Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

रासायनिक रूप से परिभाषित परिस्थितियों में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से परिपक्व गुर्दे Podocytes के निर्देशित भेदभाव

Published: July 2, 2020 doi: 10.3791/61299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine

Summary

यहां प्रस्तुत उच्च दक्षता (>90%) के साथ प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानव गुर्दे के पोडोसाइट्स के व्युत्पन्न के लिए एक रासायनिक रूप से परिभाषित प्रोटोकॉल है और आनुवंशिक जोड़तोड़ या उपजनसंख्या चयन से स्वतंत्र है। यह प्रोटोकॉल 26 दिनों के भीतर वांछित सेल प्रकार का उत्पादन करता है और नेफ्रोटॉक्सिसिटी परीक्षण और रोग मॉडलिंग के लिए उपयोगी हो सकता है।

Abstract

गुर्दे की बीमारी वैश्विक आबादी का 10% से अधिक प्रभावित करता है और संघीय व्यय में अरबों डॉलर की लागत । गुर्दे की बीमारी और अंतिम अंत चरण गुर्दे की विफलता के सबसे गंभीर रूप अक्सर ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स को नुकसान के कारण होते हैं, जो अत्यधिक विशिष्ट एपिथेलियल कोशिकाएं हैं जो एंडोथेलियल कोशिकाओं और ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली के साथ मिलकर काम करती हैं ताकि गुर्दे की फिल्ट्रेशन बाधा बन सके। गुर्दे की दवा में प्रगति प्राथमिक ऊतकों की सीमित उपलब्धता और कार्यात्मक मानव गुर्दे की कोशिकाओं, जैसे podocytes के व्युत्पन्न के लिए मजबूत तरीकों की कमी से रुकावट है । स्टेम सेल जैसे नवीकरणीय स्रोतों से पोडोसाइट्स प्राप्त करने की क्षमता, मानव गुर्दे के विकास और रोग के तंत्र की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने में मदद कर सकती है, साथ ही चिकित्सीय खोज के लिए नए उपकरण प्रदान कर सकती है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उच्च दक्षता और विशिष्टता के साथ मानव प्रेरित pluripotent स्टेम (hiPS) कोशिकाओं से परिपक्व, पोस्ट-माइटोटिक पोडोसाइट्स प्राप्त करने के लिए एक विधि विकसित करना था, और रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत। इस विधि द्वारा उत्पादित हाइप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स वंश-विशिष्ट मार्कर (नेफ्रिन, पोडोसिन और विल्म के ट्यूमर 1 सहित) व्यक्त करते हैं और परिपक्व और कार्यात्मक पोडोसाइट्स से जुड़े विशेष रूपात्मक विशेषताओं (प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं सहित) का प्रदर्शन करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि ये विशेष विशेषताएं क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली अमर पोडोसाइट सेल लाइन में विशेष रूप से अनुपस्थित हैं, जो यह बताती है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव गुर्दे के पोडोसाइट्स का उत्पादन करता है जिसमें मौजूदा पोडोसाइट सेल लाइनों की तुलना में एक विकासात्मक रूप से अधिक परिपक्व फेनोटाइप होता है आमतौर पर मानव गुर्दे जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

Introduction

मानव pluripotent स्टेम सेल संस्कृति में प्रगति जैविक सामग्री है कि मानव शरीर के भीतर लगभग किसी भी सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है एक अक्षय, जैविक सामग्री के स्केलेबल स्रोत के साथ शोधकर्ताओं को उपलब्ध कराने के द्वारा पुनर्योजी दवा, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग में क्रांतिकारी बदलाव करने के लिए तैयार हैं1। यह रणनीति विशेष और कार्यात्मक सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो अन्यथा प्राप्त करना मुश्किल होगा। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम (hiPS) कोशिकाओं2,3,4,5 विशेष रूप से उनके दैहिक सेल मूल और क्षमता वे व्यक्तिगत दवा के लिए प्रतिनिधित्व के कारण आकर्षक हैं । हालांकि, खराब परिभाषित संस्कृति स्थितियों के लगातार उपयोग के कारण एचआईपीएस कोशिकाओं से अन्य सेल वंश प्राप्त करने के तरीके विकसित करना चुनौतीपूर्ण रहता है जिससे विषम कोशिका आबादी की दक्षता और गैर-विशिष्ट पीढ़ी6,7हो जाती है।

यहां प्रस्तुत रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत विशिष्टता और उच्च दक्षता के साथ हाइप्स कोशिकाओं से परिपक्व गुर्दे के पोडोसाइट्स के व्युत्पन्न के लिए एक विधि है। सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर कई कारकों की भूमिकाओं पर विचार करके, एक स्टेम सेल भेदभाव रणनीति विकसित की गई थी जिसमें सेल संस्कृति माध्यम में प्रस्तुत घुलनशील कारकों के अनुकूलन के साथ-साथ अघुलनशील कारकों, जैसे बाह्य मैट्रिक्स घटक या चिपकने वाला सब्सट्रेट्स शामिल थे। पोडोसाइट विकास और कार्य में इंटीग्रिन सिग्नलिंग के महत्व को देखते हुए, कोशिका की सतह पर एकीकृत रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति की शुरू में जांच की गई थी। 1 स्टीग्रिन न केवल एचआईपीएस कोशिकाओं में, बल्कि मेसोडर्म और मध्यवर्तीमेसोडर्म कोशिकाओं8,9,10सहित उनके डेरिवेटिव में भी व्यक्त किए गए थे। बाद के प्रयोगों ने पुष्टि की कि लिगांड जो 1 इंटेग्रीन (लैमिनिन 511 या लैमिनिन 511-ई 8 टुकड़ा सहित) से बांधते हैं, नीचे वर्णित घुलनशील प्रेरक मीडिया के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने पर हिप्स कोशिकाओं के पॉडोसाइट्स में चिपकने और भेदभाव का समर्थन करते हैं।

