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Neuroscience

くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

我々は、このプロトコルにおいて、システルナマグナへの自家全血の二重注入による標準化されたくも膜下出血(SAH)マウスモデルを説明した。二重注入手順の高度な標準化は、死亡率に関する相対的な安全性を有するSAHの中急性モデルを表す。

Abstract

脳卒中の中で、脳動脈瘤の破裂に連続するくも膜下出血(SAH)は5〜9%を表すが、神経学的結果の点で重要な罹患率を有する全脳卒中関連死亡率の約30%を占めている。遅延脳血管れん縮 (CVS) 遅延脳虚血と関連して最も頻繁に発生する可能性があります。SAHの異なる動物モデルは現在、血管内穿穿および水槽マグナまたは気前の水槽への血液の直接注入を含む使用されており、それぞれが明確な長所と短所を示している。本稿では、システルナマグナに全血の自家の決定された量の二重直接注入によるSAHの標準化されたマウスモデルが提示される。簡単に言えば、マウスを計量し、イオブルラン吸入によって麻酔した。次いで、動物を、37°Cの直腸温度を維持する加熱毛布の上にリクライニング位置に置き、約30°の頚部曲げを有する定位フレームに配置した。一度所定の位置に、同じ年齢と性別の別のマウスの頸動脈から採取した相同動脈血で満たされた細長いガラスマイクロピペットの先端(C57Bl/6J)は、マイクロマニピュレーターによってアラント後頭膜と接触して直角に配置された。その後、60μLの血液を水槽マグナに注入し、続いて動物を30°下方傾きして2分間注入した。30μLの血液を水槽マグナに2回目の輸液を、最初の1から24時間行った。各動物の個々のフォローアップは毎日行われます(体重と幸福の慎重な評価)。この手順は、人工脳脊髄液(CSF)の同等の注射によって模倣することができる頭蓋内圧上昇を伴う可能性が高い血液の予測可能で高度に再現性の高い分布を可能にし、低死亡率を誘発するSAHの急性から軽度のモデルを表す。

Introduction

くも膜下出血(SAH)は、脳卒中症例の最大5%を占め、100,000人当たり年間7.2〜9人の患者の罹患率を有する比較的一般的な病理を構成し、研究11、2、32,3に応じて死亡率は20%〜60%である。急性期では、死亡率は出血、再出血、脳血管れん縮(CVS)および/または医学的合併症の重症度に起因する。生存者において、早期脳損傷(EBI)は、出血の虚脈拡張および頭蓋内圧の急激な増加に関連しており、これは第1次脳虚血5および症例の約10%〜15%で即時死をもたらす可能性がある6。SAHの初期の「急性」段階の後、予後は、脳コンピュータ断層撮影によって患者のほぼ40%で検出された「二次的」または遅延脳虚血(DCI)の発生に依存し、磁気共鳴画像(MRI)7、8後の患者の最大80%において7,。大多数のSAH患者において動脈瘤破裂後4~21日の間に起こるCVSに加えて、DCI9は、多因子性びまん性脳病変から微小血栓形成、脳灌流の減少、神経炎症、および皮質広がりん小病(CSD)10、11、12、13に起因する可能性がある。10,11,12,13これは、SAH生存者の30%に影響を及ぼし、視覚記憶、言語記憶、反応時間、およびエグゼクティブ、視空間および言語機能14を含む認知機能に影響を与える15。SAH患者のCVSおよび/または悪い認知転帰を防ぐための現在の標準的な治療法は、Ca2+チャネル阻害剤をニモジピンとして使用することにより、Ca2+シグナル伝達および血管収縮の閉塞に基づいている。しかし、血管収縮を標的とした最近の臨床試験では、患者の神経学的転帰とCVS16の予防との間の解離が明らかになっており、SAH長期の結果に関与するより複雑な病態生理学的メカニズムが示唆された。したがって、SAHに付随する病理学的事象の数と、元の治療介入をテストするための有効かつ標準化された動物モデルの開発をより深く理解する医学的ニーズがある。

