Modelo de Subatividade do Detrusor em Ratos por Transecção de Conus Medullaris

Resumo

Apresentamos um método para estabelecer um modelo de subatividade do detrusor por transecção do cone medular em ratos. A subatividade do detrusor foi estimulada com sucesso nesses animais. O modelo pode ser usado para estudar a função do trato urinário.

Resumo

O objetivo do protocolo apresentado foi estabelecer um modelo de subatividade do detrusor (UD) em ratos através da transecção do cone medular. A laminectomia foi realizada em um total de 40 ratas Wistar (grupo controle: 10 ratos; grupo teste: 30 ratos) pesando 200–220 g, e o cone medular foi transectado no nível L4\u2012L5 no grupo teste. Todos os ratos foram alojados e alimentados sob as mesmas condições ambientais por seis semanas. No grupo teste, a micção da urina foi realizada duas vezes ao dia por seis semanas, e o volume residual médio de urina foi registrado. Um cistometrograma foi realizado em ambos os grupos. A capacidade cistométrica máxima (CCM), a pressão de abertura do detrusor (DOP) e a complacência da bexiga foram registradas e calculadas. O grupo teste apresentou retenção urinária significativa após a cirurgia, tanto durante quanto após o choque espinhal. No entanto, nenhuma anormalidade foi observada no grupo controle. Quando comparado ao grupo controle, o CCM e a complacência da bexiga no grupo teste foram significativamente maiores do que os do grupo teste (3,24 ± 2,261 mL versus 1,04 ± 0,571 mL; 0,43 ± 0,578 mL/cmH 2 O versus 0,032 ± 0,016 mL/cmH 2 O), enquanto o DOP no grupo teste foi menor que o controle (20,28 ± 14,022 cmH 2 O versus 35 ± 13,258 cmH₂ O). Este método de estabelecer um modelo animal de DU pela transecção do cone medular oferece uma excelente oportunidade para entender a fisiopatologia da UD de uma maneira melhor.

Introdução

A subatividade do detrusor (UD) é uma disfunção típica do trato urinário inferior que permaneceu sob estudo. Embora a DU tenha sido definida pela International Continence Society (ICS)¹, inúmeras terminologias diferentes são usadas para se referir a essa doença, por exemplo, "falha do detrusor", "bexiga acontrátil", "arreflexia do detrusor"². A DU, conforme definida pela International Continence Society (ICS) em 2002, é uma contração de força e duração reduzidas, o que resulta em aumento prolongado no tempo de esvaziamento da bexiga, resultando assim na incapacidade de alcançar o esvaziamento completo da bexiga dentro de um período normal.

A DU pode acometer 48% dos homens e 12% das mulheres (com idade entre >70 anos)³ com sintomas do trato urinário inferior. Parece ser multifatorial, e não existe tratamento eficaz. É relatado que o DU é onipresente em pacientes com disfunção vesical neurogênica, como esclerose múltipla⁴, diabetes mellitus⁵, doença de Parkinson⁶ ou acidente vascular cerebral⁷. A DU também pode ser causada por danos nos nervos iatrogênicos, como histerectomia laparoscópica, prostatectomia ou outras intervenções cirúrgicas na pequena pelve⁸. As alterações fisiopatológicas e os tratamentos disponíveis de DU ainda são confusos devido à falta de um modelo animal apropriado para estudo.

O reflexo miccional é controlado por vias espino-bulboespinhais que combinam o centro de micção pontina, o núcleo parassimpático sacral e os centros do córtex mais sênior⁹. A ativação e a manutenção do reflexo da micção dependem principalmente do transporte regular de sinais sensoriais da bexiga para os centros do córtex mais sênior. Pode-se postular que a disfunção sensorial contribui para a UD.

A maioria dos estudos experimentais em animais relacionados a disfunções do trato urinário inferior tem se concentrado em modelos de bexiga hiperativa (OAB)¹⁰. Esses modelos fornecem uma compreensão razoável da fisiopatologia e do prognóstico da OAB. No entanto, apenas alguns modelos de DU foram relatados, por exemplo, lesão supraespinhal (lesões locais, descerebração e oclusão da artéria cerebral média), transecção ou lesão por contusão da medula espinhal, administração sistêmica (por exemplo, ciclofosfamida) ou intravesical de agentes irritantes ou inflamatórios (por exemplo, ácido, acroleína e lipopolissacarídeo)^11,12,13,14 . Dentre esses métodos, apenas o método de transecção da medula espinhal ou lesão por contusão pode ser utilizado no estabelecimento de um modelo animal de DU¹³. Tentativas envolvendo a lesão do centro de micção pontino e dos centros do córtex superior foram abandonadas por causa do trauma grave. Assim, uma maior atenção está sendo dada para encontrar uma localização precisa no centro reflexo da micção para induzir o DU com efeitos colaterais mínimos.

Como mencionado anteriormente, um dos mecanismos de indução de DU é ferir a medula espinhal para danificar a via de sinalização do reflexo miccional. O método de queda de peso de Allen foi desenvolvido para estabelecer animais de laboratório com medula espinhal lesada¹⁵. No entanto, não existem mais dados experimentais disponíveis sobre este método. Além disso, uma vez que partes dos animais recuperaram a função espinhal após acidente vascular cerebral sem UD, não pode ser considerado como um método perfeito para gerar um modelo animal de DU¹⁶.

