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Neuroscience

Doppelte Direkteinspritzung von Blut in die Cisterna Magna als Modell der subarachnoiden Blutung

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Wir beschrieben in diesem Protokoll ein standardisiertes subarachnoides Blutungsmodell (SAH) durch eine doppelte Injektion von autologem Vollblut in die Zisternenmagna. Der hohe Standardisierungsgrad des Doppelinjektionsverfahrens stellt ein mittleres bis akutes Modell der SAH mit relativer Sterblichkeitssicherheit dar.

Abstract

Unter den Schlaganfällen macht subarachnoidieide Blutung (SAH) nach dem Bruch eines zerebralen arteriellen Aneurysmens 5-9% aus, ist aber für etwa 30% der gesamten Schlaganfall-bedingten Mortalität mit einer wichtigen Morbidität in Bezug auf das neurologische Ergebnis verantwortlich. Ein verzögerter zerebraler Vasospasmus (CVS) kann am häufigsten in Verbindung mit einer verzögerten zerebralen Ischämie auftreten. Verschiedene Tiermodelle von SAH werden nun verwendet, einschließlich endovaskulärer Perforation und direkte Injektion von Blut in die Zisterne magna oder sogar die prächiasmatische Zisterne, die jeweils deutliche Vor- und Nachteile aufweisen. In diesem Artikel wird ein standardisiertes Mausmodell der SAH durch doppelte direkte Injektion von bestimmten Mengen autologen Vollbluts in die Zisterne magna vorgestellt. Kurz gesagt, Mäuse wurden gewogen und dann durch Isofluran-Inhalation besäugt. Anschließend wurde das Tier in eine Liegeposition auf einer beheizten Decke mit einer Rektaltemperatur von 37 °C gelegt und in einem stereotaktischen Rahmen mit einer Zervixbiegung von etwa 30° positioniert. Einmal an Ort und Stelle, wurde die Spitze einer länglichen Glasmikropipette, gefüllt mit dem homologen arteriellen Blut aus der Halsschlagader einer anderen Maus gleichen Alters und Geschlechts (C57Bl/6J), mittels eines Mikromanipulators im rechten Winkel in Kontakt mit der atlanto-okzipitalen Membran positioniert. Dann wurden 60 l Blut in die Zisterne-Magna injiziert, gefolgt von einer 30°-Abwärtsneigung des Tieres für 2 Minuten. Die zweite Infusion von 30 l Blut in die Zisterne magna wurde 24 h nach der ersten durchgeführt. Die individuelle Nachbeobachtung jedes Tieres erfolgt täglich (sorgfältige Bewertung von Gewicht und Wohlbefinden). Dieses Verfahren ermöglicht eine vorhersagbare und hochreproduzierbare Blutverteilung, die wahrscheinlich mit einer intrakraniellen Druckerhöhung einhergeht, die durch eine gleichwertige Injektion einer künstlichen zerebralen Rückenmarksflüssigkeit (CSF) nachgeahmt werden kann, und stellt ein akutes bis mildes Modell der SAH dar, das eine niedrige Sterblichkeit induzieren.

Introduction

Subarachnoide Blutungen (SAH) machen bis zu 5% aller Schlaganfallfälle aus und stellen eine relativ häufige Pathologie mit einer Inzidenz von 7,2 bis 9 Patienten pro 100.000 pro Jahr dar, mit einer Sterblichkeitsrate von 20%-60% je nach Studie1,2,3. In der akuten Phase ist die Sterblichkeit auf die Schwere von Blutungen, Blutungen, zerebralen Vasospasmus (CVS) und/oder medizinischen Komplikationen4zurückzuführen. Bei Überlebenden ist eine frühe Hirnverletzung (EBI) mit einer parenchymalen Verlängerung der Blutung und einer abrupten Erhöhung des intrakraniellen Drucks verbunden, was in etwa 10%-15% derFällezu primärer zerebraler Ischämie5 und sofortigem Tod führen kann. Nach dem ersten "akuten" Stadium der SAH hängt die Prognose vom Auftreten einer "sekundären" oder verzögerten zerebralen Ischämie (DCI) ab, die bei fast 40% der Patienten durch zerebrale Computertomographie und bei bis zu 80% der Patienten nach Magnetresonanztomographie (MRT)7,8. Zusätzlich zu den CVS, die zwischen 4 bis 21 Tage nach einem Aneurysmbruch bei einer Mehrheit der SAH-Patienten auftreten, kann DCI9 aus multifaktoriellen diffusen Hirnläsionen resultieren, die sekundär zur Mikrothrombosebildung, reduzierter zerebraler Perfusion, Neuroinflammation und kortikaler Ausbreitungsdepression (CSD)10,11,12,13. Dies betrifft 30% der SAH-Überlebenden und wirkt sich auf kognitive Funktionen wie visuelles Gedächtnis, verbales Gedächtnis, Reaktionszeit und Exekutive, visuospatial und Sprachfunktionen14 Beeinträchtigung des täglichen Lebens15. Aktuelle Standardtherapien zur Vorbeugung von CVS und/oder den schlechten kognitiven Ergebnissen bei SAH-Patienten basieren auf der Blockade der Ca2+-Signalisierung und Vasokonstriktion durch die Verwendung von Ca2+-Kanalinhibitoren als Nimodipin. Neuere klinische Studien zur Vasokonstriktion ergaben jedoch eine Dissoziation zwischen dem neurologischen Ergebnis des Patienten und der Prävention von CVS16, was auf komplexere pathophysiologische Mechanismen hindeutet, die an SAH-langfristigen Folgen beteiligt sind. Daher besteht ein medizinischer Bedarf an einem besseren Verständnis der Anzahl der pathologischen Ereignisse, die sah begleitet, und der Entwicklung gültiger und standardisierter Tiermodelle zur Erprobung ursprünglicher therapeutischer Interventionen.