ヒトにおけるSAHの大部分を担う頭蓋内動脈瘤の破裂は、前臨床動物モデルで模倣することは困難である可能性が高い。現在、動脈瘤破裂及びSAH状況は、マウス17,18,18におけるCVS及び感作運動障害を担う中大脳動脈(血管内穿刺モデル)の穿穿率によって暫定的に試験することができる。このモデルでは、出血の発症と血液の拡散に対する制御が可能ないため、血管内破裂のないSAHモデルを生成する他の方法がげっ歯類で開発されている。より正確には、それらは、マグナシスターナ19で単一または二重注射を介して、またはプレキアシムシテルン20への単一の注射を介して、くも膜下腔への動脈血の直接投与からなる。血管内破裂のないこれらのマウスモデルの主な利点は、外科的処置および注入された血液サンプルの質および量を再現的に習得する可能性である。特に血管内穿穿によるモデルに対するこのモデルの別の利点は、動物の一般的な幸福の保存である。実際のところ、この手術は頸動脈壁破裂を発生させるために必要なものよりも侵襲性が低く、技術的に難解ではありません。この最後のモデルでは、動物は挿管され、機械的に換気され、モノフィラメントは外的頸動脈に挿入され、内部頸動脈に進む必要があります。これは、ワイヤー経路による血管閉塞による一過性虚血を引き起こす可能性が高い。その結果、手術に伴う共罹患率(モリバンド状態、重要な痛みおよび死)は、血管内穿穿率モデルと比較して二重注入モデルにおいてあまり重要ではない。より一貫したSAHであることに加えて、二重直接注射法は、研究および試験における動物福祉(麻酔下の時間の短縮、手術および苦痛における組織の混乱による痛み)に準拠し、プロトコル研究および人事訓練に使用される動物の最小総数につながります。

さらに、トランスジェニックマウスに同じプロトコルを実装することができ、SAHの最適な病理学的理解と潜在的な治療化合物の比較試験の可能性につながります。ここでは、6-8週齢の雄C57Bl/6Jマウスにおいて自家動脈血をシスターナマグナに1日2回連続で連続して注射することにより、くも膜下出血(SAH)の標準化されたマウスモデルを提示する。このモデルの主な利点は、血管内穿穿率モデルと比較した出血量の制御と、頭蓋内圧21の急激な増加を伴わない出血事象の補強である。最近、水槽マグナへの血液の二重直接注入は、マウスの実験的および生理的病理学的問題についてよく説明されている。実際、我々は最近、大脳動脈(バジラー(BA)、中期(MCA)および前脳動脈(ACA)脳動脈、脳血管フィブリン沈着および細胞アポトーシス3日目(D3)から10(D10)、神経血管脳脊髄液の循環欠陥を伴う神経脊柱運動および機能の変化を伴うSAHモデル22日で実証した。したがって、このモデルは、SAH後の短期的および長期的なイベントのために、マスター、検証、および特徴付けになります。これは、新しい標的の将来の同定のために、およびSAH関連合併症に対する強力かつ効率的な治療戦略に関する研究に理想的に適しているべきである。

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Protocol

すべての手続きは、フランスの倫理委員会と欧州議会指令2010/63/EUおよび科学的目的で使用される動物保護評議会のガイドラインに従って、H.カステルの監督の下で行われました。このプロジェクトは、地元のCENOMEXAと動物の研究とテストに関する国家倫理委員会によって承認されました。8~12週齢の雄C57Bl/6J RJマウス(Janvier)は、22°C±1°C、12時間/12時間の明暗サイクル、および水および食物のアドリビタムの下に収容された。