सेल वंश प्रतिबद्धता का प्रेरण पहले इस बात की पुष्टि करके शुरू किया गया था कि लाइनिन ए, चिरह 9 9 021 और Y27632 रॉक अवरोधक युक्त माध्यम की उपस्थिति में दो दिनों के लिए लेमिनिन-लेपित सतहों पर सुसंस्कृत हाइप्स कोशिकाएं उन कोशिकाओं में अंतर कर सकती हैं जो प्रारंभिक मेसोडर्म मार्कर HAND1, गूसेकोइड और ब्रचीरी8,11को व्यक्त करती हैं। 14 दिनों के लिए मेसोडर्म कोशिकाओं के उपचार के साथ एक माध्यम के साथ हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 7 (बीएमपी-7) और CHIR99021 मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं के व्युत्पन्न सक्षम है कि नेफ व्यक्त क्रोन-जनक सेल मार्कर विल्म के ट्यूमर 1 (WT1), अजीब-छोड़े गए संबंधित प्रोटीन 1 (OSR1)8,11,और जोड़ा बॉक्स जीन 2 प्रोटीन (PAX2)12। परिपक्व गुर्दे के ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स को प्राप्त करने के लिए, मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं को बीएमपी-7, एक्टिविन ए, वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीजीएफ),ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड और चिर 9 9 9 021 से मिलकर एक उपन्यास माध्यम के साथ 4-5 दिनों के लिए इलाज किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता था कि > 90% परिणामस्वरूप कोशिकाओं ने परिपक्व गुर्दे के पोडोसाइट8,11, 13कीआणविक,रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित किया। इन विशेषताओं में प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं का विकास शामिल है; सिंपो, PODXL, MAF, EFNB2 8 और पोडोसिन, नेफ्रिन, और WT114,15,16 सहित प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित podocyte वंश विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति । इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि एचआईपीएस सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यम8,11 का उपयोग करके विट्रो में चार सप्ताह तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है जो डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के समय में अतिरिक्त लचीलापन प्रदान करता है। हिप्स-पोडोसाइट्स की शुद्धता का निर्धारण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमेट्री पैनलों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया हमारे पिछले प्रकाशन11का उल्लेख करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. एचआईपीएस सीसीएम का 1x समाधान प्राप्त करने के लिए एचआईपीएस सेल कल्चर बेसल माध्यम में तनु गल 5x हिप्स सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) पूरक।
    नोट: फ्रोजन 5x हिप्स सीसीएम पूरक के लिए एक धीमी गति से विगलन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, आदर्श रूप से रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में। 1x हिप्स सीसीएम के एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. हिप्स सेल संस्कृति के लिए बेसमेंट झिल्ली (बीएम) मैट्रिक्स 1-लेपित प्लेटों की तैयारी: गल बीएम मैट्रिक्स 1 रात 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर। एक बार गल जाने के बाद, निर्माता द्वारा सुझाए गए उचित कमजोर पड़ने वाले कारकों के साथ एलिकोट तैयार करें।
    नोट: आमतौर पर, aliquots एक ५० मिलीएल शंकु नली में ठंड DMEM के 25 mL में बाद में कमजोर पड़ने के लिए तैयार कर रहे है और पूरी तरह से बीएम मैट्रिक्स 1 भंग और अवशिष्ट क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए पूरी तरह से मिश्रण के बाद ।
  3. बीएम मैट्रिक्स के 1 एमसीएल को ट्रांसफर करें 6 वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 समाधान और 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या न्यूनतम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, पैराफिन फिल्म में लिपटे। बीएम मैट्रिक्स 1 -लेपित प्लेटों को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. बेसमेंट झिल्ली (बीएम) मैट्रिक्स 2 की तैयारी - लेपित प्लेटें: 5 μg/एमएल की अंतिम एकाग्रता तैयार करने के लिए 9 एमएल बाँझ आसुत पानी में बीएम मैट्रिक्स 2 की उचित मात्रा को पतला करें। बीएम मैट्रिक्स 2 के 700 μL जोड़ें एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के लिए और 2 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट ।
  5. BMP7, एक्टिविन ए और वीईजीएफ के प्रत्येक 100 μg/mL स्टॉक समाधान तैयार करें: बाँझ आसुत पानी में 0.1% (wt/vol) बीएसए और पुनर्गठन एक्टिविन ए और VEGF को अलग से बाँझ पीबीएस में 0.1% (wt/vol) BSA युक्त 100 μg/mL स्टॉक समाधान तैयार करें। लगातार फ्रीज-गल चक्रों से बचने के लिए, प्रत्येक स्टॉक समाधान से 100 माइक्रोन एलिकोट तैयार करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. बाँझ आसुत पानी के 3.079 मिलील में Y27632 के 10 मिलीग्राम Y27632 को भंग करके Y27632 के 10 mm स्टॉक समाधान तैयार करें। स्टॉक से 100 माइक्रोन और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. 30 mm स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए बाँझ डीएमएसओ के 143.4 माइक्रोन में चिर99021 के 2 मिलीग्राम भंग करें। 5 माइक्रोन एलिककोट तैयार करें और 1 महीने तक (या निर्माता की सिफारिश के अनुसार) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. 3.33 मिलीग्राम बाँझ डीएमएसओ में 10 मिलीग्राम सभीट्रांस रेटिनोइक एसिड को भंग करें। 500 μL aliquots तैयार करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. ग्लूटामिन पूरक के साथ डीएमईएम/12 की उपयुक्त मात्रा में 100 एनजी/एमएल एक्टिविन ए, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632, और 1x B27 सीरम मुक्त पूरक की अंतिम एकाग्रता के लिए इसी स्टॉक समाधान का पुनर्गठन करके मेसोडर्म भेदभाव माध्यम तैयार करें।
    नोट: मेसोडर्म विभेदन माध्यम को भेदभाव चरणों से पहले और प्रयोग के पैमाने के लिए उपयुक्त मात्रा में ताजा तैयार किया जाना चाहिए (आमतौर पर, 50 एमएल मध्यम दो 12 अच्छी प्लेटों के लिए पर्याप्त है)।
  2. ग्लूटामीन पूरक के साथ डीएमईएम/एफ12 में 100 एनजी/एमएल बीएमपी 7, 3 माइक्रोन एम चिर999021, और 1x बी 27 सीरम-फ्री सप्लीमेंट की अंतिम एकाग्रता के लिए संबंधित स्टॉक समाधानों का पुनर्गठन करके मध्यवर्ती मेसोडर्म विभेदन माध्यम तैयार करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो माध्यम को 1% (vol/vol) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जा सकता है। ग्लूटामीन पूरक के साथ DMEM/F12 का उपयोग करके माध्यम की मात्रा को समायोजित करें। इस माध्यम को बड़े बैचों में तैयार किया जा सकता है; हालांकि, बार-बार फ्रीज-गल चक्रों से बचने के लिए छोटे एलिकोट्स (उदाहरण के लिए, 50 एमएल शंकु नलियों में 45 एमएल) में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। इस मीडिया को 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग करने से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर गल सकता है।
  3. अंतिम एकाग्रता 100 एनजी/एमएल बीएमपी 7 के पुनर्गठन से पोडोसाइट इंडक्शन माध्यम तैयार करें, 100 एनजी/एमएल एक्टिविन ए, 50 एनजी/एमएल वीजीएफ, 3 माइक्रोन चिर99021, 1x B27 सीरम-फ्री सप्लीमेंट, और डीएमईएम/एफ12 में 0.1 माइक्रोन ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड ग्लूटामाइन सप्लीमेंट के साथ। प्रकाश से माध्यम की रक्षा करें (उदाहरण के लिए, पन्नी कागज के साथ कंटेनर लपेटकर)।
    नोट: इस माध्यम को बड़े बैचों में तैयार किया जा सकता है और 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग करने से पहले जमे हुए एलिकोट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गल जाना चाहिए।
  4. डीएमईएम/एफ12 में 10% (vol/vol) गर्मी निष्क्रिय एफबीएस और बाँझ परिस्थितियों में फिल्टर जोड़कर ट्रिप्सिन बेअसर समाधान के 25 एमएल तैयार करें ।
  5. स्टेम सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स के विभेदन के बाद रखरखाव के लिए, निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार बेसल माध्यम में पूरक जोड़कर पोडोसाइट रखरखाव मीडिया के साथ पूरा माध्यम तैयार करें, और दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. फीडर मुक्त एचिप सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग कर मुक्त hiPS सेल संस्कृति

