Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Summary

As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.

Abstract

Anestésicos influenciam a consciência em parte através de suas ações em circuitos thalamocortical. No entanto, ainda não está claro até que ponto os anestésicos voláteis afetam componentes celulares e de rede distintos desses circuitos. As fatias cerebrais ex vivo fornecem um meio pelo qual os pesquisadores podem sondar componentes discretos de redes complexas e desembaraçar mecanismos potenciais subjacentes aos efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas. Para isolar potenciais efeitos de células e efeitos de drogas específicas em fatias cerebrais, os pesquisadores devem ser capazes de ativar independentemente vias de fibras diferentes, identificar populações não sobrepostas de células e aplicar anestésicos voláteis ao tecido em solução aquosa. Neste protocolo, são descritos métodos para medir respostas optogeneticamente evocadas a dois caminhos independentes a diferentes para o neocórtex em fatias cerebrais ex vivo. Respostas extracelulares são registradas para avaliar a atividade da rede e gravações de grampos de remendo de células inteiras direcionadas são realizadas em interneurônios somatostatina e parvalbumin-positivos. Descreve-se a entrega de concentrações fisiologicamente relevantes de isoflurane através de fluido espinhal cerebral artificial para modular as respostas celulares e de rede.

Introduction

Anestésicos voláteis têm sido usados onipresentemente em uma variedade de ambientes clínicos e acadêmicos por mais de um século. Classes distintas de anestésicos têm alvos moleculares únicos, muitas vezes não sobrepostos ^1,2,3, mas quase todos eles produzem inconsciência. Embora seus efeitos comportamentais sejam bastante previsíveis, os mecanismos pelos quais os anestésicos induzem a perda de consciência são amplamente desconhecidos. Os anestésicos podem, em última análise, influenciar tanto o nível quanto o conteúdo da consciência através de ações em circuitos corticotalâmicos, interrompendo a integração da informação em toda a hierarquia cortical 4,5,6,7,8,9. De forma mais ampla, a modulação de circuitos corticotalâmicos pode desempenhar um papel experimentalmente¹⁰ ou farmacologicamente¹¹ estados alterados de consciência, e também pode ser implicada no sono¹² e em distúrbios fisiodósiológicos da consciência^13,14.

A esquiva dos mecanismos subjacentes à perda e ao retorno da consciência durante a anestesia pode ser atribuída parcialmente a ações não lineares e sinérgicas de anestésicos nos níveis celular, de rede e sistemas¹⁵. Isoflurane, por exemplo, suprime a atividade dentro das regiões cerebrais selecionadas 16,17,18, prejudica a conectividade entre regiões cerebrais distantes 19,20,21,22,23, e diminui as respostas sinápticas de forma específica da via^24,25 . Quais efeitos dos anestésicos, do nível molecular ao dos sistemas, são necessários ou suficientes para efetuar a perda de consciência permanece incerto. Além das investigações clínicas substantivas da consciência utilizando técnicas não invasivas ^19,20,26, é importante que os experimentalistas busquem desembaraçar as distintas interações celulares e de rede que subservem a experiência consciente.

Simplificando as interações complexas encontradas no cérebro intacto, as fatias cerebrais ex vivo permitem o estudo de componentes isolados dos sistemas dinâmicos do cérebro⁹. Uma preparação reduzida de fatias combina os benefícios de estruturas anatômicas relativamente intactas de circuitos neurais locais com a versatilidade de manipulações in vitro. No entanto, até recentemente, as restrições metodológicas têm impedido o estudo das propriedades sinápticas e de circuito de insumos de longo alcance em fatias cerebrais^27,28; o caminho tortuoso dos tratos de fibra corticotalâmica tornou a ativação de vias independentes, mas impossíveis por estimulação elétrica.

Investigar os efeitos dos agentes anestésicos nas preparações de fatias cerebrais apresenta desafios adicionais. Sem um sistema respiratório e circulatório intacto, os agentes anestésicos devem ser aplicados no banho, e concentrações cuidadosamente combinadas com concentrações estimadas do local de efeito. Para muitos agentes anestésicos intravenosos, a lenta taxa de equilíbrio no tecido torna as investigações farmacológicas tradicionais laboriosas^29,30. Investigar os efeitos de anestésicos voláteis de gás nas preparações ex vivo é mais tratável, mas também apresenta desafios. Estes incluem a conversão de doses de pressão parcial inaladas em concentrações aquosas, e a necessidade de um sistema de entrega modificado da droga para o tecido através de fluido espinhal cerebral artificial³¹.

