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Artigo de método

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish

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DOI:

10.3791/61187

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8 de maio de 2020

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1Departments of Pharmacology and Medicine, Section of Hematology and Medical Oncology, The Cancer Research Center, Boston University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 3Department of Mechanical Engineering, Tufts University, 4Department of Physics, Tufts University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrito aqui é um método para utilizar embriões de zebrafish para estudar a capacidade de nanopartículas funcionalizadas para atingir células cancerígenas humanas in vivo. Este método permite a avaliação e seleção de nanopartículas ideais para testes futuros em animais de grande porte e em ensaios clínicos.

Resumo

Desenvolver nanopartículas capazes de detectar, atingir e destruir células cancerígenas é de grande interesse no campo da nanomedicina. Modelos in vivo animais são necessários para fazer a ponte da nanotecnologia à sua aplicação biomédica. O camundongo representa o modelo animal tradicional para testes pré-clínicos; no entanto, os ratos são relativamente caros de manter e têm longos ciclos experimentais devido à prole limitada de cada mãe. O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para pesquisas biomédicas e de desenvolvimento, incluindo pesquisas sobre câncer. Em particular, devido à sua transparência óptica e rápido desenvolvimento, os embriões de zebrafish são adequados para o monitoramento in vivo em tempo real do comportamento das células cancerígenas e suas interações com seu microambiente. Este método foi desenvolvido para introduzir sequencialmente células cancerígenas humanas e nanopartículas funcionalizadas em embriões transparentes de zebrafish Casper e monitorar o reconhecimento in vivo e o direcionamento das células cancerosas por nanopartículas em tempo real. Este protocolo otimizado mostra que nanopartículas fluorescentes rotuladas, que são funcionalizadas com grupos de folato, podem reconhecer e atingir especificamente células cancerígenas colossticas do colo do útero, rotuladas com um fluorocromo diferente. O processo de reconhecimento e segmentação pode ocorrer já em 30 minutos de pós-injeção das nanopartículas testadas. Todo o experimento requer apenas a criação de alguns pares de peixes adultos e leva menos de 4 dias para ser concluído. Além disso, os embriões de zebrafish carecem de um sistema imunológico adaptativo funcional, permitindo o engrafamento de uma ampla gama de células cancerígenas humanas. Assim, a utilidade do protocolo aqui descrito permite o teste de nanopartículas em vários tipos de células cancerígenas humanas, facilitando a seleção de nanopartículas ideais em cada contexto específico de câncer para testes futuros em mamíferos e na clínica.

Introdução

O desenvolvimento de nanopartículas capazes de detectar, direcionar e destruir células cancerígenas é de grande interesse tanto para físicos quanto para pesquisadores biomédicos. O surgimento da nanomedicina levou ao desenvolvimento de várias nanopartículas, como aquelas conjugadas com ligantes de alvo e/ou quimioterapia1,,2,,3. As propriedades adicionadas das nanopartículas permitem sua interação com o sistema biológico, detectando e monitorando eventos biológicos com alta eficiência e precisão, juntamente com aplicações terapêuticas. As nanopartículas de óxido de ouro e ferro são usadas principalmente em tomografia computadorizada e aplicações de ressonância magnética, respectivamente. Enquanto as atividades enzimáticas das nanopartículas de óxido de ferro e ouro permitem a detecção de células cancerosas através de assins de assinso colorimétricos, as nanopartículas fluorescentes são adequadas para aplicações de imagem in vivo4. Entre elas, as nanopartículas fluorescentes ultra-francas são particularmente benéficas, devido à sua capacidade de detectar cânceres precocemente com menos partículas e toxicidades reduzidas5.

Apesar dessas vantagens, as nanopartículas requerem experimentação utilizando modelos in vivo animais para seleção de nanomateriais adequados e otimização do processo de síntese. Além disso, assim como as drogas, as nanopartículas dependem de modelos animais para testes pré-clínicos para determinar sua eficácia e toxicidades. O modelo pré-clínico mais utilizado é o rato, que é um mamífero cuja manutenção tem um custo relativamente alto. Para estudos de câncer, camundongos geneticamente modificados ou camundongos xenógrafos são tipicamente usados6,,7. A duração desses experimentos geralmente se estende de semanas a meses. Em particular, para estudos de metástase do câncer, as células cancerígenas são injetadas diretamente no sistema circulatório dos camundongos em locais como veias traseiras e baços8,,9,,10. Esses modelos representam apenas os estágios finais da metástase quando as células tumorais extravasam e colonizam órgãos distantes. Além disso, devido a problemas de visibilidade, é particularmente desafiador monitorar a migração de células tumorais e o direcionamento de nanopartículas de células tumorais em camundongos.