  1. पूर्व-लेपित प्लेटों से बीएम मैट्रिक्स 1 के अवशिष्ट समाधान को एस्पिरेट करें और गर्म डीएमईएम/एफ 12 के 1 से 2 मिलील के साथ 3 बार कुओं को धोएं।
  2. एस्पिरेट ने एचआईपीएस कोशिकाओं से एचआईपीएस सीसीएम खर्च किया और गर्म डीएमईएम/एफ 12 के साथ 3 बार कोशिकाओं को कुल्ला किया। कोशिकाओं को अलग करने में मदद करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए गर्म सेल टुकड़ी समाधान और 1 मिनट के लिए 1 मिलील जोड़ें। एक ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का दृश्य निरीक्षण करें और यह सुनिश्चित करें कि सेल उपनिवेशों के किनारे गोल दिखाई देते हैं, फिर कोशिकाओं से सेल टुकड़ी समाधान को जल्दी से हटा देते हैं (यह सुनिश्चित करना कि सेल उपनिवेश अभी भी प्लेट से जुड़े हुए हैं, हालांकि शिथिल)। सेल टुकड़ी समाधान को हटाने के लिए डीएमईएम/एफ12 के साथ एक बार कोशिकाओं को धीरे से कुल्ला करें।
  3. एचआईपीएस सीसीएम के 3 एमएल को एचआईपीएस कोशिकाओं (6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में) में जोड़ें जो सेल टुकड़ी समाधान के साथ इलाज किया गया था। एक सेल लिफ्टर का उपयोग करके कालोनियों को परिमार्जन करें, और शिथिल पालन कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए धीरे-धीरे सेल निलंबन को ऊपर और नीचे करें। सभी कोशिकाओं को काटा जाता है सुनिश्चित करने के लिए थाली को अच्छी तरह से धोएं।
    नोट: कोशिकाओं पर अतिरिक्त कतरनी से बचने के लिए 5 एमएल पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  4. सेल निलंबन के 0.5 एमएल को एक नए बीएम मैट्रिक्स 1-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें 2 मिलील हिप्स सीसीएम प्रति अच्छी तरह से शामिल है। प्लेट को फिगर-आठ फैशन में ले जाएं कुओं के भीतर सेल कॉलोनियों को वितरित करने और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जब तक कोशिकाओं को पारित करने के लिए तैयार नहीं किया जाता है या भेदभाव प्रयोग (लगभग 70% मांग) के लिए उपयोग किया जाता है तब तक दैनिक माध्यम ताज़ा करें।
    नोट: आईपीएससी के नियमित पासिंग के लिए आदर्श कॉलोनी का आकार एचआईपीएस सीसीएम (रॉक अवरोधक के बिना) का उपयोग करके फीडर मुक्त स्थितियों के तहत 200-500 माइक्रोन के बीच है। यदि कोशिकाओं को वियोजन एंजाइमों या बफ़र्स के साथ उपचार के दौरान व्यक्तिगत किया जाता है, तो सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए एचआईपीएस सीसीएम को रॉक अवरोधक (जैसे, 10 μM Y27632) के साथ पूरक किया जा सकता है।

4. मेसोडर्म कोशिकाओं में एचआईपीएस कोशिकाओं का भेदभाव (दिन 0-2)

  1. जबकि एचआईपीएस सेल संस्कृतियां घातीय विकास चरण में हैं (पास बढ़ने के बाद संस्कृति के लगभग 4 दिनों के भीतर, और लगभग 70% संकुचन), नेत्रहीन कॉलोनियों के किनारों के भीतर और उसके आसपास अनायास विभेदित कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए निरीक्षण करते हैं। यदि आवश्यक हो, तो भेदभाव के क्षेत्रों को कम करें।
  2. एचआईपीएस कोशिकाओं से एचआईपीएस सीसीएम को एस्पिरेट करें और गर्म डीएमईएम/एफ 12 के साथ कोशिकाओं को 3 बार कुल्लाएं। एंजाइम मुक्त सेल वियोजन बफर के 1 मिलील के साथ कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और माइक्रोस्कोप के नीचे वियोजन की जांच करें। विभिन्न एचआईपीएस सेल लाइनों के बीच अंतर्निहित मतभेदों के कारण, सेल वियोजन बफर के लिए वास्तविक इनक्यूबेशन समय किसी दिए गए सेल लाइन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. धीरे-धीरे एक सेल लिफ्टर के साथ अच्छी तरह से परिमार्जन करने के लिए शिथिल कोशिकाओं का पालन किया और एक 15 एमएल शंकु नली के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण, ऊपर और नीचे कई बार पाइपिंग के बाद hiPS कोशिकाओं को अलग करने के लिए ।
    1. कमरे के तापमान पर 290 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए गर्म DMEM/F12 और अपकेंद्रित्र के साथ 15 एमएल की मात्रा के लिए सेल निलंबन लाओ।
    2. धीरे-धीरे अतिनाट को एस्पिरेट करें और अवशिष्ट बीएम मैट्रिक्स 1 और वियोजन बफर घटकों को हटाने के लिए अपकेंद्रीकरण के एक और दौर के लिए गर्म DMEM/F12 के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
  4. ऊपर वर्णित मेसोडर्म इंडक्शन माध्यम के 1 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को एस्पिरेट करें। 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक मेसोडर्म विभेदन माध्यम की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर या कल्टर काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
  5. बीएम मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेटों से ईसीएम समाधान को एस्पिरेट करें और प्लेटों को गर्म डीएमईएम/एफ 12 के साथ दो बार कुल्ला करें। कई बार पाइपिंग करके धीरे-धीरे एचआईपीएस सेल सस्पेंशन मिलाएं। बीएम मैट्रिक्स 2-लेपित 12-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 1 एमएल स्थानांतरित करें और फिर कोशिकाओं को अधिक समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेटों को धीरे से हिलाएं।
  6. 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन मेसोडर्म इंडक्शन मीडियम को रिफ्रेश करें।
    नोट: 2 दिनों के बाद, एचआईपीएस सेल-व्युत्पन्न मेसोडर्म कोशिकाएं मध्यवर्ती मेसोडर्म प्रेरण के लिए तैयार होंगी।