Aqui, os métodos são descritos pelos quais os investigadores podem capitalizar as propriedades físico-químicas bem documentadas do anestésico volátil para entrega de drogas para fatias cerebrais ex vivo, ativar entradas específicas de caminhos e camadas para uma área cortical de interesse com alta resolução espacial, e realizar gravações simultâneas de laminar e registros de grampos direcionados de populações selecionadas de neurônios. Combinados, esses procedimentos permitem aos pesquisadores medir alterações induzidas por anestésicos voláteis em várias propriedades de resposta eletrofisiológica observável, do nível sináptico ao nível da rede local.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais descritos neste protocolo foram aprovados pela University of Wisconsin-Madison School of Medicine e public health animal care and Use Committee.

1. Reprodução de camundongos para expressar proteína fluorescente repórter em subpopulações de interneurônios

1. Par homozyogous, cre-dependent tdTomato rato macho com ou homozygous SOM-Cre fêmea ou homozigos pv-cre rato fêmea.
   NOTA: Outras populações neuronais específicas podem ser alvo usando as linhas cre apropriadas.
2. Permita que a prole heteroziga amadureca até pelo menos 3 semanas de idade antes de prosseguir. Para experimentos descritos aqui, genotipagem não é necessária, pois pais homozigos produzem descendentes que são todos heterozigosos tanto para cre recombinase específica do tipo celular quanto alelos repórteres dependentes de Cre.

2. Realizar injeção estereóxica unilateral de construção viral

1. Ajuste as configurações do puxador de micropipette para pipetas de injeção conforme indicado no manual do usuário do instrumento (consulte tabela 1 para as configurações recomendadas). Puxe a micropipette de vidro.
2. Quebre a ponta da extremidade afiada da pipeta de tal forma que o diâmetro da ponta seja de aproximadamente 30 μm com afunilamento mínimo sobre vários milímetros.
3. Usando procedimentos previamente documentados, decida sobre o título adequado e o volume do vírus a ser injetado. Nos experimentos aqui descritos, 1,0 μL (titer: 3.1-5.7 TU/mL) injetado unilateralmente produziu bons resultados.
4. Enchi o volume total da pipeta com óleo mineral. Coloque a pipeta na microsinga e flua uma pequena quantidade de óleo mineral através da ponta para garantir que a ponta não esteja entupida.
5. Frontfill pelo menos 1.0 μL de construção viral. O vetor viral associado a adeno recombinante usado nesses experimentos foi AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Providencie a cortina estéril em uma área cirúrgica. Esterilize as ferramentas para o procedimento estereotax e coloque-a na cortina.
7. Anestesia SOM-tdTomato ou pv-tdTomato animal heterozigous usando isoflurano (3% para indução, 1,5-2% para manutenção) e mistura de oxigênio. Confirme periodicamente o nível cirúrgico de anestesia com beliscão do dedo do pé durante toda a cirurgia. Certifique-se de que o animal não ultrapasse o plano cirúrgico da anestesia monitorando as respirações a cada 10-15 min.
8. Raspe a parte de cima da cabeça do animal. Aplique 70% de álcool isopropílico e solução à base de iodo liberalmente à área cirúrgica e pomada oftalmica às órbitas oculares para evitar a secagem da membrana. Administrar bupivacaína/lidocaína (proporção 1:1, 1,0 mg/kg) subcutânea ao local cirúrgico para anestésico local.
9. Coloque o animal em quadro estereotaxico.
10. Use bisturi para fazer incisão ao longo do eixo sagitário da pele sobrepondo a superfície dorsal do crânio. Retraia a pele usando fórceps. Hidrate o crânio com 0,9% salina conforme necessário.
11. Na superfície do crânio, marque levemente a intersecção das coordenadas anterior e lateral com uma cruz a lápis. Faça um furo nas coordenadas apropriadas no plano transversal (em mm em relação a Bregma, para injeção de córtex cingulado (Cg): anterior 0.2, lateral 0.3; para injeção de tálamo posterior (Po): posterior 2,25, lateral 3.4).
    NOTA: As marcas devem ir além dos limites do orifício de rebarba para fornecer orientação para a colocação precisa da pipeta.
12. Ligue e equilibre a mesa de ar.
13. Reposicione o manipulador de eletrodos do quadro estereotaxico a 0° para injeções em Cg, ou 45° no plano coronal para injeções em Po.
14. Coloque a bomba de seringa no manipulador de eletrodos. Conecte o controlador da bomba de microsinga à bomba de seringa.
15. Navegue pela ponta da pipeta perto (mas não toque) na superfície do cérebro, na intersecção de marcas criadas na Etapa 2.11. Avance a pipeta a aproximadamente 1 mm/s ao longo de seu eixo longitudinal para o cérebro 0,9 mm (injeção em Cg) ou 3,1 mm (injeção em Po). Espere 10 min antes de prosseguir.
16. Injete 1,0 μL de construção viral durante um período de 10 min (100 nL/min). Se for observado o bem-estar do vírus do local de inserção da pipeta, diminua a taxa de injeção para 50 nL/min.
17. Após a injeção, espere 10 minutos antes de retirar lentamente a pipeta de injeção.
18. Sutura para fechar a incisão do couro cabeludo e administrar 2-5 mg/kg meloxicam subcutâneamente.
19. Descontinuar isoflurane e monitorar animais durante o surgimento da anestesia. Permitir a recuperação de acordo com os procedimentos descritos pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Instituição, incluindo a administração de analgésicos.