Der Bruch eines intrakraniellen Aneurysmen, das hauptsächlich für sah beim Menschen verantwortlich ist, ist in präklinischen Tiermodellen wahrscheinlich schwer nachzuahmen. Derzeit kann der Aneurysmbruch und die SAH-Situation vorläufig durch die Perforation der mittleren Hirnarterie (endovaskuläres Punktionsmodell) getestet werden, die für CVS und sensitivomotorische Dysfunktion bei Mäusen17,18verantwortlich ist. Aufgrund des Fehlens einer möglichen Kontrolle über den Beginn von Blutungen und die Diffusion von Blut in diesem Modell wurden andere Methoden bei Nagetieren entwickelt, um SAH-Modelle ohne endovaskuläre Bruch zu erzeugen. Genauer gesagt bestehen sie aus der direkten Verabreichung von arteriellem Blut in den subarachnoiden Raum durch eine Einzel- oder Doppelinjektion in die Magna zisterne19 oder eine einzelinjektion in die prächiasmatische Zisterne20. Der Hauptvorteil dieser Mausmodelle ohne endovaskuläre Ruptur ist die Möglichkeit, den chirurgischen Eingriff und die Qualität und Quantität der injizierten Blutprobe reproduzierbar zu meistern. Ein weiterer Vorteil dieses Modells gegenüber dem Modell insbesondere durch endovaskuläre Perforation ist die Erhaltung des allgemeinen Wohlbefindens des Tieres. In der Tat ist diese Operation weniger invasiv und technisch weniger herausfordernd als die, die erforderlich ist, um einen Karotiswandbruch zu erzeugen. Bei diesem letzten Modell muss das Tier intubiert und mechanisch belüftet werden, während ein Monofilament in die äußere Halsschlagader eingelegt und in die innere Halsschlagader vorgedrungen ist. Dies führt wahrscheinlich zu vorübergehenden Ischämien aufgrund von Gefäßverstopfung durch den Drahtweg. Folglich ist die Komorbidität (moribunden Zustand, wichtige Schmerzen und Tod) im Zusammenhang mit der Operation weniger wichtig im Doppelinjektionsmodell im Vergleich zu endovaskulären Perforationsmodell. Die doppelte Direkteinspritzung entspricht nicht nur einer konsistenteren SAH, sondern entspricht auch dem Tierschutz in Forschung und Tests (verkürzte Zeit unter Anästhesie, Schmerzen durch Gewebestörungen in der Chirurgie und Not) und führt zu einer Mindestanzahl von Tieren, die für die Protokollstudie und Personalschulung verwendet werden.

Darüber hinaus ermöglicht dies die Umsetzung desselben Protokolls für transgene Mäuse, was zu einem optimierten pathologischen Verständnis der SAH und der Möglichkeit einer vergleichenden Prüfung potenzieller therapeutischer Verbindungen führt. Hier präsentieren wir ein standardisiertes Mausmodell der subarachnoiden Blutung (SAH) durch eine doppelte tägliche konsekutive Injektion von autologem arteriellem Blut in die Zisterne magna in 6-8 Wochen alten männlichen C57Bl/6J Mäusen. Der Hauptvorteil dieses Modells ist die Kontrolle des Blutungsvolumens im Vergleich zum endovaskulären Perforationsmodell und die Verstärkung des Blutungsereignisses ohne eine drastische Erhöhung des intrakraniellen Drucks21. Kürzlich wurde die doppelte direkte Injektion von Blut in die Zisternen magna zu den experimentellen und physiopathologischen Fragen bei Mäusen gut beschrieben. In der Tat haben wir vor kurzem CVS von großen zerebralen Arterien (Basilar (BA), mittlere (MCA) und vordere (ACA) zerebrale Arterien), zerebrovaskuläre Fibrin-Abscheidung und Zellapoptose vom Tag 3 (D3) bis 10 (D10), Kreislaufdefekte von paravaskulärer zerebrospinaler Flüssigkeit begleitet von veränderten sensitivomotorischen und kognitiven Funktionen bei Mäusen, 10 Tage nach der Zeit in diesem Modell22. So macht es dieses Modell gemeistert, validiert und für kurzfristige und langanhaltende Ereignisse nach der SAH charakterisiert. Es sollte ideal geeignet sein, um neue Ziele prospektiv zu identifizieren und für Studien zu potenten und effizienten therapeutischen Strategien gegen SAH-assoziierte Komplikationen zu entwickeln.