5. एचआईपीएस सेल-व्युत्पन्न मेसोडर्म कोशिकाओं का मध्यवर्ती मेसोडर्म (दिन 2-16) में भेदभाव

  1. विभेदन प्रोटोकॉल के दूसरे दिन, मेसोडर्म इंडक्शन माध्यम को एस्पिरेट करें और 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से मध्यवर्ती मेसोडर्म इंडक्शन माध्यम के साथ भरपाई करें।
  2. चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं के लिए विकास कारकों और छोटे अणुओं की एक सटीक सीमा बनाए रखने के लिए हर दिन मध्यम ताज़ा करें। यदि पर्याप्त सेल वृद्धि और मीडिया पोषक तत्वों की तेजी से कमी है (मीडिया के पीले होने से संकेत मिलता है), तो मध्यवर्ती मेसोडर्म विभेदन माध्यम की मात्रा को 12 अच्छी प्लेटों के प्रति कुएं में 1.3 एमएल तक बढ़ाया जा सकता है।
  3. मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 14 दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाएं। 16 दिन तक, इन कोशिकाओं को बाद में उपयोग के लिए क्रायोप्रेवर किया जा सकता है।

6. हिप्स सेल-व्युत्पन्न मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं का फलोसाइट्स में भेदभाव (दिन 16 से 21)

  1. गर्म डीएमईएम/एफ 12 के साथ मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं को कुल्ला करें और इसके बाद 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 0.05 मिलियन ट्राइप्सिन-ईडीटीए के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए करें। यह सुनिश्चित करने के लिए दृश्य निरीक्षण करें कि कोशिकाएं अलग होने लगी हैं।
  2. सेल लिफ्टर का उपयोग करके कोशिकाओं को परिमार्जन करें और कोशिकाओं के व्यक्तिगत (या छोटे झुरमुट) कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 1,000 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके सेल निलंबन को कई बार पिपेट करें।
    नोट: इस स्तर पर, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं क्योंकि एकत्रित कोशिकाएं प्रोटोकॉल की समयरेखा के भीतर एक मरणासन्न विभेदित फेनोटाइप प्राप्त करने में विफल हो सकती हैं।
  3. ट्रिपसिन की गतिविधि को रोकने के लिए ट्राइप्सिन बेअसर समाधान के बारे में 2 एमएल प्रति अच्छी तरह जोड़ें।
  4. एक ५० एमएल शंकुस ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और DMEM/F12 का उपयोग कर ५० एमएल तक की मात्रा लाने के लिए, और फिर कमरे के तापमान पर २०१ x g पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र ।
  5. पोडोसाइट इंडक्शन मीडियम में सुपरनेट और रिसिप्ट कोशिकाओं को एस्पिरेट करें। इष्टतम परिणामों के लिए, लगभग 100,000 कोशिकाओं का अंतिम सीडिंग घनत्व सुनिश्चित करें/ बीएम मैट्रिक्स 2-लेपित प्लेटों में सेल निलंबन जोड़ें और धीरे से कोशिकाओं को और अधिक समान रूप से वितरित करने में मदद करने के लिए थाली हिला ।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट कोशिकाओं और21 दिन तक podocytes प्राप्त करने के लिए 5 दिनों तक के लिए दैनिक मध्यम ताज़ा।
    नोट: परिणामस्वरूप हाइप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स को पोडोसाइट रखरखाव मीडिया के साथ पूर्ण माध्यम का उपयोग करके 2-4 अतिरिक्त हफ्तों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। एक बार podocyte रखरखाव मीडिया में, कोशिकाओं को हर दूसरे दिन खिलाया जा सकता है और बाद के अध्ययन या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह प्रदर्शित करना था कि परिपक्व मानव पोडोसाइट्स रासायनिक रूप से परिभाषित परिस्थितियों में एचआईपीएस कोशिकाओं से प्राप्त किए जा सकते हैं। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत डेटा DU11 hiPS सेल लाइन17का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जिसका पहले परीक्षण किया गया था, और इसे माइकोप्लाज्मा से मुक्त पाया गया था। क्रोमोसोमल विश्लेषण भी किया गया, और कोशिकाओं को कर्मशास्त्रीय रूप से सामान्य पाया गया। अविभेदित DU11 hiPS कोशिकाओं के साथ शुरू, इस रिपोर्ट में उल्लिखित भेदभाव रणनीति(चित्रा 1)को पहले स्टेम सेल(चित्रा 2 ए)को मेसोडर्म सेल में अंतर करने के लिए नियोजित किया गया था जो ब्रैकीरी (टी)(चित्रा 1 बी और चित्रा 2 बी) को व्यक्त करता है, जिसकेबाद पैक्स2-पॉजिटिव इंटरमीडिएट मेसोडर्म कोशिकाओं(चित्रा 2C)में भेदभाव किया गया था, और अंत में परिपक्व गुर्दे के चमक में डालने के लिए1 बी, चित्रा 2D, चित्रा 3D,और चित्रा 4)। मेसोडर्म कोशिकाओं को विभेदन प्रोटोकॉल के दूसरे दिन तक प्राप्त किया गया था, मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाएं 16 दिन तक उत्पन्न हुई थीं, और परिपक्व पोडोसाइट्स को विभेदन प्रोटोकॉल के दिन 21 तक प्राप्त किया गया था। परिणामस्वरूप पोडोसाइट्स आकार में लगभग 150-200 माइक्रोन थे जब एक फ्लैट ऊतक संस्कृति सतह का पालन किया जाता है, जैसे कि इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली लेमिनिन-लेपित प्लेटें। एचआईपीएस सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स कई पैर प्रक्रिया जैसे एक्सटेंशन प्रदर्शित करते हैं जिन्हें चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1),इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी(चित्रा 4)और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी8,11सहित कई पूरक तकनीकों का उपयोग करके कल्पना की गई थी। स्टेम सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स ने WT115 (चित्रा 2D)के साथ-साथ वंश पहचान मार्कर नेफ्रिन14 (चित्रा 4)के लिए भी सकारात्मक दाग दिया। दिलचस्प बात यह है कि नेफ्रिन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण मुख्य रूप से पोडोसाइट फुट प्रक्रियाओं और सेल साइटोप्लाज्म में था, जो परिपक्व पोडोसाइट फेनोटाइप(चित्रा 2डी और चित्रा 4 ए,बी)के अनुरूप था। विकास के दौरान और पोडोसाइट फिजियोलॉजी में, प्रोटीन नेफ्रिन को कोशिका नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच शटल किया जाता है, लेकिन नेफ्रिन मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म और पैर प्रक्रियाओं में व्यक्त हो जाता है क्योंकि पोडोसाइट्स परिपक्व होते हैं और एक कार्यात्मक फेनोटाइप18प्राप्त करते हैं। इस प्रकार, यह अवलोकन कि यहां वर्णित विभेदन प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पादित पोडोसाइट्स ने काफी हद तक साइटोप्लाज्म और पैर प्रक्रिया जैसी संरचनाओं में नेफ्रिन व्यक्त करते हैं, अधिक परिपक्व या विशेष पोडोसाइट्स की पीढ़ी के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को रेखांकित करता है। हिप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ स्कैनिंग हमारे समूह8,11द्वारा पहले सूचित किए गए एचआईपीएस सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं की शाखाओं को उजागर करते हैं। क्योंकि WT1 अपने आप में गुर्दे के पोडोसाइट्स का एक निश्चित मार्कर नहीं है, यह अत्यधिक अनुशंसित है कि शोधकर्ता भी पोडोसिन और नेफ्रिन जैसे पोडोसाइट-विशिष्ट मार्कर की एक साथ अभिव्यक्ति के लिए अपनी कोशिकाओं की विशेषता है। यह पहले दिखाया गया था कि इस विधि इम्यूनोसाइट्स का उपयोग करके व्युत्पन्न पोडोसाइट्स, जो प्रोग्निटर सेल मार्कर पैक्स 28,11 की अभिव्यक्ति में इसी कमी के साथ पोडोसिन, नेफ्रिन और डब्ल्यूटी1 के लिए सकारात्मकहै। साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त पोडोसाइट्स विकासात्मक रूप से परिपक्व या विशेष हैं, जैसा कि एक कार्यात्मक मानव गुर्दे के ग्लोमेरुलर पोडोसाइट के लिए आवश्यक है।