3. Preparação de fatias cerebrais agudas

1. Permita pelo menos 3 semanas para a expressão de construção viral antes de colher tecido.
2. Prepare 1 L de fluido espinhal cerebral artificial para o procedimento de corte (fatiando fluido espinhal cerebral artificial, sACSF). Consulte a Tabela 2 para obter ingredientes.
3. Durante todo o procedimento de corte, forneça sACSF_{com mistura de} CO₂/5% dissolvida, fornecida via tubo de dispersão de gás.
4. Prepare banho gelado para vibrar microtome de lâmina. Monte o estágio do espécime gelado no microtome e fixe a lâmina de safira no lugar para seção de tecido.
5. Anesthetize rato com 3% de isoflurane e oxigênio até a perda do reflexo de direito.
6. Decapitar o rato usando guilhotina e submergir imediatamente a cabeça em sACSF de 4°C. Para preservar a saúde do tecido, complete as seguintes etapas o mais rápido possível.
7. Abra a cavidade do crânio fazendo uma pequena incisão na base do crânio e removendo suavemente cada placa do crânio. Remova suavemente a dura-mãe subjacente.
8. Enquanto o cérebro ainda está na cavidade do crânio, use a lâmina de barbear para remover o cerebelo. Faça um segundo corte vertical ao longo do plano sagital no hemisfério esquerdo, apenas lateral para a linha média.
9. Prepare o bloco de tecido para seção.
   1. Levante suavemente o cérebro da cavidade do crânio. Coloque o cérebro no papel do filtro com o plano liso e sagital para baixo. Guie o papel do filtro sobre o modelo de bloqueio e alinhe o cérebro ao contorno do modelo subjacente (Figura Suplementar 1).
   2. Faça dois cortes paralelos no plano coronal, conforme indicado pelas linhas do modelo. Adicione uma pequena gota de sACSF para manter o papel do filtro molhado, se necessário.
   3. Coloque o bloco tecidual em sACSF de 4°C brevemente enquanto a etapa 3.8.4 é realizada.
   4. Aplique uma pequena quantidade de super cola no estágio da amostra gelada.
   5. Levante o bloco tecidual do sACSF frio. Use o canto de uma toalha absorvente para afastar o excesso de sACSF. Cole o plano coronal posterior do bloco de tecido ao estágio da amostra, com a superfície dorsal do cérebro voltada para a lâmina de safira.
10. Colete 500 μm de espessura de fatias cerebrais coronais. Coloque fatias de juros na malha de nylon (Figura Suplementar 2) em 34 °C sACSF e deixe o recipiente atingir a temperatura ambiente.
    NOTA: Para experimentos descritos aqui, foram coletados registros eletrofisiológicos de uma seção coronal centrada aproximadamente 2,25 mm posteriormente ao bregma para estudar uma área sensorial não primária, córtex visual secundário medial (V2MM).

