estudar a estrutura e função celular normal, ou as consequências de experimentos in vivo; por exemplo, avaliar alterações na eletrofisiologia celular ou acoplamento excitação-contração em modelos animais de doença cardíaca. Além disso, cardiomiócitos isolados podem ser usados para cultura celular, intervenções farmacológicas, transferência genética, engenharia de tecidos e muitas outras aplicações. Portanto, métodos eficientes....

Protocolo

Todos os experimentos com ratos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal Mittelfranken, Baviera, Alemanha. A coleta e o uso de amostras de tecido cardíaco humano foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Erlangen-Nürnberg e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.

Ratos Wistar fêmeas (150-200 g) foram obtidos comercialmente, anestesiados pela injeção de 100 mg/kg de tiopental-sódio intraperitoneal, e eutanizados por luxação cervical seguido ....

Resultados

Para verificar a eficiência do isolamento, o protocolo foi utilizado com miocárdio de rato e o número resultante de miócitos viáveis foi comparado com os números obtidos pelo isolamento via perfusão coronária e pelo isolamento de pequenos pedaços de tecido (isolamento de pedaços, Figura 2). O isolamento dos pedaços e o isolamento das fatias de tecido foram realizados dos mesmos corações. Para o isolamento via perfusão coronária, no entanto, todo o coração foi usado. A perfusão coronária rend.......

Discussão

Embora o isolamento dos cardiomiócitos vivos tenha sido estabelecido há mais de 40 anos e ainda seja um pré-requisito para muitas abordagens experimentais na pesquisa cardíaca, continua a ser uma técnica difícil com resultados imprevisíveis. O isolamento cardiomiocócito através da perfusão das artérias coronárias com solução enzimópica é comumente usado para corações de animais pequenos e produz um grande número de células viáveis. No entanto, isso requer um sistema e experiência relativamente complexos. Além disso, a ma.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos Químicos
2,3-butanodiomonoxima	Carl Roth	3494.1	Pureza>99%
Albumina sérica bovina	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatina monohidratada	Alfa Aesar	B250009
Glicose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
Ácido L-glutâmico	Fluka Biochemica	49450
Baixo ponto de fusão agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldeído	Sigma Aldrich	P6148
Taurina	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Colagenase CLS tipo I	Worthington	LS004196	Usado para tecido humano a 4 mg / mL < br / > (atividade: 280 U / mg)
Colagenase CLS tipo II	Worthington	LS004176	Usado para tecido de rato a 1,5 mg / mL < br / > (atividade 330 U / mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Usado para tecido de rato a 0,5 mg / mL < br / > (atividade ≥ 3,5 U / mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Usado para tecido humano a 0,5 mg / mL < br / > (atividade: 7-14 U / mg)
< forte > Material< / forte >
células (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Tubo de centrífuga, 15 mL	Corning	430790
Tubo de centrífuga, 50 mL	Corning	430829
Agitador compacto	Edmund Bü hler	KS-15 B control	Direção de agitação: horizontal
Pipetas de pasteur de plástico descartáveis	Carl Roth	EA65.1	Para trituração de células, use apenas pipetas com um diâmetro de ponta interno ≥
Pinça FST		11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Filtro de rede de nylon, 180 µ m	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Inclui VibroCheck para correção assistida por infravermelho da deflexão z

Analisador de