विभेदन विधि के लिए अनुकूलन शर्तों में, ऐसे उदाहरण जहां मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं को अपर्याप्त रूप से अलग किया गया था। घनत्व पर वरीयता प्राप्त कोशिकाएं जो 100,000 कोशिकाओं के अनुशंसित घनत्व से काफी अधिक हो जाती हैं/12 अच्छी प्लेट (अंतिम पोडोसाइट इंडक्शन स्टेप से पहले) के परिणामस्वरूप कोशिकाओं के बड़े समूहों में परिणाम होता है कि प्रोटोकॉल की मानक समय रेखा(चित्रा 3ए, बी)के भीतर परिपक्व पोडोसाइट्स के अपेक्षित रूपात्मक फेनोटाइप का अभाव था । इन कारणों से, यह सिफारिश की जाती है कि शोधकर्ता विशिष्ट डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए वांछित अन्य शर्तों के साथ प्रयोग करने से पहले इस प्रोटोकॉल(चित्रा 3सी, डी)में अनुशंसित सीडिंग घनत्व का उपयोग करें। साथ में, ये परिणाम ऊपर वर्णित रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया का उपयोग करके तीन सप्ताह के भीतर किडनी ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स में एचआईपीएस कोशिकाओं के निर्देशित भेदभाव का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: पॉडोसाइट्स के लिए एचआईपीएस कोशिकाओं का भेदभाव।
(क)पॉडोसाइट्स में एचआईपीएस कोशिकाओं के निर्देशित भेदभाव के लिए विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। बीएमपी 7, बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 7; आरए, रेटिनोइक एसिड; VEGF, संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक। इस आंकड़े को रेफरी11से संशोधित किया गया है । (ख)विभेदन के प्रत्येक चरण में एचआईपीएस कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां । बाएं से दाएं, छवियां 0 दिन पर भेदभाव के लिए वियोजन से पहले विशेषता मानव आईपीएस सेल उपनिवेशों को दिखाती हैं, इसके बाद 2 दिनों के भेदभाव के बाद मेसोडर्म कोशिकाएं, फिर भेदभाव के लगभग 10 दिनों में मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाएं, और अंत में दिन 22 में मरणासन्न विभेदित पोसिसाइट्स। स्केल बार, सभी छवियों के लिए 100 माइक्रोन (पैनल बी में)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एचआईपीएस कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियां और उनके विभेदित डेरिवेटिव भेदभाव समयरेखा के दौरान वंश-विशिष्ट मार्कर और परमाणु काउंटरस्टेटिंग की अभिव्यक्ति दिखाते हैं।
(A)मानव आईपीएस कोशिकाओं pluripotency मार्कर Oct4 व्यक्त; (ख)मेसोडर्म कोशिकाएं ब्रैकीरी (टी) व्यक्त करती हैं; (ग)पैक्स2 को व्यक्त करने वाली मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाएं; और(घ)वंश-पहचान मार्कर, नेफ्रिन, और संबद्ध मार्कर, WT1 को व्यक्त करने वाले हाइप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स। स्केल बार, सभी छवियों के लिए 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: DU11 hiPS सेल लाइन से प्राप्त मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता पर उप-इष्टतम सीडिंग घनत्व का प्रभाव।
(क)जब प्रारंभिक कोशिका सीडिंग घनत्व बहुत अधिक होता है (लगभग ५००,० कोशिकाएं/12 वेल प्लेट की अच्छी तरह से), कोशिकाएं पोडोसाइट इंडक्शन चरण के दौरान घने समुच्चय(बी)बना सकती हैं । (ग)झुरमुट (12 अच्छी प्लेट की 100,000 कोशिकाओं/कुएं) को रोकने के लिए अनुशंसित सीडिंग घनत्व, और पॉडोसिट विभेदन चरण (इनसेट) के दौरान पैर प्रक्रिया जैसी संरचनाओं के(डी)विस्तार का सूक्ष्म रूप से निरीक्षण करना। स्केल बार, ए-डी के लिए 200 माइक्रोन; और डी में इनसेट के लिए 100 माइक्रोन करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एचआईपीएस सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स विट्रो मेंरूपात्मक रूप से परिपक्व फेनोटाइप का प्रदर्शन करते हैं।
(ए)नेफ्रिन के लिए हिप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की इम्यूनोदाता, और(बी)प्राथमिक और माध्यमिक प्रक्रियाओं (सफेद तीर) के साथ-साथ इन विशेष कोशिका संरचनाओं में नेफ्रिन की अभिव्यक्ति को दिखाने वाली पोडोसाइट फुट प्रक्रियाओं की उच्च आवर्धन छवि। स्केल बार, 100 माइक्रोन (ए); 50 माइक्रोन (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस रिपोर्ट में, हम हाइप्स कोशिकाओं से गुर्दे के ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हिप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स परिपक्व गुर्दे के पोडोसाइट फेनोटाइप13से जुड़ी रूपात्मक और आणविक विशेषताएं प्रदर्शित करते हैं। पिछले प्रकाशनों में, हमने दिखाया कि हिप्स सेल-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स किडनी ग्लोमेरुलस की संरचना और चयनात्मक निस्पंदन समारोह की नकल कर सकते हैं, जब एक पर्फ्यूसाबल माइक्रोफ्लुइडिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप डिवाइस8,11में ग्लोमेरुलर माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी होते हैं।

निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम इस प्रोटोकॉल को अनुकूल बनाने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं द्वारा विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, मेसोडर्म कोशिकाओं को शामिल करने के लिए लेमिनिन-लेपित प्लेटों पर एचआईपीएस कोशिकाओं की सीडिंग एक महत्वपूर्ण कदम है। जबकि १००,००० कोशिकाओं के एक बोने घनत्व/अच्छी तरह से सिफारिश की है, शोधकर्ताओं ने अध्ययन के लिए इस्तेमाल स्टेम सेल लाइन की प्रतिकृति दर के आधार पर प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व समायोजित कर सकते हैं । यदि आवश्यक हो, तो यह अनुकूलन मेसोडर्म इंडक्शन चरण के दौरान पर्याप्त सेल घनत्व सुनिश्चित करेगा और सेल समुच्चय या बहुत बड़े झुरमुटों के गठन को रोकेगा जो संभावित रूप से मेसोडर्म, मध्यवर्ती मेसोडर्म, या पोडोसाइट फेनोटाइप(चित्रा 3)की गुणवत्ता से समझौता कर सकता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि CHIR99021 जैसे कुछ अभिकर् ताओं के लिए निर्माता विनिर्देशों में अंतर विभेदित कोशिकाओं की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, स्वतंत्र प्रयोगों के बीच उनकी जैविक गतिविधि और स्थिरता के लिए विभिन्न बहुत संख्याओं या आपूर्तिकर्ताओं और विक्रेताओं से अभिकर्षकों का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, एंजाइमों को अलग करने के लिए एचआईपीएस कोशिकाओं के अत्यधिक जोखिम से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे चिपकने वाले मैट्रिक्स से अवांछित टुकड़ी हो सकती है और मध्यम आकांक्षा के दौरान कोशिकाओं की संभावित हानि हो सकती है। नोट के योग्य एक और महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि ग्रोसाइट इंडक्शन माध्यम को रेटिनोइक एसिड की फोटो-प्रेरित निष्क्रियता को रोकने के लिए प्रकाश से संरक्षित किया जाए।

मानव गुर्दे के पोडोसाइट्स के भेदभाव के लिए पिछले तरीकों की तुलना में, यहां वर्णित विधि गुर्दे के विकास और पोडोसाइट फ़ंक्शन में शामिल विशिष्ट सेल सिग्नलिंग रास्तों को विनियमित करने के लिए आवश्यक के रूप में रासायनिक रूप से परिभाषित कारकों (छोटे अणुओं, विकास कारकों, और बेसमेंट झिल्ली प्रोटीन के विशिष्ट आइसोफॉर्म) को नियोजित करती है। विशेष रूप से, एचआईपीएस कोशिकाओं से मेसोडर्म कोशिकाओं की पीढ़ी में छोटे अणु CHIR9902119का उपयोग करके प्रभावित विहित Wnt सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता शामिल थी। विएनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग पाथवे को ऊतक विकास और वीवो में पैटर्निंग में शामिल जीन की प्रतिलेखन गतिविधि को विनियमित करने के साथ-साथ सेल प्रसार और माइग्रेशन20, 21के लिए जानाजाताहै। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला सेल इंडक्शन माध्यम आईपीएस सेल-व्युत्पन्न मध्यवर्ती मेसोडर्म कोशिकाओं से पोडोसाइट्स के व्युत्पन्न को सक्षम बनाता है। इस पोडोसाइट इंडक्शन माध्यम में एक्टिविन ए, बीएमपी 7, वीजीएफ, रेटिनोइक एसिड और चिर99021 शामिल हैं। विशेष रूप से, इस पोडोसाइट इंडक्शन माध्यम को भ्रूण गोजातीय सीरम जैसे अपरिभाषित सीरम घटकों की आवश्यकता नहीं होती है, जो विशिष्ट कारकों के योगदान को अस्पष्ट कर सकते हैं और ऊतक विकास और रोग के मशीनी अध्ययन के लिए अन्य सेल भेदभाव विधियों के अनुप्रयोगों को सीमित कर सकते हैं, जिससे यह गुर्दे की कोशिका प्रकार22उत्पन्न करने के पिछले प्रयासों में नियोजित लोगों से अलग हो जाता है। इसके अतिरिक्त, यह देखा गया कि एचआइपी कोशिकाओं 6 ,7,22से गुर्दे के पोडोसाइट्स के भेदभाव के लिए एफजीएफ 2 और एफजीएफ9 की आवश्यकता नहीं है। जबकि भ्रूण निकायों और ऑर्गेनॉइड जैसे बहुकोशिकीय समुच्चय के गठन पर निर्भर पिछले तरीके, यहां वर्णित विधि कोशिकाओं का उत्पादन करती है जो एक परिपक्व फेनोटाइप का प्रदर्शन करती है, दोनों रूपात्मक रूपात्मक रूप से और नेफ्रिन और पोडोसिन सहित वंश विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति के द्वारा, और पैक्स 2 जैसे जनक सेल मार्कर के डाउन-रेगुलेशन। यह उम्मीद की जाती है कि इस प्रोटोकॉल में नियोजित रासायनिक घटकों का ज्ञान भविष्य में मानव गुर्दे के ऊतक विकास, पोडोसाइट वंश विनिर्देश और रोग रोगजनकता के मशीनी अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है।