4. Preparação de sacos experimentais de fluido espinhal cerebral (eACSF) contendo isoflurane anestésico volátil dissolvido

1. Prepare 300 mL de uma mistura de estoque de 3,0% de isoflurane.
   1. Em um saco de gás politetrafluoroetileno selado, adicione ~100 mL de 95_{% mistura de} gás CO_{2 2} a 20-30 mL de isoflurane líquido e uma pequena quantidade de 0,9% salino. Aguarde pelo menos 30 minutos para permitir o equilíbrio do isoflurane entre as fases líquida e gasosa.
   2. Determine a quantidade de gás isoflurane saturado, V_sentado, para adicionar ao saco de estoque usando a seguinte equação:
      
      onde p%_stock é a composição-alvo do gás de estoque (3% neste caso),_{o estoque} V é o volume final do saco de gás de estoque, P_isoflurane é a pressão parcial de isoflurane à temperatura ambiente (~240 mmHg), e P_total é a pressão atmosférica (~760 mmHg).
   3. Adicione a quantidade calculada de gás saturado a um saco de gás vazio e encha o saco com um volume de 95% de mistura de gás CO₂/5% para levar o volume total de saco de estoque para 300 mL.
2. Prepare 2 L de fluido espinhal cerebral artificial para perfusão da fatia durante o experimento (ACSF experimental, eACSF). Consulte a Tabela 2 para obter ingredientes. Dissolva 95% A_{mistura de} gás CO_{2 2 2} 2 em solução.
3. Prepare dois sacos separados de soluções de Controle e Isoflurane.
   1. Para um saco vazio de gás politetrafluoroetileno, adicione 600 mL eACSF e 600 mL de 95% mistura de gás O₂/5% CO₂ . Rotule esta bolsa como Controle.
   2. Para outro saco de gás politetrafluoroetileno vazio, adicione 300 mL de eACSF. Rotule esta bolsa como Isoflurane.
   3. Escolha uma concentração de fase de gás fisiologicamente relevante de isoflurane. Os experimentos foram realizados utilizando concentrações de gás equivalentes a 1,3% de isoflurane. Camundongos perdem reflexo de direita, e presumivelmente consciência, a 0,9% inalado isoflurane.
   4. Use a seguinte equação para calcular a concentração de fase de gás equivalente à temperatura ambiente, P%(T_room)³¹:
      
      onde p%(_{T corpo}) é a concentração de fase de gás fisiologicamente relevante escolhida na Etapa 4.3.3,_{a sala} T é de 25 °C, e_{o corpo} T é de 37 °C.
   5. Use a seguinte equação para determinar o volume de gás do saco de gás de estoque,_estoque V, para adicionar à solução Isoflurane.
      
      onde a_solução V é o volume de eACSF na bolsa ISOFLURANE (300 mL), P%(_{T room}) é inserida a partir da equação (2), λ é o coeficiente de partição de ostwald salino/gás de isoflurane (λ = 1,2³²), e _p% 32 estoque é a concentração de fase de gás do saco de gás de estoque (P%_stock = 3,0%).
   6. Ao saco de solução Isoflurane, adicione o volume de gás do saco de gás de estoque,_estoque V, calculado na Etapa 4.3.5.
   7. À bolsa de solução Isoflurane, adicione um volume de 95% de mistura de gás DE₂/5% DE CO₂ para levar o volume total de gás na bolsa solução Isoflurane para 300 mL.
4. Agite tanto os sacos control quanto isoflurane no shaker por pelo menos 1 h para permitir o equilíbrio da fase isoflurane.
5. Depois de coletados todos os dados, a concentração correta pode ser verificada usando um monitor de gás anestésico para medir a concentração de gás equilibrado de isoflurane acima da solução restante no saco.
6. Relatar concentrações experimentais de gases voláteis em unidades aquosas, pois as concentrações milimólares são mais robustas às mudanças de temperatura. Use a seguinte equação para converter a concentração da fase do gás de temperatura ambiente,_sala P%(T), para concentração aquosa equivalente (C_aquos, em mM)³¹:
   
   onde α é o coeficiente de partição de Bunsen salino/gás para isoflurane a 25°C³².