O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um poderoso sistema vertebrado para a pesquisa do câncer devido à sua alta fecundidade, baixo custo, desenvolvimento rápido, transparência óptica e conservações genéticas11,12. Outra vantagem do zebrafish sobre o modelo de camundongos é a fertilização dos ovos de peixe ex utero, o que permite que os embriões sejam monitorados durante todo o seu desenvolvimento. O desenvolvimento embrionário é rápido em zebrafish, e dentro de 24 horas de pós-fertilização (hpf), o plano corporal vertebrado já formou13. Por 72 hpf, os ovos são eclodidos do acorde, transitando do embrionário para o estágio de fritura. A transparência do zebrafish, a cepa Casper em particular14,oferece uma oportunidade única para visualizar a migração de células cancerígenas e seu reconhecimento e direcionamento por nanopartículas em um animal vivo. Finalmente, os zebrafish desenvolvem seu sistema imunológico inato em 48 hpf, com o sistema imunológico adaptativo ficando para trás e ficando funcional apenas aos 28 dias após a fertilização15. Esta lacuna de tempo é ideal para o transplante de vários tipos de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish sem experimentar rejeições imunológicas.

Descrito aqui é um método que aproveita a transparência e o rápido desenvolvimento do zebrafish para demonstrar o reconhecimento e direcionamento das células cancerígenas humanas por nanopartículas fluorescentes in vivo. Neste ensaio, células cancerígenas cervicais humanas (células HeLa) geneticamente projetadas para expressar uma proteína fluorescente vermelha foram injetadas na área vascularizada na cavidade perivitelline de 48 hpf embriões. Após 20-24 h, as células HeLa já haviam se espalhado pelos embriões através do sistema circulatório de peixes. Embriões com metástase aparente foram microinjetados com ~0,5 nL de uma solução de nanopartículas logo atrás do olho, onde está localizado o rico leito capilar. Usando esta técnica, as nanopartículas de sílica fluorescentes ultrabright podem atingir células HeLa tão rapidamente quanto 20-30 min de pós-injeção. Devido à sua simplicidade e eficácia, o zebrafish representa um modelo in vivo robusto para testar uma variedade de nanopartículas por sua capacidade de atingir células cancerígenas específicas.

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Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Boston University School of Medicine sob o protocolo #: PROTO201800543.

1. Geração de embriões de zebrafish Casper

  1. Escolha peixes casper adultos com pelo menos 3 meses de idade para reprodução natural para gerar embriões transparentes de zebrafish Casper.
  2. Encha tanques de acasalamento de duas câmaras com água de peixe à noite, separe os tanques superiores usando divisores, coloque um peixe macho em um lado da câmara e um ou dois peixes fêmeas para o outro lado da câmara, e deixe os peixes separados durante a noite por divisórias.
  3. Retire os divisores na manhã seguinte às 8:00 da manhã quando as luzes estiverem acesas. Adicione plantas de enriquecimento artificial e incline ligeiramente a câmara superior para criar uma área rasa de água. Deixe o peixe procriar por 3-4 h.
  4. Levante as câmaras superiores dos tanques de acasalamento que contêm os peixes e devolva-os aos tanques originais.
  5. Colete ovos localizados nas câmaras inferiores despejando a água através de uma rede de malha. Transfira ovos para uma placa de Petri estéril a uma densidade não superior a 200 ovos por prato. Remova qualquer ovo morto ou não fertilizado e encha o prato 2/3 cheio com água de peixe fresco.
    NOTA: Os ovos fertilizados e saudáveis devem ser translúcidos e redondos. Todos os ovos nublados, brancos ou desfigurados devem ser removidos. A água dos peixes é obtida de tanques de peixes na instalação de peixes.
  6. Incubar embriões na incubadora a 28,5 °C durante a noite.
  7. Branquear os embriões na manhã seguinte usando o protocolo padrão, conforme descrito no Livro zebrafish16, e colocar os embriões de volta à incubadora (passo opcional).
  8. Tire os embriões de 24 hpf da incubadora à tarde e descorrionato os embriões usando pronase.
    1. Retire o máximo de água de peixe possível dos embriões na placa de Petri e adicione algumas gotas da solução de pronase (1 mg/mL na água do peixe) ao prato. Gire suavemente a placa de Petri. Uma vez que os acordes mostram sinais de desintegração, pipeta os embriões para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os acordes para liberar os embriões.
    2. Adicione água de peixe fresco imediatamente na placa de Petri para terminar o processo uma vez que a maioria dos embriões estão fora dos acordes. Enxágüe os embriões 3x mais usando água de peixe para remover os acordes flutuantes. Devolva os embriões à incubadora.