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Protocol

Alle Verfahren wurden unter der Aufsicht von H. Castel in Übereinstimmung mit dem französischen Ethikausschuss und den Leitlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates für den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, durchgeführt. Dieses Projekt wurde von der örtlichen CENOMEXA und den nationalen Ethikausschüssen für Tierforschung und -tests genehmigt. Männliche C57Bl/6J Rj-Mäuse (Janvier) im Alter von 8–12 Wochen wurden unter kontrollierten Standard-Umweltbedingungen untergebracht: 22 °C bei 1 °C, 12 Stunden/12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus und Wasser und Nahrung ad libitum.

1. Einrichtung der SAH-Chirurgie und Vorbereitung für die Injektion

  1. Ziehen Sie vor Beginn der Operation eine ausreichende Anzahl von Glaskapillaren mit einem Mikropipette-Puller. Die Injektionspipette sollte einen Innendurchmesser von 0,86 mm und einen Außendurchmesser von 1,5 mm aufweisen.
  2. Bereiten Sie die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) für den Scheinzustand vor.
    1. Bereiten Sie eine Lösung mit 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM Glukose, 26,2 mM NaHCO3 in H2O, pH 7,4 vor.
    2. Gas aCSF mit 95% O2 und 5%CO2 für 15 min, und dann 2,5 mM CaCl2hinzufügen.
    3. Sterilisieren Sie das sauerstoffreiche aCSF mit einem 0,22 m Filtergerät. Die aCSF-Lösung kann 3-4 Wochen bei 4 °C stabil sein. Wenn eine Kontamination (Lösung wird trüb) oder eine Ablagerungsbildung aufgetreten ist, entsorgen und frisch aCSF machen.
  3. Blutentnahme eines homologen Mausspenders
    1. Isolieren Sie die Halsschlagader entlang der Luftröhre und sammeln Sie die maximale Menge an Blut durch Punktion der Halsschlagader.
    2. In der Praxis die Maus in eine Anästhesiekammer geben und die Kammer mit 5% Isofluran beladen, bis das Tier das Bewusstsein verliert.
    3. Überprüfen Sie den Mangel an Reflexen, indem Sie eine von zwei Hinterbeinen klemmen, um die Einstellung des chirurgischen experimentellen Eingriffs zu ermöglichen.
    4. Beschichten Sie eine 1 ml Spritze mit einer Heparinlösung mit einer 26 G Nadel (Heparin-Natrium). Dies wird blutgerinnungsmöglich in den nächsten Schritten.
    5. Installieren Sie das Tier in dorsalen Dekubitus mit Denbeinen auseinander positioniert, und die Nase in einer Anästhesie-Maske (Anästhesie-Wartung mit 2 bis 2,5% Isofluran).
    6. Isolieren Sie die Karotisarterie entlang der Luftröhre, indem Sie den omohyiden Muskel längs sezieren. Einmal arterienisoliert, legen Sie die Nadel in Richtung des Herzens mit Hilfe der Mikrosezieren Haken und Zange und sammeln Sie das Maximum an Blut durch Punktion der Halsschlagader (60 l wird pro SAH-Maus benötigt).
    7. Opfern Sie die anästhesierte Spendermaus unmittelbar nach der Blutentnahme, indem Sie zervikale Dislokation verwenden.

2. Tier (8-10 Wochen alte C57BL/6J männliche Mäuse) Vorbereitung

  1. Wiegen Sie jede Maus präzise mit einer elektronischen Waage. In der aktuellen Studie hätten Mäuse kurz vor der Operation ein Körpergewicht im Bereich von 20 bis 25 Gramm.
  2. Wie bereits erläutert (siehe Schritte 1.3.2 und 1.3.3), wird die Anästhesie von Mäusen operiert.
  3. Rasieren Sie den Hals und den Raum zwischen den Ohren mit einem geeigneten elektrischen Clipper.
  4. Installieren Sie das Tier in ventralen Dekubitus mit Denbeinen auseinander und die Nase in einer Anästhesiemaske (Anästhesiepflege mit 2 und 2,5% Isofluran) auf einem stereotaktischen Rahmen.
  5. Überprüfen Sie, ob die Maus schläft und ob sein Kopf richtig blockiert ist.
  6. Subkutan 100 l Buprenorphin (0,1 mg/kg) mit einer 26 G Nadel in den unteren Rücken injizieren, um Schmerzen nach dem Erwachen zu vermeiden.
  7. Verhindern Sie trockene Augen, indem Sie schützendes flüssiges Gel verwenden und halten Sie eine intrarektale Temperatur von 37 °C durch die Verwendung einer automatisch regulierten elektrischen Decke.
  8. Behandeln Sie den hinteren halsrasierten Bereich mit einer antiseptischen Lösung (Povidon-Jod oder Chlorhexidin mit einer sterilen Baumwollstraße).
  9. Alle Instrumente, die das präparierte Haut-/Unterhautgewebe berühren (2 Stunden auf 200 °C erwärmen) vorsterilisieren und aseptisch behandeln.