5. Preparação de hardware e software para gravações multicanais

1. Configure um sistema de aquisição de dados de 16 canais de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Vários amplificadores disponíveis comercialmente e sistemas de aquisição de dados podem ser usados para coletar gravações multicanais. Nos experimentos descritos aqui, os sinais analógicos são fornecidos através de um painel de referência de eletrodos para dois amplificadores, onde são amplificados (2000x) e filtrados (0,1-10kHz). As entradas analógicas do sistema de aquisição de dados são digitalizadas a 40kHz.
2. Aperte o adaptador de palco apropriado de 16 canais a um micromanipulador de microscópio. Oriente o adaptador de tal forma que as portas do conector feminino estejam voltadas para baixo.
3. Ajuste o ângulo de operação deste micromanipulador de tal forma que ele seja orientado para baixo em direção à câmara de gravação, em um ângulo aproximadamente 70° em relação à horizontal.
4. Conecte a entrada do headstage a uma sonda 16 x 1 para eletrofisiologia in vitro através do adaptador de headstage ancorado ao micromanipulador.
5. Conecte o conector de saída do headstage ao sistema de aquisição de dados.
6. Instale software apropriado para aquisição de dados. Configure 15 canais de entrada para corresponder aos sinais de entrada dos primeiros 15 contatos de sonda multicanal. Configure o canal restante para receber entrada do eletrodo intracelular.
   NOTA: Tome cuidado para considerar mapas de eletrodos e adaptador ao coletar e analisar dados, para garantir que o sinal adequado corresponda ao contato do eletrodo do qual foi coletado.

6. Configuração de protocolos de estimulação de luz

1. Configure o sistema de entrega de luz e instale o software de acompanhamento.
2. Abra o software. Escolha a configuração de fiação de hardware na qual uma fonte de gatilho (Digital/TTL Out) fornece o sinal Trigger In para o sistema de entrega de luz, e o sistema de entrega de luz fornece o sinal Trigger Out para um LED de 470 nm.
3. Monte lente objetiva de alta potência. Usando câmera digital, calibrar o objetivo de alta potência para uso com sistema de entrega de luz.
4. Crie uma nova sequência de perfil de perfis de estimulação de luz.
   1. Crie um padrão de escolha. Nos experimentos aqui descritos, um círculo de diâmetro de 150 μm é usado para permitir a ativação específica de camada de terminais de axônio.
   2. Para construir uma sequência de perfil, copie e cole este perfil para cada um dos vários ensaios.
   3. Crie uma lista de formas de onda que contenha formas de onda de qualquer intensidade de luz, duração do pulso ou número de pulso.
   4. Atribuir aleatoriamente formas de onda a cada perfil. Cada perfil com sua forma de onda atribuída corresponde a um pulso de gatilho de uma entrada TTL Digital ou um teste.
   5. Salve a sequência de perfil.
5. No software de aquisição de dados, crie um novo protocolo.
   1. Defina o número de ensaios para igualar o número de perfis na sequência de perfil apenas criada.
   2. Escolha entradas de sinal para corresponder às configuradas na Etapa 5.6. Configure um protocolo que forneça uma única saída TTL digital, gravando a partir desses 16 canais de entrada por um período de tempo adequado antes e depois do gatilho digital.

7. Colocando sonda multicanal na fatia de tecido cerebral ex vivo

1. Perfuse bolhas eACSF (não em sacos selados) a 3-6 mL/min.
2. Transfira a fatia cerebral contendo área de interesse para a rede de malha na câmara de perfusão de microscópio. Ancorar com harpa de platina (ver Figura Suplementar 3).
3. Gire a grade de malha de tal forma que a linha de contatos de eletrodos na extremidade distata da sonda multicanal seja aproximadamente perpendicular à superfície do pial.
4. Sob iluminação de campo largo e sob controle fino do micromanipulador, abaixe a sonda multicanal em direção à superfície da fatia.
5. Gire a torre do cubo do filtro para engatar o cubo de filtro apropriado para visualização da proteína repórter fluorescente expressa em terminais de axônio de afferents cortical. Se necessário, gire a fatia para alinhar mais precisamente a sonda com a superfície pial.
6. Posicione a sonda logo acima do plano da fatia, ~200 μm a menos da posição alvo final ao longo do eixo x, deixando pelo menos um canal fora do limite da área de tecido sendo gravado
7. Insira lentamente a sonda na fatia movendo o manipulador ao longo de seu eixo longitudinal. Para minimizar os danos ao tecido, basta avançar a sonda na medida em que as pontas afiadas são apenas visíveis abaixo da superfície do tecido. Isso minimizará os danos ao tecido, garantindo que os contatos com eletrodos estejam em contato com o tecido.