2. Preparação de células cancerígenas humanas para transplante

  1. Coloque a temperatura da incubadora para exatamente 35,5 °C. Monitore a incubadora para garantir uma temperatura consistente e estável usando um termômetro dentro da incubadora.
  2. Autoclave 1 L de água de peixe em uma garrafa de vidro. Faça uma solução de 3% de agarose adicionando 3 g de agarose de grau de eletroforese a 100 mL de água de peixe autoclaved e microwaving até que a ágarose seja completamente dissolvida.
    1. Despeje a solução de agarose quente em uma placa de Petri até que esteja 3/4 cheia. Coloque o molde de microinjeção na agarose. Certifique-se de que o molde não está em contato com a parte inferior da placa de Petri e nenhuma bolha se forma por baixo.
    2. Deixe a solução solidificar e remova cuidadosamente o molde da placa. Encha a placa com água de peixe autoclaved e armazene a placa a 4 °C. Pré-aquecimento a placa de agarose e água de peixe na incubadora de 35,5 °C antes de colher células HeLa.
  3. Puxe 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borossilicate capilares de vidro em um puxador de pipeta usando as seguintes configurações: pressão em 500, calor em 560, puxar em 100, velocidade em 100 e tempo/atraso em 200. Guarde agulhas na massa em uma grande placa de Petri que foi limpa com uma toalha de etanol.
    ATENÇÃO: As agulhas puxadas são muito afiadas e frágeis. Tenha cuidado ao manusear.
  4. Prepare uma solução de estoque de metanos de tricaine (MS222, 4 mg/mL) dissolvendo MS222 em água de peixe autoclaved. Vórtice bem antes de usar. Solução de estoque MS222 Diluir 1:100 em água de peixe (ou seja, adicionar 200 μL de solução de estoque MS222 a 20 mL de água de peixe a uma concentração final de 40 μg/mL) para anestesiar embriões para os seguintes procedimentos.
  5. Cultura hLabel HeLa cells, transduzindo-as com PLenti6.2_miRFP670 lentivírus usando o protocolo descrito17. Colheita RFP+ Células HeLa 30 min-1 h antes do transplante.
    NOTA: As células HeLa humanas foram cultivadas em uma incubadora de cultura tecidual de até 70% de confluência em meio de crescimento completo (médio DMEM com 10% de FBS) a 37 °C suplementado com 5% de CO2.
    1. Remova o meio celular HeLa por aspiração em uma capa de cultura de tecido. Enxágue brevemente a camada celular com PBS estéril para remover todos os traços do soro.
    2. Adicione 3,0 mL de solução Trippsin-EDTA estéril a um frasco T-75 e coloque as células de volta na incubadora de cultura tecidual de 37 °C por 3-5 minutos para facilitar a digestão enzimática. Observe o frasco sob o microscópio até que ~80% das células fiquem suspensas.
    3. Adicione 6-8 mL de meio de crescimento completo no frasco. Colete as células em um tubo estéril de 15 mL por pipetação suave. Centrífuga a 135 x g por 5 min.
    4. Aspire as células HeLa supernascidas e resuspendas em 3 mL de meio de crescimento completo. Repita o passo de lavagem acima 2x. Resuspend as células em 1 mL de meio de crescimento completo e conte as células sob o microscópio usando um hemótmetro.
    5. Gire as células novamente, remova o supernascer e resuspenja as células em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL a uma concentração de 5 x 107 células/mL. Mantenha as células aquecidas segurando o tubo em uma mão ao transportar para a instalação de peixes.
      NOTA: Mantenha sempre as células aquecidas armazenando as células dentro da incubadora de 35,5 °C antes ou durante a injeção dos embriões.