3. SAH-Induktion

  1. Am ersten Tag (D-1)
    1. Schneiden Sie einen 1 cm Schnitt mit dünnen Scheren im hinteren Hals, gefolgt von der Trennung der Muskeln entlang der Mittellinie, um auf die Zisterne magna zuzugreifen.
    2. Schneiden Sie die Spitze der leeren Glaspipette mit einer dünnen Schere. Passen Sie sich dann an eine Spritze an, die mit einem flexiblen Silikonstecker verbunden ist.
    3. Übertragen Sie 60 l Blut oder aCSF (für SAH bzw. Scheinzustand) in ein 0,5 ml-Rohr mit einer Präzisionsmikropipette.
    4. Saugen Sie in die Glaspipette die 60 l Blut für die SAH-Bedingung oder 60 l aCSF für den Scheinzustand.
    5. Zur Injektion die Pipette mit einem Ring oder Blue-Tack auf dem stereotaktischen Rahmen installieren und die Pipettenspitze langsam an der Schnittstelle mit der Zisterne magna zur Membran bringen.
    6. Setzen Sie die Pipettenspitze langsam durch die atlanto-okzipitale Membran in die Zisterne magna ein, indem Sie einen Mikromanipulator des stereotaktischen Rahmens verwenden.
    7. Schließen Sie die zuvor mit Blut oder aCSF gefüllte Pipette an die Spritze an, die für die Druckinduktion bereit ist.
    8. Injizieren Sie den Kolben mit einer niedrigen Rate um 10 l/min, um einen akuten intrakraniellen Druck zu vermeiden.
    9. Während der Injektion die Atemfrequenz und die rektale Temperatur genau überwachen.
    10. Am Ende der Injektion die Pipette vorsichtig über den Mikromanipulator abnehmen und optisch sicherstellen, dass es während der Entnahme kein Leck gibt.
    11. Erreiche Hämostase mit einem resorbierbaren Hämostat und führe zwei Nähte mit geflochtenem, nicht resorbierbarem Nahtgewinde.
    12. Unmittelbar nach der Operation, isolieren und positionieren Sie die Maus im Niedergang decubitus und decken Sie es mit einer Überlebensdecke in einem offenen Kasten für die Dauer der Genesung.
  2. Zweiter Tag der Induktion (D0)
    1. Nach 24 Stunden anästhesien (siehe Schritte 1.3.2 und 1.3.3). Subkutan 100 l Buprenorphin erneut injizieren (0,1 mg/kg) und trockene Augen durch Verwendung von schützendem flüssigem Gel verhindern (siehe Schritte 2.7 und 2.8).
    2. Installieren Sie das Tier wie am Vortag auf dem stereotaktischen Rahmen.
    3. Entfernen Sie die Nähte vorsichtig mit mikroscheren.
    4. Bereiten Sie die atlanto-okzipitale Membran wie zuvor vor und wenden Sie antiseptische Präparation auf den rasierten Bereich des Halses mit einer sterilen Baumwollstange an.
    5. Injizieren Sie 30 l Blut oder aCSF mit einer niedrigen Rate (siehe Schritte 3.1.2 bis 3.1.8). Überwachen Sie die Atemfrequenz und die Rektaltemperatur.
    6. Am Ende der Injektion, vorsichtig nehmen Sie die Pipette und kontrollieren das Fehlen von Blutleck während der Entnahme.
    7. Erreiche Hämostase und führe zwei Nähte mit geflochtenem, resorbierbarem Nahtgewinde.

4. Postoperative Nachbeobachtung und Ende des Experiments

  1. Unmittelbar nach der Operation, isolieren und positionieren Sie die Maus im Niedergang Dekubitus mit einer Überlebensdecke auf dem Rücken in einer offenen Box während der Genesung.
  2. Wiegen und beobachten Sie täglich das Verhalten jeder Maus bis zum Opfer (z.B. D7 Post-Surgery).
  3. Unter den humanen Endpunkten wird ein signifikanter Gewichtsverlust (>15% des Gewichts) klassisch bemerkt. Eine "geknickte Rückenhaltung", langsame Bewegungen, Prostration, abnorme Stimmbildungen von Verletzungen und/oder signifikantes aggressives Verhalten sind ebenfalls wichtige Anzeichen für Tierleid. Wenn eines dieser Anzeichen oder eine Kombination von Zeichen auftritt, wird die Überwachung des Tieres innerhalb von Stunden nach ihrem Erscheinen verstärkt. Wenn sich das Wohlergehen des Tieres innerhalb von 48 Stunden verschlechtert oder nicht verbessert, wird davon ausgegangen, dass ein unerträgliches Leiden erreicht und Euthanasie durchgeführt wird.
  4. Zum Zeitpunkt der Wahl, opfern anästhetisierte Mäuse durch Enthauptung, und ernten Gehirne für weitere Analysen.
  5. Euthanasie (Enthauptung) nach Isoflurananästhesie (5%).