1. SAH手術のセットアップと注射の準備

  1. 手術開始前に、マイクロピペットプーラーを使用して、ガラス毛細血管の十分な数を引っ張ります。注入ピペットは0.86のmmの内径および1.5mmの外径を示すべきである。
  2. 人工脳脊髄液(aCSF)を偽の状態に備えます。
    1. 119 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM NaH2PO 4、1.3 mM MgCl2、10mMグルコース、H42Oで26.2 mM NaHCO3、pH 7.4で溶液を準備します。
    2. ガス aCSF 95% O2 と 5% CO2 15 分間、 2.5 mM CaCl2を追加します。
    3. 0.22 μmフィルター装置で酸素化されたaCSFを殺菌します。aCSF溶液は4°Cで3〜4週間安定することができる。 汚染(溶液が曇りになる)または堆積物形成が現れた場合は、廃棄して新鮮なaCSFを作ります。
  3. 相同マウスドナーからの血液の採取
    1. 気管に沿って頸動脈を分離し、頸動脈の穿刺によって血液の最大量を収集します。
    2. 実際には、マウスを麻酔室に入れ、動物が意識を失うまで5%のイオブルランでチャンバーをロードします。
    3. 2つの後肢のうちの1つをクランプして、外科的実験手順の設定を可能にすることによって、反射神経の欠如を確認してください。
    4. 26G針(ヘパリンナトリウム)を用いてヘパリン溶液を1mLの注射器に塗布する。これは、次のステップ中に血液凝固を防ぐことができます.
    5. 足を離した後部褥瘡に位置する動物を、麻酔マスク(2〜2.5%のイオブルランを用いた麻酔維持)に鼻を取り付けます。
    6. 気管に沿って頸動脈を分離し、オモヨイド筋を縦方向に解剖する。動脈が単離されたら、マイクロディスセクションフックと鉗子の助けを借りて心臓に針を挿入し、頸動脈の穿刺を介して血液の最大を収集する(SAHマウスあたり60 μLが必要です)。
    7. 子宮頸部脱臼を用いて、採血直後に麻酔をしたドナーマウスを犠牲にする。

2. 動物(8-10週齢C57BL/6J雄マウス)製剤

  1. 電子バランスを使用して各マウスの重量を正確に測定します。現在の研究では、マウスは手術直前に20〜25グラムの範囲内の体重を有するであろう。
  2. 先に説明したように(ステップ1.3.2および1.3.3を参照)、マウスの麻酔を操作するように誘導する。
  3. 適切な電気クリッパーで、耳の間の首とスペースを剃ります。
  4. 体位フレームに脚を離した腹側褥瘡に位置する動物と麻酔マスク(2および2.5%isofluraneを用いた麻酔維持)に鼻を設置します。
  5. マウスが眠っていて、頭が正しくブロックされていることを確認します。
  6. 皮下に100μLのブプレノルフィン(0.1mg/kg)を腰に26G針で注入し、覚醒後の痛みを避ける。
  7. 保護液体ゲルを使用してドライアイを防止し、自動調整電動ブランケットを使用して37°Cの直腸内温度を維持します。
  8. 後頸部剃毛領域を防腐液(無菌綿道を使用してポビドネヨウ素またはクロルヘキシジン)で治療します。
  9. 調製した皮膚/皮下組織に触れるすべての器具を殺菌(2時間200°Cに加熱)し、無菌で取り扱います。

3. SAH誘導

  1. 初日(D-1)
    1. 後輪に薄いはさみで1cmの切開を切り、続いて中線に沿って筋肉を分離してシステルナマグナにアクセスします。
    2. 薄いはさみで空のガラスピペットの先端を切ります。次いで、柔軟なシリコンコネクタに接続されたシリンジに適応する。
    3. 精密マイクロピペットを使用して、60 μLの血液またはaCSF(それぞれSAHまたはシャム状態)を0.5 mLチューブに移します。
    4. SAH状態の場合は60μLの血液をガラスピペットに吸い込み、シャム状態の場合はaCSFの60 μLを吸い込みます。
    5. 注射の場合は、リングまたはブルータックを使用して立体フレームにピペットを取り付け、シツナマグナとのインターフェースでゆっくりとピペットチップを膜に持って行きます。
    6. アトラント後頭部膜を通してピペットチップをシスタンナマグナにゆっくりと挿入し、立体戦術フレームのマイクロマニピュレータを使用します。
    7. 以前に血液またはaCSFで満たされたピペットを、圧力誘導の準備ができている注射器に接続します。
    8. 急性の頭蓋内圧を避けるために、10 μL/min前後の低速度でプランジャーを押して注入します。
    9. 注射中は、呼吸数と直腸温度を注意深く監視します。
    10. 注射の終了時に、マイクロマニピュレータを介してピペットを慎重に取り外し、引き出し中に漏れがないように視覚的に確認します。
    11. 吸収性止止めを使用して止止めを達成し、編組非吸収性縫合糸で2つの縫合糸を実行します。
    12. 手術直後、マウスを減少デキュビタスに分離して位置づけ、回復の間、開いた箱の中に生存毛布で覆う。
  2. 誘導の2日目(D0)
    1. 24時間後、麻酔を誘発する(ステップ1.3.2および1.3.3を参照)。皮下に再び100μLのブプレノルフィン(0.1mg/kg)を注入し、保護液体ゲルを使用してドライアイを防止します(ステップ2.7および2.8を参照)。
    2. 前日のように立体的なフレームに動物をインストールします。
    3. マイクロシザーで縫合糸を慎重に取り除きます。
    4. 以前のようにアラント後頭膜を準備し、滅菌綿棒で首の剃った領域に消毒製剤を適用します。
    5. 低い速度で30μLの血液またはaCSFを注入します(ステップ3.1.2から3.1.8を参照)。呼吸数と直腸温度を監視します。
    6. 注射の終了時に、慎重にピペットを取り外し、離脱時の血液漏出の欠如を制御する。
    7. 止まり止めを達成し、編み込み吸収性縫合糸で2つの縫合糸を実行します。