Em 1987, Bregman excogitou um processo de transectação da medula espinhal para geração do modelo animal de DU e adquiriu dados experimentais¹⁷. No entanto, esse método não foi aplicado para estabelecer o modelo animal de urânio empobrecido. Naquela época, os pesquisadores ainda estavam confusos sobre a patogênese da DU. Como os locais na medula espinhal associados à indução de OAB ou DU são adjacentes entre si, eles não conseguiram encontrar o local exato de dano à medula espinhal para induzir o DU¹⁷. A OAB e o DU foram introduzidos em conjunto ou separadamente por este método. Assim, embora esse método tenha introduzido a UD, ela era imprecisa e não podia ser usada para a compreensão da ocorrência e do processamento da UD.

Como dito acima, a falta de um modelo animal adequado de DU é um dos principais obstáculos para o estudo de DU. Os pesquisadores estão continuamente procurando um modelo preciso e gerenciável que possa simular a patologia da DU. Mesmo as opções de tratamento para DU não melhoraram significativamente durante os últimos 20 anos. Coletivamente, há uma grande necessidade de descrever um protocolo padrão para estabelecer um modelo animal de DU.

Assim, neste artigo, descrevemos um método para estabelecer com sucesso um modelo de DU em ratos por transecção do cone medular. A transecção foi realizada no nível L4\u2012L5 para separar o cone medular. A capacidade cistométrica máxima (CCM), a pressão de abertura do detrusor (POD) e a complacência da bexiga foram registradas e analisadas para validação do protocolo. O protocolo a seguir combinado viabilidade e confiabilidade de forma padronizada para estabelecer o modelo animal de DU, simulando a ocorrência e o processamento de DU. O protocolo pode ser utilizado como técnica para posterior estudo da UD.

Protocolo

Todos os ratos foram utilizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Experimental Animal do Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University.

1. Preparação cirúrgica, anestesia e técnicas cirúrgicas

NOTA: Um total de 40 ratas Wistar, pesando 200–220 g, foram obtidas comercialmente para o presente estudo. Dos 40 ratos, 10 foram selecionados aleatoriamente como o grupo controle, e o restante foi tratado como o grupo teste. Todos os animais foram alojados em um ambiente estéril nas instalações de animais do Hospital da Amizade de Pequim, da Universidade Médica da Capital.

1. Realizar anestesia geral administrando pentobarbital sódico por via intraperitoneal (40 mg/kg). Alternativamente, induza a anestesia usando isoflurano a 3%-4% e mantenha-o em 1%-3% (inalado). Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, coloque o rato na plataforma cirúrgica e forneça suporte térmico.
   NOTA: Administrar analgésicos como buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 mL no início do procedimento.
2. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta à pinça do dedo do pé. Raspe a pele de toda a área das costas com uma navalha.
3. Esterilizar o local cirúrgico com pelo menos 3 ciclos de um esfoliante de dois estágios, como clorexidina ou iodopovidona, seguido de álcool isopropílico. Prenda os membros com fita cirúrgica e faça uma incisão mediana de cerca de 3 cm nas costas com tesoura cirúrgica.
4. Aprofunde a incisão através dos tecidos subcutâneos usando tesoura cirúrgica e corte os músculos ligados à coluna vertebral.
5. Identifique e exponha visualmente a^13ª costela (o espaço intervertebral conectado a essa costela é o intervalo T13\u2012L1). Marque a^13ª costela usando uma sutura.
6. Após a identificação, ressecte cuidadosamente os músculos ligados à coluna vertebral e exponha a coluna vertebral. Ressecção o ligamento supraespinhoso e o ligamento interespinhoso para uma identificação precisa da coluna vertebral. Exponha o nível de L4\u2012L5 com tesoura cirúrgica e pinça.
   NOTA: O ligamento supraespinhoso pode ser facilmente identificado devido à presença de tecido subcutâneo fino. Após a ressecção do ligamento supraespinhoso, o ligamento entre o processo espinhoso é o ligamento interespinhoso.
7. Dissecar cuidadosamente o processo espinhoso vertebral L4\u2012L5 e partes do processo transversal usando pinça de Kelly para expor a medula espinhal (Figura 1).
8. Expor completamente o cone medular ao nível de L4\u2012L5 e transecto o cone medular totalmente com tesoura de iridectomia. Insira um pouco de embalagem de tecido para bloquear a recuperação da medula espinhal.
9. Feche o músculo e a pele sobrejacentes na camada externa da pele usando sutura não absorvível 4-0.
10. Para o grupo controle, execute as etapas 1.1 a u20121.7 e deixe o cone medular intacto. Feche a incisão de acordo com o passo 1.9.

2. Recuperação de animais

1. Manter os ratos numa incubadora com temperatura controlada (37 °C) durante a primeira hora após a operação e monitorizá-los até que estejam esternais ou em movimento ativo.
   NOTA: Demora cerca de meia hora para a recuperação total.
2. Transfira o animal para uma gaiola limpa com comida e água suficientes. Mantenha os ratos em gaiolas separadas.
   NOTA: O sucesso da transecção é indicado quando os ratos do grupo de teste se movem apenas com a ajuda das patas dianteiras, enquanto os ratos do grupo controle podem andar normalmente.

3. Gestão pós-operação

1. Injete Penicilina G, um antibiótico (50.000 U/mL por animal) por via intraperitoneal. Administrar analgésicos como buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 mL a cada 6-12 h por 48 horas após a operação.
2. Comprima a bexiga urinária no hipogástrio para ajudar com a micção. Realize isso duas vezes ao dia no mesmo horário (8h e 20h) por seis semanas.
   NOTA: A perda de constrição normal do detrusor é o símbolo de DU.
3. Coloque todos os ratos em gaiolas metabólicas, cada uma contendo um funil de coleta de urina colocado sobre um papel absorvente previamente pesado para monitorar a micção e a incontinência.
4. Coletar e observar a mudança de peso do papel absorvente, que indica o volume anulado (VV) e o volume residual de urina separadamente.

4. Teste urodinâmico

1. Às seis semanas de pós-operatório, realizar um cistometrograma, utilizando o equipamento de medição urodinâmica da seguinte forma.
   1. Anestesiar ratos injetando 10% de hidrato de cloral na cavidade peritoneal (3 mL/kg).
   2. Comprima a bexiga para micção e, em seguida, fixe o rato à plataforma cirúrgica usando uma fita.
   3. Insira o cateter peridural (3F) na bexiga e conecte o equipamento de medição urodinâmica, o cateter peridural e a bomba de infusão pelo tubo de três membros.
   4. Bombear solução salina fisiológica a uma velocidade de 0,2 mL/min para medição urodinâmica (ver Tabela de Materiais). Registre o CCM e o DOP, e a complacência da bexiga (calculada dividindo δ volume da bexiga com δ pressão do detrusor).

5. Análise estatística

1. Realizar análises estatísticas utilizando software comercialmente disponível.
2. Use o teste de Kolmogorov-Smirnov para testar a normalidade dos dados.
3. Expresse as variáveis normalmente distribuídas como valores médios com desvios-padrão. Use os testes t de Student pareados bicaudais para comparar os parâmetros do cistometrograma em ambos os grupos.
   NOTA: p < 0,05 indica que a diferença teve significância estatística.

Resultados

Todo o procedimento da transecção do cone medular pode ser concluído dentro de 45 minutos por cirurgiões experientes. Nosso laboratório já realizou mais de 100 casos de cirurgias de transecção do cone medular. A taxa de sucesso é superior a 95%, conforme definido pela sobrevivência dos ratos e pela indução bem-sucedida de DU. O teste urodinâmico confirmou a indução de DU.

Com base em nossa experiência, a indução de DU pode ser avaliada preliminarmente pelo volume residual de urina. A retenção ...

Discussão

O DU é uma causa comum de sintomas do trato urinário inferior em homens e mulheres. É uma constelação complexa de sintomas com poucas opções de tratamento que podem diminuir significativamente a qualidade de vida (QV) dos acometidos¹⁸. Embora se acredite que o DU seja multifatorial, a compreensão de sua patogênese permanece rudimentar. Estudos têm demonstrado que a patogênese do DU pode estar relacionada a fatores miogênicos e neurogênicos.

Nas hipóteses miogênicas, obs...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba salina a 0,9%	Wuhan Prosai Company	EY-C1178	para medição urodinâmica
10% de hidrato de cloral	Shandong Yulong Co., Ltd	H37022673	3mL / kg, administrada por injeção intraperitoneal
cloridrato de buprenorfina	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co. LTD	H12020275	0,05mg / kg por via subcutânea 24h e 48h pós-operatório
Cateter epidural	Shandong Xinghua Co, Ltd	VABR3L	para medição urodinâmica
Penicilina G	Alta Technology Co., Ltd	1ST5637	50.000 unidade/ml por animal
pentobarbital	Beijing solabo Technology Co., Ltd	NK-WF0001	40 mg/kg, administrado por via intraperitoneal
Linha de sutura (4-0)	ETHICON	VCP422H	suturar a lesão
Tubo de três membros	Shandong Xinghua Co, Ltd	VAB3T	para medição urodinâmica
Bomba de infusão de traços	Zhejiang Smith Medical Instrument Co., Ltd	20162540335	Bombeie a solução salina a uma velocidade de 0,2 ml / min para medição urodinâmica
Equipamento de medição urodinâmica	Medical Measurement SystemsBV	08-0467	O equipamento de medição urodinâmica pode não apenas ajudar no diagnóstico de disúria, mas também fornecer materiais objetivos para tratamento e efeito terapêutico. É o método de exame mais comumente usado no diagnóstico clínico e tratamento de doenças funcionais do trato urinário inferior
Wistar	Rats HFK Biotechnology Co.Ltd, Pequim, China	SCXK2012-0023	200-220g

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