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Representative Results

Experimenteller Zeitplan, Verfahren, Follow-up und Sterblichkeit
Abbildung 1A und Abbildung 1B fassen das SAH-Modellprotokoll durch doppelte intrazisternale Blutinjektion zusammen. Kurz gesagt, wurden am ersten Tag der SAH-Induktion (D-1) 60 l Blut, das einer homologen Maus entnommen wurde, bzw. 60 l künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) in die Zisternenmagna in SAH bzw. Scheinbedingungen injiziert. Am nächsten Tag (D0) wurden 30 l Blut, das von einer homologen Maus entnommen wurde, bzw. 30 l aCSF in die Zisternenmagna in SAH- bzw. Sham-Bedingungen injiziert. 24 Stunden nach der Operation erlaubten Maustötung und Gehirnanalyse die Blutverteilung in die paravaskulären Räume zu beobachten, wie in Abbildung 1Cdargestellt. Als sensibler Indikator für das allgemeine Wohlergehen von D1 bis Opfer wurde das Körpergewicht täglich von D1 bis D8 bewertet und zeigte eine signifikante reduzierte Körpergewichtszunahme in SAH im Vergleich zu Scheintieren von D1 bis D8 (Abbildung 1D), was auf einen langanhaltenden Genesungsprozess und längere pathologische Ereignisse nach SAH hindeutet. Die postoperative Sterblichkeit lag bei D7 bei 26,7 %, wobei die meisten Tiere nach einer Operation auf D1 oder D4 starben(Abbildung 1D). Die transkardiale Perfusion der indischen Tinte bei D5 ermöglichte die Beobachtung makroskopischer CVS, wie in Abbildung 1Cdargestellt.

Zerebraler Vasospasmus nach SAH
Wie El Amki et al.22zeigt, war CVS der Basilararterie (BA), der mittleren Hirnarterie (MCA) und der vorderen Hirnarterie (ACA) im SAH-Modell durch doppelte intrazisternale Injektion von Blut in ACA, MCA oder BA von D3 bis D10 post-surgery vorhanden. Kurz (Abbildung 2A), nach Mausopfer und Enthauptung wurden gehirne geerntet und in 4% Paraformaldehyd (PFA) nachfixiert und dann bei -80 °C eingefroren, bevor sie mit einem Kryostat in 20 m Querscheiben geschnitten wurden. Hematoxylin- und Eosinfärbung wurde für BA (interaural e0,40 mm; Bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; Bregma -1,22 mm) und ACA (interaural e4,90 mm; Bregma 1,10 mm) durchgeführt, um eine CVS-Identifikation durch systematische Bildaufnahme von farbigen Scheiben mittels einer Mikroskopkamera zu ermöglichen. Um das Fehlen oder Vorhandensein von makroskopischem CVS zu bewerten, wurde für jede gebeizte Arterie das Lumenflächen-Wanddickenverhältnis berechnet. Je niedriger das Verhältnis, desto schwerer ist der CVS. So trat ein CVS in BA in SAH Gehirnen im Vergleich zu Schein-Maus-Gehirnen (Abbildung 2B), aber auch in anderen großen zerebralen Arterien (MCA, ACA, Daten nicht gezeigt22).

Sensitivomotorische Funktionsstörungen nach SAH
Die Messung spezifischer motorischer Defizite, die in diesem SAH-Modell von El Amki et al.22 und Clavier et al.23gut beschrieben sind, kann als Hauptbewertungskriterium des Ergebnisses betrachtet werden, um spezifische therapeutische Ziele zu testen, die diese SAH-assoziierten Langzeitwirkungen regulieren. Kurz (Abbildung 3A), bei D6 nach der Operation wurde jede Maus im Freifeldtest 10 Minuten lang ausgewertet. Mit Hilfe der ANY-maze Software Version 4.99 wurden die zurückgelegte Strecke sowie die Anzahl der Aufzucht und Neigung aufgezeichnet. 24 Stunden nach dem Freifeldtest nahm jede Maus an drei aufeinanderfolgenden Sitzungen des Strahlwandertests teil, bei denen nach einer Gewöhnungszeit des Geräts die Messung der gesamten Gehzeit, die Zeit bis zum Bahnsteig und die Anzahl der Fahrten zum Einsatz kamen. Die Ergebnisse wurden als Mittel von drei Sitzungen ausgedrückt. Wie El Amki et al.22gezeigt haben, wurden sensitivomotorische Funktionsstörungen, die durch den Strahl-Walking-Test bei D10 nach der Operation bewertet wurden, im SAH-Modell(Abbildung 3B) nachgewiesen. Bei D9 wurde die spontane Aktivität von Mäusen, die durch den Freifeldtest während 10 Minuten bewertet wurden, auch von SAH signifikant beeinflusst, da sie durch die zurückgelegte Entfernung und die vertikale Aktivität im Vergleich zur Scheinbedingung erkannt wurde (Abbildung 3C).