4. 術後のフォローアップと実験終了

  1. 手術直後、回復中に開いた箱の中に生存毛布を背にして、マウスを減少デキュビタスに分離し、配置する。
  2. 重さを量り、慎重に犠牲(例えば、D7手術後)まで、各マウスの行動を注意深く観察します。
  3. 人道的エンドポイントの中で、有意な体重減少(体重の15%)が古典的に注目されています。「腰を下ろした」姿勢、ゆっくりとした動き、プロストレーション、傷ついた異常な発声、および/または重大な攻撃的な行動も動物の苦しみの重要な兆候です。これらの徴候または徴候の組み合わせのいずれかが現れた場合、動物のモニタリングは出現の数時間以内に強化される。動物の福祉が48時間以内に悪化したり改善しなかったりすると、耐え難い苦しみのレベルに達し、安楽死が行われると考えられます。
  4. 選択時には、切断によって麻酔薬を使用したマウスを犠牲にし、さらなる分析のために脳を収穫する。
  5. イオブルラン麻酔後に安楽死(切断)を行う(5%)。

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Representative Results

実験タイムライン、手順、フォローアップ、死亡率
図1A および 図1B は、血液の二重インタシビサーナル注入によるSAHモデルプロトコルを要約する。簡単に言えば、SAH誘導(D-1)の初日に、相同マウスから取り出された60μLの血液または60μLの人工脳脊髄液(aCSF)をそれぞれSAHまたはシャム状態でシスタンナマグナに注入した。翌日(D0)、相同マウスから取り出された30μLの血液または30μLのaCSFが、それぞれSAHまたはシャム状態でシスタンナマグナに注入された。手術後24時間、マウスの死滅および脳解析は 、図1Cに示すように、血管内腔への血液分布を観察することを許した。D1から犠牲への一般的な福祉のための敏感な指標として、体重は毎日D1からD8に評価され、D1からD8(図1D)までのシャム動物と比較してSAHで有意に減少した体重増加を示し、長期回復プロセスおよびSAH後の長期の病理学的事象を示唆した。術後の死亡率はD7で26.7%で、ほとんどの動物は手術後にD1またはD4で死亡した(図1D)。D5でのインドのインクの経心的灌流は 、図1Cに示すように巨視的なCVSの観察を可能にした。

SAH後の脳血管れん縮
El Amkiら22が示すように、バジラー動脈(BA)のCVS、中大脳動脈(MCA)および前大脳動脈(ACA)は、D3からD10手術後のいずれかにACA、MCAまたはBAのいずれかで血液の二重インタセレーター注射によってSAHモデルに存在した。簡単に(図2A)、マウスの犠牲と切断後、脳を収穫し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)に後固定し、次いで-80°Cで凍結した後、クライオスタットを使用して20μmの横切りスライスにスライスした。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、BA(インターアウラル0.40mm;ブレグマ-3.40mm)、MCA(インターアウラル2.58mm;ブレグマ-1.22mm)およびACA(インターラウラル4.90mm;bregma 1.10mm)に対して行われ、カメラマウントを用いた色スライスの体系的な画像取得を介してCVSを識別することを可能にした。巨視的CVSの存在または存在を評価するために、各染色された動脈について内腔面積/壁厚比を計算した。低いほど、比は、より深刻な CVS です。したがって、SAH脳では、シャムマウス脳(図2B)と比較してBAでCVSが発生したが、他の大脳動脈においても(MCA、ACA、データは22を示さない)。