8. Fixação de neurônios direcionados de fixação de patches e obtenção de configuração de células inteiras

1. Mude a fonte eACSF para a solução de controle ensacado.
2. Identifique célula fluorescente rotulada para gravação de grampo de remendo direcionado.
   1. Restringir o diafragma de íris de abertura ao menor diâmetro. Engaje uma lente objetiva de baixa potência e leve o tecido ao foco.
   2. Centralize a luz sobre uma área de tecido adjacente (mas não sobreposta) à sonda multicanal.
   3. Engaje o objetivo de imersão de água de alta potência (40x ou 60x), usando cuidado para evitar contato entre a sonda multicanal e a lente objetiva.
   4. Gire a torre do cubo do filtro para engajar o conjunto de filtros apropriado para permitir imagens de células expressando marcador fluorescente dependente de Cre.
   5. Identifique uma célula fluorescentemente rotulada como um alvo para gravação de grampo de remendo. Levante a lente objetiva para criar amplo espaço para baixar uma pipeta de remendo.
3. Carregue uma pipeta de remendo (ver Tabela 1) com solução interna (Tabela 2) e monte a pipeta no suporte de eletrodo. Usando seringa de 1 mL, aplique pressão positiva correspondente ao ar ~0,1mL.
4. Abaixe a pipeta da correção para a solução. Coloque a ponta da pipeta em foco sob orientação visual.
5. Obtenha gravação de células inteiras da célula alvo usando as etapas previamente demonstradas³³.
6. Se o planejamento de avaliar alterações nas propriedades intrínsecas da célula (por exemplo, resistência à entrada, taxa de disparo potencial de ação em resposta às etapas atuais), realize essas gravações. Caso contrário, mova-se para o protocolo de estimulação do axônio abaixo.

9. Ativação optogenética específica da camada dos terminais de axônio

1. Manipule o campo de visão no plano x-y para alinhar o perfil de estimulação da luz com a localização desejada na fatia.
2. Carregue o protocolo de estímulo leve e prepare o sistema de entrega de luz para receber um pulso TTL digital.
3. O optogeneticamente ativa terminais de axônio ao mesmo tempo em que registra potenciais de campo extracelulares e flutuações de membrana intracelular.
4. Mude a fonte eACSF para solução isoflurane e lave a droga por 15 minutos. Se necessário, colete gravações espontâneas durante a lavagem.
5. Repita o passo 9.2-9.3.
6. Mude a fonte eACSF para a solução controlar e lave a droga por 20 minutos. Se necessário, colete gravações espontâneas durante a lavagem.
7. Repita o passo 9.2-9.3.

Results

Uma linha do tempo de etapas descritas no protocolo é mostrada na Figura 1. As entradas corticais que chegam de áreas corticais de ordem superior ou de núcleos talâmicos não primários têm campos terminais parcialmente sobrepostos na camada 1 do córtex visual não primário²⁴. Para isolar caminhos aferentes independentes thalamocortical ou corticocortical, um vetor viral contendo ChR2 e um repórter fluorescente eYFP em Po ou Cg foi injetado. As células dentro do raio de ...

Discussion

Neste manuscrito, é descrito um protocolo para avaliação de respostas intra e extracelulares a caminhos aferentes seletivamente ativados em fatias cerebrais ex vivo.