3. Transplante de células cancerígenas humanas

  1. Limpe a área de trabalho usando toalhas de etanol antes do transplante (por exemplo, tesoura, pinças, pipetas plásticas, lâminas de barbear).
  2. Alinhe embriões dentro das ranhuras da placa de agarose usando uma pipeta de plástico. Coloque embriões ao lado com o anterior voltado para a frente.
    NOTA: Certifique-se de que a água do peixe cubra os embriões. Reserve alguns embriões para não injetar células cancerígenas e use como controles.
  3. Ligue a fonte de ar e o microinjetor. Tire as células HeLa da incubadora e pipeta as células para cima e para baixo 20-30x usando uma ponta P200. Carregue 3 μL de mistura celular imediatamente em uma agulha usando uma ponta de carregamento de gel com uma extremidade de corte. Insira cuidadosamente a ponta na extremidade inferior afiada da agulha. Se necessário, agite a agulha para garantir que a mistura celular se mova para baixo da agulha para encher a ponta afiada.
    1. Insira a agulha no suporte da agulha. Use um par de pinças para abrir cuidadosamente a ponta da agulha. Ajuste a pressão e a duração do tempo no microinjetor para empurrar todas as bolhas de ar dentro da ponta da agulha. Reduza o tempo de duração da pressão e da injeção até que o tamanho das gotículas de injeção seja ~1 nL.
    2. Coloque a placa de injeção sob o microscópio em uma posição apropriada para ter o lado da gema dos embriões voltados para a agulha. Anestesiar os embriões adicionando cinco gotas da solução MS222 diluída (40 μg/mL).
    3. Posicione o injetor e deixe que a agulha toque na cavidade perivitelline de cada embrião.
  4. Injete a mistura celular nos embriões na área vascularizada sob a cavidade perivitelline pressionando o pedal do pé.
  5. Use a mão nondominante para mover a placa de injeção para o próximo embrião. Use a mão dominante para estender e retrair o injetor enquanto pressiona o pedal do pé simultaneamente para continuar a injeção. Pipeta algumas gotas de água de peixe estéril em embriões que foram injetados. Uma vez que a injeção de todos os embriões na placa é concluída, lave os embriões com água de peixe estéril, coloque-os em uma placa de Petri estéril e mova-os imediatamente para a incubadora de 35,5 °C.
  6. Depois de 3h, examine os embriões injetados e remova os mortos.
  7. Devolva os embriões vivos à incubadora de 35,5 °C e incuba-os por 20-24 h para permitir que as células HeLa se espalhem do local da injeção para outras partes do corpo.
    NOTA: Os embriões são mantidos na incubadora de 35,5 °C para permitir a sobrevivência e migração de células cancerígenas humanas porque as células não se sairam bem a 28,5 °C, a temperatura dos embriões de peixes são normalmente incubadas.

4. Injeção de nanopartículas ou veículo

  1. Anestesiar os embriões transplantados na manhã seguinte com cinco gotas de solução MS222 diluída. Não adicione muito MS222, porque isso vai matar os embriões. Sob um microscópio fluorescente, pegue cuidadosamente embriões com metástase traseira de células RFP+ HeLa e coloque-os em uma nova placa de Petri com água de peixe estéril.
  2. Faça as agulhas de injeção como descrito anteriormente na seção 2 usando as seguintes configurações: pressão a 500, calor a 645, puxar a 60, velocidade em 50 e tempo/atraso em 100.
  3. Siga os procedimentos nas etapas 3.1-3.3 para alinhar embriões e veículo de carga (por exemplo, H2O) ou a solução de nanopartículas na agulha.
  4. Injete 0,5 nL de solução de nanopartículas de 1 mg/mL atrás do olho e continue a injeção conforme descrito nas etapas 3.5-3.6(Figura 1B). Este local atrás dos olhos é enriquecido com capilares, permitindo que as nanopartículas entrem em circulação.
  5. Seguindo um procedimento semelhante, injete o veículo (por exemplo, H2O) que foi usado para suspender as nanopartículas em embriões com células HeLa transplantadas e aquelas sem (ou seja, controles) (Figura 1A, C).
  6. Incubar todos os embriões injetados a 35,5 °C.