SAH後の感性運動障害
特定の運動障害の測定は、El Amkiらら22およびClavierら23によってこのSAHモデルに十分に記載されており、これらのSAH関連の長期効果を調節する特定の治療標的を試験する結果の主な評価基準と考えることができる。簡単に(図3A)、D6術後に、各マウスを10分間のオープンフィールドテストで評価した。ANY迷路ソフトウェアバージョン4.99により、カバー距離と飼育と傾きの数が記録されました。オープンフィールドテストの24時間後、各マウスは、デバイスの慣化期間の後、総歩行時間の測定、プラットフォームに到達する時間、および旅行の数を含むビームウォーキングテストの3つの連続したセッションに参加しました。結果は3つのセッションの平均として表された。El Amkiらら22が示すように、D10手術後のビーム歩行試験で評価した感性運動障害は、SAHモデルに存在することが示された(図3B)。D9では、10分間のオープンフィールド試験で評価されたマウスの自発的な活動は、シャム条件と比較して交差する距離と垂直活動によって検出されたSAHによっても有意に影響を受けた(図3C)。

Figure 1
図 1.実験設計、外科的処置、血液分布、巨視血管れん縮、体重および死亡率後のSAH。 (A) このプロトコルの実験計画を示す概略図。D-1とD0は、それぞれ水槽マグナにaCSF(シャム)または血液(SAH)の60と30 μLの二重注入で手術の日を表します。D1からD8まで、マウスを毎日観察し、体重を量った。D1では、脳が採取され、血管内腔への血液分布を観察する(C)。D6とD7は、オープンフィールドとビームウォーキングテストを含む行動分析のための最適化された時間枠として選択されました。D8では、脳をサンプリングしてCVSを評価した。(B) 水槽マグナへの血液注射の外科的処置.ホモツマウスの頸動脈から血液を採取した。動物の準備と立体化フレームへの設置後、後輪でうなじを行い、後部筋を分離し、その後、下層の筋肉を解剖して、システルナマグナを区切る血管化膜へのアクセスを開いた。ピペットは、血液注射の前に水槽マグナに挿入された。(C) 手術後24時間経過後の血管腔への血液分布の図と、SAHでの手術の5日後のインドのインクの経心面灌流後の巨視的なCVSを、シャムの状態と比較した。(D) シャム(n=10)およびSAH C57Bl/6J(n=15)マウスにおけるD-1からD8手術後への体重の進化。SAHマウスは、シャムマウスと比較してD1からD8への体重増加の割合の減少を示した(p<0.01)。多重比較試験のためのボンフェローニのポストホックテストを用いたANOVA。恥ずかし(n=10)およびSAH C57Bl/6J(n=15)マウスにおける手術後の生存曲線。データはカプランマイヤー曲線として表現されました。SAHマウスは、D7手術後に、シャムマウスと比較してより重要な死亡率を示した(p<0.05)。マンテルコックステスト。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.脳血管れん縮解析の実験設計と脳血管れん縮の経時性のSAH後のバジル動脈における時間変化(A) CVS定量のためのプロトコルの実験設計を示す概略図。4%PFAによる後の固定後、凍結した脳は、ゼラチンコーティングされたガラススライド上の20μmの横切りスライスにクライオスタットを使用して連続的にスライスされた。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、ACA、MCAおよびBAを有する脳スライスから行われた。マイクロフォトグラフィは、200倍の倍率で顕微鏡カメラを使用して取得しました。ルーメン面積及び容器壁厚を、単純なブラインド法によりImageJを用いて定量した。(B) SAH後のBAにおけるCVSのタイムコース。D7ポストSAHにおけるシャムおよびSAH脳スライスにおけるBA形態(ルーメン領域および壁の厚さ)を示すH&E染色の代表的なマイクロフォトグラフィー。手術後のD3からD10までのBA内のCVSを示す内腔領域/壁厚比の定量化ヒストグラム(*, p<0.05)。データは平均値±SEM n=6/条件として表現した。多重比較のためのボンフェローニのポストホックテストを用いたANOVA。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.SAH後長期感性運動障害の行動解析のための実験的設計(A)SAH後の行動解析プロトコルの実験計画を示す概略図。A簡単に言えば、D6術後に、マウスの運動活動行動を10分間のオープンフィールド試験で評価し、対象距離と飼育数と傾きの数を記録した。24時間の休息期間の後、マウスの感性運動挙動をビームウォーキングテストによって評価し、歩行時間、プラットフォームに到達するまでの時間および旅行回数を記録した。(B) エル・アムキら22: ビーム歩行試験では、SAHマウスはD7(**,p<0.01)、D10(***,p<0.001)およびD14(*, p<0.05)およびD10のシャムマウス(*, p<0.05)の対照と比較して旅行数が増加した(*, p<0.05)(C) エル・アムキら22: SAHマウスは、D9(*, p< 0.01)のシャムマウスと比較して、交差する距離(*, p < 0.05)と垂直活性が減少した。ANOVAの後にシダックの多重比較テストが行われた。データは平均±SEM.n=10-12/条件として表した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