Figure 1
Abbildung 1. Experimentelles Design, chirurgischer Eingriff, Blutverteilung, makroskopischer Vasospasmus, Körpergewicht und Sterblichkeit nach SAH. (A) Schematisches Diagramm, das den experimentellen Entwurf dieses Protokolls zeigt. D-1 und D0 stellen die Tage der Operation mit einer doppelten Injektion von 60 bzw. 30 l aCSF (Sham) bzw. Blut (SAH) in die Zisternenmagna e.V. dar. Von D1 bis D8 wurden Mäuse täglich beobachtet und gewogen. Bei D1 wurden Gehirne geerntet, um die Blutverteilung in paravaskuläre Räume zu beobachten (C). Die D6 und D7 wurden als optimiertes Zeitfenster für Verhaltensanalysen einschließlich Freifeld- und Strahllauftests ausgewählt. Bei D8 wurden Gehirne zur Beurteilung von CVS abgetastet, wie makroskopisch in (C )dargestellt. (B) Chirurgischer Eingriff der Blutinjektion in die Zisterne magna. Blut wurde aus der Halsschlagader einer homologen Maus entnommen. Nach der Tiervorbereitung und Installation auf stereotaktischen Rahmen wurde ein Nackenschnitt im hinteren Hals durchgeführt, die hinteren Muskeln wurden getrennt, und dann wurden die zugrunde liegenden Muskeln seziert, um einen Zugang zur vaskularisierten Membran zu öffnen, die die Zisternen magna begrenzt. Die Pipette wurde vor der Blutinjektion in die Zisterne magna eingeführt. (C) Abbildung der Blutverteilung in paravaskuläre Räume 24 Stunden nach der Operation und des makroskopischen CVS nach transkardialer Durchblutung der indischen Tinte fünf Tage nach der Operation in SAH im Vergleich zu Scheinzustand. (D) Gewichtsentwicklung von D-1 zu D8 nach der Operation bei Schein (n=10) und SAH C57Bl/6J (n=15) Mäusen. SAH-Mäuse zeigten eine Abnahme des prozentualen Gewichtszuwachss von D1 auf D8 im Vergleich zu den Scheinmäusen (p<0.01). ANOVA mit Bonferronis Post-Hoc-Test für mehrere Vergleichstests. Überlebenskurve nach Operation an Scheinmäusen (n=10) und SAH C57Bl/6J (n=15). Die Daten wurden als Kaplan Meier Kurven ausgedrückt. SAH-Mäuse zeigten eine wichtigere Sterblichkeit bei D7 nach der Operation im Vergleich zu Scheinmäusen (p<0.05). Mantel-Cox-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Experimentelles Design für zerebrale Vasospasmus-Analyse und Zeitverlauf des zerebralen Vasospasmus in der Basilararterie nach SAH. (A) Schematisches Diagramm, das die experimentelle Konstruktion des Protokolls für die CVS-Quantifizierung zeigt. Nach der Postfixierung um 4%PFA wurden gefrorene Gehirne mit einem Kryostat seriell in 20 m querversale Scheiben auf gelatinebeschichteten Glasrutschen geschnitten. Hematoxylin und Eosin (H&E) Färbung wurde aus Gehirnscheiben mit ACA, MCA und BA durchgeführt. Mikrofotografien wurden mit einer mikroskopisch montierten Kamera bei einer 200-fachen Vergrößerung angeschafft. Lumenfläche und Gefäßwanddicke wurden mit ImageJ mit einer einfachen Blindmethode quantifiziert. (B) Zeitverlauf von CVS in BA nach SAH. Repräsentative Mikrofotos von H&E-Färbungen, die BA-Morphologie (Lumenfläche und Wanddicke) in Schein- und SAH-Gehirnscheiben bei D7 post-SAH zeigen. Quantifizierung stogramme des Lumenflächen-Wanddicken-Verhältnisses, das CVS im BA von D3 bis D10 nach der Operation zeigt (*, p<0,05). Die Daten wurden als Mittelwert s SEM. n=6/Bedingung ausgedrückt. ANOVA mit Bonferronis Post-Hoc-Test für mehrere Vergleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Experimentelles Design zur Verhaltensanalyse von langfristigen sensibilisierenden Defiziten nach SAH. (A) Schematisches Diagramm, das das experimentelle Design des Verhaltensanalyseprotokolls nach SAH zeigt. Kurz gesagt, bei der D6-Postchirurgie wurde das motorische Aktivitätsverhalten von Mäusen durch einen Open-Field-Test für 10 Minuten bewertet, in dem die zurückgelegte Strecke und die Anzahl der Aufzucht und Neigung aufgezeichnet wurde. Nach einer 24-Stunden-Ruhezeit wurde das sensitivomotorische Verhalten von Mäusen durch den Strahl-Walking-Test bewertet, bei dem die Gehzeit, die Zeit zum Erreichen des Bahnsteigs und die Anzahl der Fahrten aufgezeichnet wurden. (B) Von El Amki et al.22: Im Strahlwandertest zeigten SAH-Mäuse eine erhöhte Anzahl von Fahrten im Vergleich zu Kontrollen bei D7 (**, p<0.01), D10 (***, p<0.001) und D14 (*, p<0.05) und mit Scheinmäusen bei D10 (*, p<0.05). (C) Von El Amki et al.22: SAH-Mäuse zeigten eine verringerte Entfernung überschritten (*, p < 0,05) und vertikale Aktivität im Vergleich zu Scheinmäusen bei D9 (*, p< 0.01). ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Daten wurden als Mittelwert s SEM. n=10-12/Bedingung ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Trotz der Intensität der Forschung auf dem Gebiet der SAH und der Entwicklung von therapeutischen Strategien wie endovaskulären und pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten, die in den letzten zwanzig Jahren zugenommen haben, bleibt die Sterblichkeit innerhalb der ersten Woche der Krankenhauseinweisung hoch und erreicht in den folgenden 6 Monaten etwa 50%24,25. Dieses aktuelle präklinische Modell durch tägliche Doppelinjektion von homologem arteriellem Blut in die Zisterne magna wurde für seine Gültigkeit und seine Assoziation mit einer niedrigen Sterblichkeitsrate anerkannt. In der Tat, unter SAH Nagetier-Modelle, eine breite Palette von Sterblichkeitsraten wurde berichtet: 0-16% Mortalität mit einmaliger Blutinjektion in Zisternen magn26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, 10-33% Mortalität mit Blutinjektion in prächiasmatische Zister20,27,36,37, 16-66% Mortalität im Modell durch endovaskuläre Perforation38,39,40,41,42,43,44,45 und 0-43% mit dem Modell durch doppelte Blutinjektion in Cisterna magna34,35,46,47,48. Die niedrige Sterblichkeitsrate im Modell (9% oder 27%, je nach Alter der Mäuse) kann auf die schwache Menge des injizierten Blutes, die langsame Dauer der Injektion und die Neigung des Tieres zur Vermeidung lokalisierten Drucks auf das Hirnstamm im Vergleich zu anderen Doppelinjektionsmodellen zurückzuführen sein. Bei SAH-Patienten wird das Fenster des CVS-Vorkommens bei D4-D10 nach der Blutung klassisch nachgewiesen. Bei Tieren sind jedoch die Zeit bis zum Beginn und die Dauer von CVS weniger untersucht und können zwischen DEN HSA-Modellen variieren, wahrscheinlich abhängig von Versuchsprotokollen und Tierarten21.