O uso de ferramentas optogenéticas e esquemas paralelos de gravação permite que os investigadores testem respostas de populações locais a diferentes insumos de regiões cerebrais distantes, enquanto registram simultaneamente de populações-alvo de interneurons. O uso da tecnologia optogenética permite que terminais de axônio de proj...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lente objetiva de campo amplo 2,5x	Lente	Olympus MPLFLN2,5X
40x	Olympus	LUMPLFLN40XW
mistura de 95% O2/5% CO2		Airgas
A16	Sonda NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	de 16 canais
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Monitor
(POET II)	Criticare	602-3A
ATP, sal de magnésio	Sigma Aldrich	A9187	solução intracelular
B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J	O Laboratório Jackson	007914	Camundongo tdTomato dependente de Cre
B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	The Jackson Laboratory	008069	PV-Cre mouse
Belly Dancer Shaker	Thomas Scientific	1210H86-TS	para equilíbrio de sacos de gás selados
Solução de Betadine Marca	genérica
	Marca		para eletrodo de grampo de remendo de cloração de prata
Bupivicaína
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Vidro capilar (gravações de patch clamp)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Borosilicato, ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm, Comprimento: 90,0 mm
Vidro capilar (injeções virais)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3,5"
Controle do micromanipulador júnior	Luigs e Neumann	SM8	para controle do micromanipulador júnior
Controle de manipuladores e mesa móvel	Luigs e Neumann	SM7	para controle de eletrodo multicanal e mesa de mudança
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Digitalizador e software
Tubulação E-3603	Fisher Scientific	14171208	para entrega de mistura de gás 95% O2/5% CO2 para a câmara de incubação + aplicação de pressão durante o patch clamping
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	solução intracelular
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel	Agulha	aposentada
	World Precision	Instruments 50821912	para pipetas de fixação de patch clamp
de enchimento Cubo de filtro para imagem EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Papel de filtro	Fisher Scientific	09801E	colocado sobre o modelo de fatia durante a preparação do bloco de tecido
Extrator de micropipeta flamejante/marrom	Sutter Instrument	P-1000	2.5x2.5 Caixa de filamento
Tubo de dispersão gasosa	Sigma Aldrich	CLS3953312C
Seringa de vidro (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	para enchimento de sacos selados a gás
Ácido glucônico, sal de potássio (K-gluconato)	Dot Scientific	DSG37020	solução intracelular
Glicose	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Sal de sódio	Sigma Aldrich	G8877	solução intracelular
Adaptador de sonda de cabeça	Adaptador NeuroNexus	A16-OM16	para conectar sonda de 16 canais à entrada de cabeça
Pinça hemostática	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, solução intracelular
HS-16 Headstage	Neuralynx	Isoflurano
		07-893-1389
Álcool isopropílico (70%)	VWR International	101223-746
Micromanipulador júnior	Luigs e Neumann	210-100 000 0090-R	para manipulação de eletrodo de grampo de remendo
Módulo de controle de fonte de luz LED	Mightex	BLS-PL02_US	controle de fonte de luz optogenética
Amplificador de Lidocaína
Lynx-8	Fonte	Lynx-8 Aposentada
	Neuralynx
(MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Cubo de filtro vermelho	Chroma	49008	para imagem tdTomato repórter fluorescente
Meloxicam
Porta-micropipetas	Fisher Scientific	NC9044962
Bomba de microsseringa	World Precision Instruments	UMP3-4
Óleo mineral	Marca
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Amplificador
de nitrogênio (para mesa de ar)	Airgas	NI200
Malha de nylon	Fisher Scientific	501460083	esticada sobre ferradura de fio de platina achatado, corte de descanso em cima disso durante as gravações
Nylon, cortado da meia-calça	marca		para criar plataforma de fatia na câmara de incubação, fibras únicas para criar harpa de platina
Pomada oftálmica	Pipeta
	Dot Scientific	307	Para transferir tecido para o equipamento
Fio de platina	VWR International	BT124000	2 cm, achatado, para fazer harpa de platina
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	sistema de entrega de luz optogenética, vem com software PolyScan2
Cloreto de potássio (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Fosfato de potássio (KH2PO4)	de	Dot Scientific	ACSF
	Fisher Scientific	12-640
Lâmina de safira (para vibratome)	VWR International	100492-502
Lâmina de bisturi	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Saco de gás selado	Fisher Scientific	109236
Mesa de deslocamento para microscópio	Luigs e Neumann	380FMU
Bicarbonato de sódio (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Cloreto de sódio (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, solução intracelular
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	O Laboratório Jackson	013044	camundongo SOM-Cre
Instrumento estereotáxico	Kopf	Modelo 902	Dual Small Animal
Super cola	Grampos	886833	fixar o bloco de tecido ao estágio da amostra durante a preparação da fatia
Broca cirúrgica	RAM Products Inc.	Seringa DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
(1 mL) com ponta LuerLock	Fisher Scientific	309628	para aplicação de pressão durante o patch clamping
Seringa (1 mL) com ponta deslizante	WW Grainger, Inc.	19G384	para enchimento de pipetas de braçadeira de remendo
Filtros de seringa	VWR International	66064-414
Microscópio vertical	Olympus	BX51
Micrótomo vibratório	Leica Biosystems	VT1000S
toalhas Wypall	Fisher Scientific	19-042-427