एचआईपीएस सेल भेदभाव के लिए यह विधि उप-जनसंख्या चयन, आनुवंशिक जोड़तोड़, या ज़ेनोट्रांज्लांटेशन के बिना 90% से अधिक दक्षता के साथ परिपक्व, पोस्टमिटिक और कार्यात्मक पोडोसाइट्स की पीढ़ी को भी सक्षम बनाती है। यह पिछले प्रयासों से विशेष रूप से अलग है जहां सेलुलर विषमता6,7,23 के उच्च स्तर ने ट्रांसलेशनल मेडिसिन अनुप्रयोगों के लिए स्टेम सेल भेदभाव विधियों के उपयोग को सीमित कर दिया। यह विधि प्राथमिक ऊतकों या ऑर्गेनॉइड जैसे अन्य स्रोतों से मानव गुर्दे के पोडोसाइट्स की अत्यंत सीमित उपलब्धता से जुड़ी चुनौतियों को देखते हुए क्षेत्र के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रिम भी प्रस्तुत करती है। कुछ चुनौतियों में भ्रूण निकायों या ऑर्गेनॉइड6,7के गठन पर भरोसा करने वाले तरीकों का उपयोग करते समय 1% से कम की कम व्युत्पन्न क्षमता शामिल है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा स्टेम सेल संस्कृति और भेदभाव कदम है, जो कुछ प्रयोगशालाओं या अनुसंधान समूहों में इसके कार्यान्वयन में बाधा हो सकती है के लिए आवश्यक अभिकर्दकों की अपेक्षाकृत उच्च लागत है । इसके अलावा, क्योंकि सेल के माइक्रोएनवायरमेंट (यानी, घुलनशील और अघुलनशील या चिपकने वाले दोनों संकेतों) में कई कारकों के लिए अनुकूलन का एक बहुत शामिल थे, हम अनुशंसा करते हैं कि प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है जैसा कि वर्णित है। इस पोडोसाइट विभेदन विधि का उपयोग करने में रुचि रखने वाले अन्य लोगों से एक आम गलती में अनुचित सेल आसंजन मैट्रिस जैसे बीएम मैट्रिक्स 1 या अन्य खराब परिभाषित पशु-व्युत्पन्न प्रोटीन का उपयोग शामिल था। एक बार प्रोटोकॉल का पालन करने के बाद वर्णित किया जाता है, प्रोटोकॉल में अन्य संशोधनों की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए आगे के प्रयोग किए जा सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न मानव स्टेम सेल लाइनों के बीच अंतर्निहित मतभेदों के कारण, यह ध्यान देने योग्य है कि भेदभाव विधि के कुछ पहलुओं, उदाहरण के लिए, भेदभाव माध्यम या सेल वियोजन माध्यम के संपर्क के समय, और सेल सीडिंग घनत्व, अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, इन शर्तों को एचआईपीएस सेल लाइनों और भ्रूणस्टेम सेल लाइनों की तारीख तक परीक्षण के लिए नहीं बदला गया था । यह पोडोसाइट विभेदन विधि पीजीपी 1, आईएमआर-90-1, और IISH3i-CB6 के साथ-साथ एच9 भ्रूणस्टेम सेल लाइन8,11सहित कई एचआईपीएस सेल लाइनों में काम करती है। इस रिपोर्ट में, हम एक ही प्रोटोकॉल(चित्रा 1 और चित्रा 2)का उपयोग करके DU11 hiPS सेल लाइन के सफल भेदभाव को भी प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, अन्य स्वतंत्र अनुसंधान प्रयोगशालाओं (पूर्व-प्रकाशन) से अप्रकाशित कार्य के परिणामों सहित विभिन्न सेल लाइनों में इस विधि की निरंतरता को देखते हुए, हम उम्मीद करते हैं कि यह भेदभाव प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की हाइप्स सेल लाइनों से गुर्दे के पोडोसाइट्स के व्युत्पन्न के लिए उपयोगी होगा, और इसलिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एक तक ही सीमित नहीं है।