In diesem Zusammenhang ähnelt das Modell der klinischen SAH-Physiopathologie in Bezug auf sah-assoziierte CVS. Im Allgemeinen tritt CVS im endovaskulären Perforationsmodell im MCA und BA nach 1 Stunde bei Ratten40 und nach 3 Tagen bei Mäusen17auf. Im Modell durch Blutinjektion in prächiasmatische Zisterne, CVS-Vorkommen wurde zwischen zwei49 und acht Tagen37 bei Ratten gezeigt. Im Modell der doppelten Injektion in Cisterna magna bei Ratten, CVS entwickelt zwischen 10 Minuten29 und 3 Tage31. Wir sind die ersten, die kinetische Erscheinung von CVS in einem Mausmodell von SAH durch Doppelinjektion beschreiben, CVS in haupthirnralen Arterien (ACA, MCA und BA) seit 3 Tagen etablieren und bis zum 10. Tag nach SAH22erhalten bleiben, in der Nähe dessen, was bei SAH-Patienten beobachtet wird. Dieses letzte Modell könnte als ein qualifiziertes Modell der SAH definiert werden, streng genug ohne Sterblichkeit, so dass die Untersuchung von Mechanismen und Therapeutika, die auf CVS abzielen.

Dieses Sah-Modell für die Maus kann jedoch auch einige Grenzen setzen. Der erste Punkt ist der Mangel an Gefäßwandbruch, wie möglicherweise im Kollagenase-induzierten SAH-Modell reproduziert, durch Zerstörung/Verdauung des Blutgefäßes Basallamina50. Was das Auftreten von makroskopischem CVS betrifft, so ist die reduzierte zerebrale Durchblutung (CBF) in einigen Hirngebieten nicht systematisch mit dem neurologischen Ergebnis korreliert, daher sollte CBF in diesem vorgeschlagenen Modell der SAH bewertet werden. Frühere Rattenstudien mit Laser Doppler-Flowmetrie in einem SAH-Modell der Doppelinjektion zeigten die akute Abnahme der CBF auf 30–52% ab dem Ausgangswert nach der ersten Injektion, mit einer Rückkehr zum Ausgangswert nach 2 bis 3 Tagen nach der Injektion51,52,53. In Übereinstimmung, Es wurde durch MRT eine Abnahme der CBF von 33-50% bei D3 und 27-44% bei D5 nach SAH-Induktion in Ratten-Doppelinjektionsmodelle54,55gezeigt. Die doppelte Injektion in die Zisterne magna ermöglicht eine vorhersagbare Verteilung des Blutes entlang des Subarachnoidenraums, was vor allem zu Blutgerinnseln um die hintere Zirkulation führt, kann aber Variationen der physiologischen Parameter herbeiführen. Um zu vermeiden, dass der intrakranielle Druck (ICP) mit dem Volumen des injizierten Blutes in den Spinalkanal steigt, was beide zu verwirrenden funktionellen Beeinträchtigungenführt 56, könnte die Wahl getroffen werden, ein gleichwertiges Volumen von Zerebrospinalflüssigkeit zu entfernen, wie zuvor in anderen Modellen30,51getan wurde. Im Modell hier erhielten Scheinmäuse je nach Experiment ein äquivalentes Volumen von aCSF oder physiologischen 0,9% NaCl, was offensichtlich zu einem Anstieg des ICP führte. So führt eine akute Erhöhung des ICP zu einer Erhöhung von 18 mmHg auf 120 mmHg27,48,53 in der einzelinjektion von Blut im Cisterna magna Modell, von 46 auf 107 mmHg27,37,49 im prächiasmatischen Zisternen-Blutinjektionsmodell und von 27 auf 110 mmHg 39,40,53,57,58 im modell für die endisovaskuläre Perforation. Im Gegensatz dazu war die doppelte Blutinjektion in Cisterna magna mit einer kleineren ICP-Erhöhung von 60 auf 67 mmHg48,53verbunden. Darüber hinaus würde die Aufhebung des GFK auch das ICP verändern und das GFK ändern. Im SAH-Modell wurde hier beschlossen, CSF nicht vor der Blutinjektion zu entfernen, sondern die Operation durch ein Verfahren zu begleiten, das darin besteht, den Tierkopf von 30° zu verkleinern. Ziel ist es, ICP zu dämpfen, indem die Blutverteilung in die vordere Zirkulation zugelassen wird, ein wichtiger und notwendiger Schritt, um die menschliche