SAHの分野での研究の強度と、過去20年間で血管内および薬理学的治療オプションなどの治療戦略の開発が増加しているにもかかわらず、入院の最初の週以内に死亡率は高く、次の6ヶ月間に約50%に達する24,25。 24,25この現在の前臨床モデルは、シスタンナマグナへの相同動脈血の毎日の二重注入によって、その有効性と低死亡率との関連について認識されている。,確かに、SAHげっ歯類モデルの中で、 広範囲の死亡率が報告されている:シスタンナmagn,,26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、10-33%35の死亡率、プレキアズマチックシスター,32,3326,27,28,2930,3134,,,2020、27、27,36,,37, 16-66% 血管穿穿率によってモデルの死亡率38,,39,,40, 41 ,42,,43,,44,45および 0-43% シスタンナマグナに二重の血液注入によってモデルと34,,35,,46,,4147,,48.モデルの低い死亡率(マウスの年齢に応じて9%または27%)は、他の二重注射モデルと比較して、注射の弱い量、注射の遅い持続時間、および脳幹への局所的な圧力を避ける動物の傾きから生じる可能性がある。SAH患者では、CVS発生のウィンドウは、D4-D10後出血で古典的に検出される。しかしながら、動物では、CVSの発症までの時間および持続時間が少なく、HSAモデル間で異なる可能性があり、実験プロトコルおよび動物種21に依存する可能性が高い。

この文脈では、ここでのモデルは、SAH関連CVSの観点から臨床SAH生理学的病理学に似ている。一般に、血管内穿穿モデルにおいて、CVSは、マウス17においてラット40で1時間後及び3日後にMCAおよびBAで生じる。プレキアシムシテルへの血液注入によるモデルでは、CVSの発生はラットの2つの49と8日間37の間に示された。ラットの水槽マグナへの二重注入のモデルでは、CVSは10分29日から3日31の間に発症する。我々は、SAHのマウスモデルにおけるCVSの出現の運動を2回注射して、3日から主大脳動脈(ACA、MCAおよびBA)にCVSを確立し、SAH患者に観察されるものに近い10日目のポストSAH22まで持続することを最初に説明する。この最後のモデルは、死亡率なしで十分に重度のSAHの熟練したモデルとして定義することができ、CVSを標的とするメカニズムおよび治療の調査を可能にする。