5. Imagem e rastreamento de nanopartículas e células cancerosas

  1. Examine embriões injetados sob um microscópio fluorescente em 0, 30, 60, 90, 120, 180 e 210 min pós-injeção de nanopartículas para monitorar sua distribuição em circulação e o grau de direcionamento de células cancerosas. O direcionamento de células cancerígenas por nanopartículas pode ser observado já em 30 minutos de pós-injeção, dependendo do tipo de nanopartícula testada.
  2. Pipeta 2-3 embriões em uma placa de Petri e imobilizá-los adicionando cinco gotas de solução MS222 diluída (40 μg/mL). Uma vez que os embriões parem de nadar, remova a maior parte da água para permitir que os embriões deitem-se em seus lados.
  3. Use uma pipeta com uma escova fina e macia presa à extremidade para alinhar os embriões para que eles se deitem de lado com o anterior voltado para a frente e apenas um olho visível.
  4. Imagem os embriões em vermelho, azul e canais de campo brilhante em baixa ampliação (2x) para capturar todo o embrião e repetir em maior ampliação (6,4x) para capturar a área da cauda. Concentre o embrião sob o canal vermelho para evitar o sangramento das nanopartículas.
    NOTA: Os embriões não devem se mover durante a imagem. Qualquer movimento levará a imagens embaçadas e à incapacidade de sobrepor imagens de diferentes canais.
  5. Adicione água de peixe fresco aos embriões imediatamente após a imagem e devolva-os à incubadora. Repita os passos 5.2-5.4 para a imagem dos embriões em diferentes pontos de tempo.

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Resultados

O esquema protocolar na Figura 1 ilustra os procedimentos gerais deste estudo. Peixes adultos machos e fêmeas transparentes foram criados para gerar embriões (seção 1). As células RFP+ HeLa foram injetadas na área vascularizada sob a cavidade perivitelline dos embriões de zebrafish a 48 hpf, com embriões não injetados como controles (seção 3). Para indivíduos com experiência em microinjeção, a taxa de sobrevivência dos embriões é frequentemente alta,...

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Discussão

O protocolo descrito aqui utiliza o zebrafish como um sistema in vivo para testar a capacidade das nanopartículas de reconhecer e atingir células cancerígenas metastáticas. Vários fatores podem impactar a execução bem sucedida dos experimentos. Primeiro, os embriões precisam ser totalmente desenvolvidos a 48 hpf. O estágio correto de desenvolvimento dos embriões permite que eles resistam e sobrevivam ao transplante de células cancerígenas humanas. Embriões com menos de 48 cv têm uma taxa de sobrevivência significativamen...

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Divulgações

A I.S. declara interesse na NanoScience Solutions, LLC (beneficiária da bolsa STTR NIH R41AI142890). Todos os outros autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Srta. Kaylee Smith, Sra. Lauren Kwok e Sr. Alexander Floru por revisarem o manuscrito. H.F. reconhece o apoio de subvenções do NIH (CA134743 e CA215059), da American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) e da Fundação St. Baldrick. F.J.F.L. reconhece uma bolsa de estudos do Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinar Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). O I.S reconhece o suporte à NSF (conceder CBET 1605405) e o NIH R41AI142890.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseKSE scientificBMK-A1705
Capilares de vidro borossilicatoWorld Precision Instruments1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computador e monitorThinkCentreX000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)Corning10-013-CVvendido pela Fisher
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF0926
Incubadora de peixesVWR35960-056
HemocitômetroMarca Fishersci02-671-51B
Suporte magnéticoWorld Precision InstrumentsM10
Microloader pontaEppendorfE5242956003vendido pela Fisher
MicromanipulatorApplied Scientific InstrumentationMMPI-3
Extrator de agulhasInstrumentos SutterP-97
Microscópio fluorescente Olympus MVX-10 Olympus MVX-10
P200 pontaFishersci marca07-200-293
PBS (Solução de Sal Tamponada com Fosfato de Dulbecco 1X)Corning21-030-CVvendido pela placa de Petri Fisher
CorningSB93102vendido pela Fisher
Pipeta de plástico MarcaFishersci50-998-100
pLenti6.2_miRFP670Addgene13726
Bomba pneumática picoWorld Precision InstrumentsSYSPV820
PronaseRoche-Sigma-Fisher50-100-3275Produto Roche fabricado pela Sigma- vendido pela Fisher
Lâmina de barbearFishersci marca12-640
SZ51 microscópio de dissecaçãoOlympusSZ51
Tricaine metanossulfonatoWestern ChemicalsNC0872873vendido por Fisher
Tripsina-EDTACorningMT25053CIvendida pela pinça Fisher
Fishersci marca12-000-122

Referências

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