SAH-Physiopathologie nachzuahmen. Bei SAH-Patienten wird ein starker Anstieg des ICP festgestellt und ist mit einer vorübergehenden globalen zerebralen Ischämie59verbunden, die wahrscheinlich zu einer anhaltenden Beeinträchtigung der Autoregulation und des frühen neuronalen Zellverlusts60beiträgt. Nach dem ersten Ereignis nach der SAH wird jedoch häufig eine frühe externe ventrikuläre Drainage für betroffene SAH-Patienten eingeführt, um Gehirnschwellungen und Hydrocephalus61zu vermeiden. Hier bei der doppelten Injektion SAH-Modell kann nicht schwer beim ersten Blutungsereignis, um die ICP-abhängigen Folgen bei Patienten beobachtet provozieren, aber wahrscheinlich reproduzieren eine anhaltende und milde verbesserte ICP für Tage nach sah.

Ein weiterer unkontrollierter Parameter im SAH-Modell waren hier die möglichen Variationen des mittleren arteriellen Blutdrucks (MABP), die durch ein übermäßig schnelles Blutinjektionsverfahren induziert werden27. Tatsächlich steigt MABP in der Regel nach experimenteller SAH akut an, um den zerebralen Perfusionsdruck zu erhalten, und fällt danach auf die Ausgangsbasis. Im SAH-Modell haben wir hier Blut oder aCSF (ca. 10 l/min) mit einer niedrigen Rate injiziert, um diese MABP-Variationen zu vermeiden. In Bezug auf die neurobiologischen Ereignisse in diesem Modell, die diejenigen imitieren, die beim Menschen beobachtet wurden, haben wir zuvor gezeigt, dass das Doppelblutinjektionsmodell von SAH langanhaltende CVS, Mikrothrombosebildung und hirnschädigende Hirnschäden induziert, einschließlich defekter paravaskulärer Diffusion vom Tag 3 bis Tag 10 nach sah22. Jüngste Daten, die beschreiben, dass CSD an SAH-assoziierten DCI13 beteiligt ist, unterstützen jedoch nachdrücklich die Verfolgung dieser Art von Untersuchungen im Mausmodell der Doppelinjektion. Dies sollte wissenschaftliche Durchbrüche über die positiven Auswirkungen neuer Therapien ermöglichen, die auf den Zentralverwahrer abzielen.

Abschließend möchte ich sagen, dass das Modell der doppelten Injektion von ganzem arteriellem Blut in die Zisterne magna ein gemastertes Modell ist, das eine einfache Möglichkeit ermöglicht, die menschliche SAH-Physiopathologie einschließlich CVS, Mikrothrombose, Gefäßentzündungen, neurologische Defizite und Sterblichkeitsrate nachzuahmen. Es stellt ein validiertes Modell für die Prüfung neuartiger therapeutischer Ansätze zur Behandlung der SAH-assoziierten Morbi-Sterblichkeit dar.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken der PRIMACEN-Plattform (Normandie Rouen University, Frankreich) für bildgebende Geräte und Herrn Arnaud Arabo, Frau Julie Maucotel und Frau Martine Dubois für die Unterbringung und Pflege von Tieren. Wir danken Frau Celeste Nicola dafür, dass sie dem Videotaping des Protokolls ihre Stimme geliehen hat. Diese Arbeit wurde unterstützt durch seinari Normandie Reifungsprogramm, Fondation AVC unter der Schirmherrschaft der FRM, Normandie Rouen University und Inserm. Die Normandie und die Europäische Union (3R-Projekt). Europa beteiligt sich mit dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) an der Normandie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

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Neurowissenschaften Ausgabe 162 Subarachnoide Blutung Zisterne magna Maus Vasospasmus Tiermodell sensitivo-motorischer Test Blut
Doppelte Direkteinspritzung von Blut in die Cisterna Magna als Modell der subarachnoiden Blutung
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Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

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