ただし、このマウス SAH モデルは、いくつかの制限を提示する場合もあります。第1のポイントは、おそらくコラゲラーゼ誘発SAHモデルで再現されるように、血管基底層層50の破壊/消化を通して血管壁破裂の欠如である。巨視的なCVSの発生については、一部の脳領域における脳血流低下(CBF)は神経学的結果と体系的に相関しないため、CBFはSAHのこの提案されたモデルで評価されるべきである。二重注射のSAHモデルでレーザードップラーフローメトリーを使用した以前のラット研究は、CBF急性減少を最初の注射後のベースラインから30〜52%に示し、注射後2〜3日後にベースラインに戻った51、52、53。51,52,53一致して、ラット二重注入モデル54、55でSAH誘導後、D3で33-50%、D5で27〜44%のCBFの減少をMRIによって示した。,55水槽マグナへの二重注入は、特に後部循環の周りの血栓を生じ、くも膜下腔に沿って血液の予測可能な分布を可能にするが、生理学的パラメータの変動を導入することができる。脊柱管に入る注入された血液の量とともに頭蓋内圧(ICP)が上昇するのを避けるために、両方とも交和機能障害56につながり、他のモデル30、51,51で以前に行われたように、脳脊髄液の同等の体積を除去する選択を行うことができる。ここでのモデルでは、偽マウスは実験に応じてaCSFまたは生理学的0.9%NaClの同等の体積を受け取り、明らかにICPの上昇につながった。,58したがって、 ICPの急激な増加は、シスタンナマグナモデルにおける単回血液注射で18mmHgから120mmHg27、48、53に増加し、46から107 mmHg27,48,53 2727、37、49、37,49および27から110 mmHg39、40、53、5740,53,57血管モデルに増加する。 39対照的に、水槽マグナへの二重血液注射は、60から67mmHg48、53に小さい48,53ICP増加と関連していた。さらに、CSF を削除するアクションも ICP を変更し、CSF を変更します。ここでのSAHモデルでは、血液注射前にCSFを除去するのではなく、30°から動物の頭部をヒルトする手順によって手術に伴うことを決定しました。目的は、前循環への血液分布を可能にすることによってICPを減衰させることであり、ヒトSAH生理学的病理を模倣するための重要かつ必要なステップである。SAH患者では、ICPの急激な上昇が検出され、一過性の世界的脳虚血59に関連しており、自己調節および早期神経細胞喪失60の持続的な障害に寄与する可能性が高い。しかし、SAH後の最初のイベントの後、初期の外部心室排液がしばしば懸念されるSAH患者に採用され、脳の腫脹および水頭症61を回避する。ここで、二重注射SAHモデルは、患者に観察されるICP依存的な結果を引き起こす最初の出血事象では重症ではないかもしれないが、SAH後の数日間の持続的で軽度の強化されたICPを再現する可能性が高い。

また、ここでのSAHモデルにおける別の制御不能なパラメータは、過度に急速な血液注射手順27によって誘発される平均動脈血圧(MABP)の潜在的な変動であった。実際、MABPは典型的には、脳灌流圧を維持するために実験的なSAHの後に急性に上昇し、その後、ベースラインに落ちる。ここでのSAHモデルでは、これらのMABP変動を避けるために、血液またはaCSF(〜10μL/min)を低い速度で注入しました。ヒトで観察されたものを模倣したこのモデルにおける神経生物学的事象について、我々は以前、SAHの二重血液注入モデルが、SAH222の3日目から10日目までの潜在的な血管拡散の欠陥を含む、長期的なCVS、微小血栓症形成および脳脳損傷を誘導することを示した。しかし、CSDがSAH関連DCI13 に関与していることを説明する最近のデータは、二重注入のマウスモデルにおけるこの種の調査の追求を強く支持する。これは、CSDを標的とした新しい治療法の有益な影響に科学的ブレークスルーを可能にするはずです。

結論として、システルナマグナへの全動脈血液の二重注入モデルは、CVS、微小血栓症、血管炎症、神経学的欠損および死亡率を含むヒトSAH生理病理学を模倣する簡単な方法を可能にするマスターモデルである。これは、SAH関連のモルビ死亡率を治療するための新しい治療アプローチをテストするための検証されたモデルを表す。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

私たちは、イメージング機器のためのPRIMACENプラットフォーム(ノルマンディールーアン大学、フランス)とアルノー・アラボ氏、ジュリー・モーコテル夫人、マーティン・デュボア夫人に動物の住宅とケアに感謝します。私たちは、プロトコルのビデオ撮影に彼女の声を貸してくれたセレステ・ニコラ夫人に感謝します。この作品は、Seinariノルマンディー成熟プログラム、FRMのイージスの下でフォンダシオンAVC、ノルマンディールーアン大学とインセルムによってサポートされました。ノルマンディー地域と欧州連合(3Rプロジェクト)ヨーロッパは欧州地域開発基金(ERDF)でノルマンディーに関わる。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

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神経科学、問題162、くも膜下出血、水包系マグナ、マウス、血管れん縮、動物モデル、感性刺激性運動検査、血液
くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射
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Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

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