अनिश्चित काल तक स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए एचआईपीएस कोशिकाओं की क्षमता को देखते हुए, इस विभेदन विधि का उपयोग शोधकर्ताओं को मानव गुर्दे के पोडोसाइट्स के आसानी से उपलब्ध स्रोत के साथ प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। यह मानव गुर्दे जीव विज्ञान और रोग24 की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने में मदद कर सकता है और साथ ही मानव गुर्दे समारोह और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं मॉडलिंग के लिए नए इन विट्रो गुर्दे प्रणालियों के विकास को सक्षम कर सकता है । उदाहरण के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को हाल ही में मानव गुर्दे की चमकदार केशिका दीवार के एक कार्यात्मक इन विट्रो मॉडल विकसित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक ऑर्गन-ऑन-ए-चिप प्रणाली के साथ नियोजित और एकीकृत किया गया था। इस ग्लोमेरुलर चिप ने कीमोथेरेपी दवा, एड्रियामाइसिन8के संपर्क में आने पर परिसंचारी अणुओं और पुनःcapitulated दवा-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिकिटी को चुनकर फ़िल्टर किया। भविष्य में, इन परिणामों को संभावित रूप से मानव गुर्दे के विट्रो मॉडल में अधिक जटिल इंजीनियर करने के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। इस तरह की प्रगति दवा उम्मीदवारों के मूल्यांकन के लिए उपन्यास प्लेटफार्म प्रदान कर सकती है, विशेष रूप से वे जो ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स की शिथिलता से उत्पन्न गुर्दे की बीमारियों के रूपों को लक्षित करते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि पशु मॉडलों के प्रजातियों-विशिष्ट मतभेद और आमतौर पर मानक ऊतक संस्कृति विधियों में देखे जाने वाले अंग-स्तर की कार्यक्षमताओं की कमी मानव गुर्दे की बीमारियों के विभिन्न रूपों के लिए लक्षित चिकित्सीय के विकास में बाधा डाल सकती है25। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल, कुछ दिन, मानव गुर्दे के विकास में शामिल सिग्नलिंग रास्तों के साथ-साथ रोग के रोगजनकों को जानने के अवसर प्रदान कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एस.M एक पेटेंट पर एक लेखक है जो प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (यूएस पेटेंट एप्लीकेशन 14/950859) से गुर्दे के पोडोसाइट्स की पीढ़ी के लिए विधियों के लिए लंबित है। शेष लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को ड्यूक यूनिवर्सिटी में प्रैट स्कूल ऑफ इंजीनियरिंग, ड्यूक मेडिकल स्कूल में नेफ्रोलॉजी के डिवीजन, ड्यूक यूनिवर्सिटी में मेडिसिन विभाग से चेयर रिसर्च अवॉर्ड और एस.M को एक बुर्के वेलकम फंड पीडीईपी करियर ट्रांजिशन तदर्थ पुरस्कार से समर्थन मिला । एम .B को नेशनल साइंस फाउंडेशन के ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था । हम उदारता से हमें DU11 स्टेम सेल लाइन के साथ उपलब्ध कराने के लिए Bursac लैब का शुक्रिया अदा करते हैं, और ड्यूक विश्वविद्यालय में वर्गीज लैब अस्थाई रूप से हमारे समूह के साथ अपने ऊतक संस्कृति सुविधा साझा करने के लिए । यह प्रकाशन मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी में रसायन विज्ञान के नोवार्टिस प्रोफेसर लौरा एल किस्लिंग को उनके ६०वें जन्मदिन के जश्न में समर्पित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
DU11 human iPS cells The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.
Growth Factors and Media Supplements
All-trans retinoic acid (500 mg) 72262 Stem Cell Technologies
B27 serum-free supplement 17504044 Thermo/Life Technologies
CHIR99021 04-0004 Stemgent May show lot-to-lot variation
Complete Medium Kit with CultureBoost-R 4Z0-500-R Cell Systems Podocyte maintenance media
DMEM/F12 12634028 Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement 10565042 Thermo/Life Technologies DMEM/F12 with glutamine supplement
Heat-inactivated FBS 10082147 Thermo/Life Technologies
Human activin A PHC9564 Thermo/Life Technologies
Human BMP7 PHC9544 Thermo/Life Technologies
Human VEGF PHC9394 Thermo/Life Technologies
mTeSR1 medium 05850 Stem Cell Technologies hiPS cell culture media (CCM)
Penicillin–streptomycin, liquid (100×) 15140-163 Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK inhibitor 1254 Tocris
Antibodies
Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies A32744; A32754; A-11076; A32790 Thermo/Life Technologies
Brachyury(T) ab20680 Abcam
Nephrin GP-N2 Progen
OCT4 AF1759 R&D Systems
PAX2 71-6000 Invitrogen
WT1 MAB4234 Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment N-892012 Iwai North America Basement membrane (BM) matrix 2
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial 354277 BD Biosciences Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation
Enzymes and Other Reagents
Accutase A1110501 Thermo/Life Technologies Cell detachment solution
BSA A9418 Sigma-Aldrich
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D2438 Sigma-Aldrich DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood
Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt 13150016 Thermo/Life Technologies
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade 97065-058 VWR Ethanol is flammable and toxic
FBS 431097 Corning
Paraformaldehyde (PFA) 28906 Thermo/Life Technologies PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.
Phosphate-buffered saline (PBS) 14190-250 Thermo/Life Technologies
Sterile Distilled Water 15230162 Thermo/Life Technologies
Triton X-100 97062-208 VWR
Trypsin-EDTA, 0.05% 25300-120 Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirating pipettes, individually wrapped 29442-462 Corning
Avanti J-15R Centrifuge B99516 Beckman Coulter
Conical centrifuge tube, 15 mL 352097 Corning
Conical centrifuge tube, 50 mL 352098 Corning
Cryoboxes 3395465 Thermo/Life Technologies For storing frozen aliquots
EVOS M7000 AMF7000 Thermo/Life Technologies Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives
Hemocytometer 100503-092 VWR
Heracell VIOS 160i CO2 incubator 51030403 Thermo/Life Technologies For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives
Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) Carl Zeiss Microscopy Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation
Kimberly-Clark nitrile gloves 40101-346 VWR
Kimwipes, large 21905-049 VWR
Kimwipes, small 21905-026 VWR
P10 precision barrier pipette tips P1096-FR Denville Scientific
P100 barrier pipette tips P1125 Denville Scientific
P1000 barrier pipette tips P1126 Denville Scientific
P20 barrier pipette tips P1121 Denville Scientific
P200 barrier pipette tips P1122 Denville Scientific
Serological pipette, 10 mL, individually wrapped 356551 Corning
Serological pipette, 25 mL, individually wrapped 356525 Corning
Serological pipette, 5 mL, individually wrapped 356543 Corning
Steriflip, 0.22 μm, PES SCGP00525 EMD Millipore
Sterile Microcentrifuge Tubes 1138W14 Thomas Scientific For aliquoting growth factors
Tissue culture–treated 12-well plates 353043 Corning
Tissue culture–treated six-well plates 353046 Corning
VWR white techuni lab coat 10141-342 VWR
Wide-beveled cell lifter 3008 Corning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 161 मानव आईपीएस कोशिकाएं स्टेम सेल विभेदन स्टेम-सेल व्युत्पन्न पोडोसाइट्स पोडोसिट पैर प्रक्रियाएं गुर्दे की बीमारी मॉडलिंग कार्यात्मक मानव गुर्दे की कोशिकाएं नेफ्रोटॉक्सिकिटी स्टेम सेल बाहुलर मैट्रिक्स
रासायनिक रूप से परिभाषित परिस्थितियों में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से परिपक्व गुर्दे Podocytes के निर्देशित भेदभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor,… More

Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions. J. Vis. Exp. (161), e61299, doi:10.3791/61299 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter