Manipulação de células-tronco neurais únicas e neurônios em fatias cerebrais usando microinjeção robótica

Resumo

Este protocolo demonstra o uso de uma plataforma robótica para microinjeção em células-tronco neurais únicas e neurônios em fatias cerebrais. Esta técnica é versátil e oferece um método de rastreamento de células em tecido com alta resolução espacial.

Resumo

Uma questão central na neurobiologia do desenvolvimento é como as células neurais de tronco e progenitor formam o cérebro. Para responder a essa pergunta, é preciso rotular, manipular e seguir células únicas no tecido cerebral com alta resolução ao longo do tempo. Esta tarefa é extremamente desafiadora devido à complexidade dos tecidos no cérebro. Recentemente desenvolvemos um robô que guia uma agulha de microinjeção no tecido cerebral ao utilizar imagens adquiridas a partir de um microscópio para fornecer volumes femtoliter de solução em células únicas. A operação robótica aumenta resultando em um rendimento global que é uma ordem de magnitude maior do que a microinjeção manual e permite rotulagem precisa e manipulação flexível de células únicas em tecido vivo. Com isso, pode-se microinjetar centenas de células dentro de uma única fatia organotípica. Este artigo demonstra o uso do robô de microinjeção para microinjeção automatizada de células progenitoras neurais e neurônios nas fatias de tecido cerebral. De forma mais ampla, pode ser usado em qualquer tecido epitelial com uma superfície que pode ser alcançada pela pipeta. Uma vez configurado, o robô de microinjeção pode executar 15 ou mais microinjeções por minuto. O robô de microinjeção devido à sua produtividade e versatilidade fará da microinjeção uma técnica de manipulação celular de alto desempenho amplamente simples para ser usada em bioengenharia, biotecnologia e biofísica para a realização de análises unicelulares em fatias cerebrais organotípicas.

Introdução

Este protocolo descreve o uso de um robô para atingir e manipular células únicas em fatias de tecido cerebral, focando em particular em células-tronco neurais e neurônios únicos. O robô foi desenvolvido para abordar uma questão central na neurobiologia do desenvolvimento, que é como as células neurais e progenitoras contribuem para a morfogênese cerebral^1,2,3,4,5. Para responder a essa pergunta, é preciso rotular e rastrear células-tronco neurais únicas e seguir sua progressão de linhagem ao longo do tempo para correlacionar o comportamento de célula única com morfogênese tecidual. Isso pode ser alcançado de diferentes maneiras, por exemplo, eletroporando tecido cerebral no útero ou rotulando célula única usando mortes lipofílicas. Embora poderosos, esses métodos carecem de resolução celular única precisa (eletroporação) e/ou a possibilidade de manipular o espaço intracelular (corante lipofílico). A microinjeção em células únicas foi desenvolvida para superar este desafio^6,7,8. Durante a microinjeção, uma pipeta é brevemente inserida em uma única célula dentro de tecido intacto sob pressão para microinjetar volumes femtoliter de reagentes⁹. Descrevemos anteriormente um procedimento manual para microinjeção de células-tronco neurais únicas em tecido organotípico(Figura 1A)^10,11. A microinjeção em células-tronco neurais depende do uso de uma micropipette que é inserida em células-tronco neurais únicas para injetar uma solução contendo um corante fluorescente, juntamente com outras moléculas de interesse. O direcionamento seletivo das células-tronco neurais é alcançado aproximando-se do telencephalon em desenvolvimento através da superfície ventricular (ou ventrículo, ver desenho animado na Figura 1A), que é formado pela membrana plasmática apical de progenitores a apical (desenho animado na Figura 1A). Esse processo deve ser repetido para cada célula que o experimentador deseja injetar. Além disso, o sucesso da microinjeção depende do controle preciso da profundidade e duração da injeção de micropipette no tecido. Assim, apesar das vantagens únicas, a microinjeção manual é extremamente tediosa e requer uma prática considerável para realizar a rendimento e rendimento razoável, dificultando o uso dessa técnica de forma escalável. Para superar essa limitação, desenvolvemos recentemente um robô guiado por imagem, o Autoinjetor¹² (ou robô de microinjeção) que pode realizar automaticamente microinjeções em células únicas.

O robô de microinjeção faz uso de algoritmos microscópicos de imagem e visão computacional para atingir precisamente locais específicos em espaço 3D dentro do tecido para microinjeção(Figura 1B). O robô de microinjeção pode ser construído fazendo modificações relativamente simples em uma configuração de microinjeção existente. O esquema geral do robô de microinjeção é mostrado na Figura 1C. Uma pipeta é montada em um suporte de pipeta ligado a um manipulador de três eixos. Uma câmera de microscópio é usada para adquirir imagens do tecido e da agulha de microinjeção. Um sistema de regulação de pressão personalizado é usado para controlar a pressão dentro da pipeta e um micromanipulador programável é usado para controlar a posição da pipeta microinjetor. As imagens da câmera da pipeta tecidual e de microinjeção são usadas para determinar a localização espacial da ponta da pipeta de microinjeção e os locais onde as microinjeções precisam ser realizadas. O software então calcula as trajetórias necessárias para mover a pipeta dentro do tecido. Todo o hardware é controlado pelo software que desenvolvemos anteriormente. Todo o software é escrito em linguagem de codificação (por exemplo, Python e Arduino) e pode ser baixado a partir de https://github.com/bsbrl/Autoinjector com instruções. A interface gráfica do usuário (GUI) permite ao usuário imaginar o tecido e a micropipette, e personalizar a trajetória da microinjeção. Nosso sistema pode ser estabelecido usando modificações relativamente simples em um microscópio invertido equipado com filtros de campo brilhante e epi-fluorescência.

Primeiro, fornecemos instruções sobre o preparo de fatias de tecido organoíspica cerebral para microinjeção. Em seguida, o protocolo ilustra a partida do robô de microinjeção seguido de etapas preparatórias, como a calibração do movimento da pipeta, que precisam ser feitas antes da microinjeção. Isso é seguido pela definição dos parâmetros de injeção. Depois disso, o usuário pode definir a trajetória usada pelo robô de microinjeção e iniciar o procedimento de injeção. O tecido microinjetado (neste caso, as fatias de tecido organoíspico cerebral) pode ser mantido na cultura por diferentes períodos de tempo, dependendo do desenho experimental^10,11. O tecido pode ser processado para seguir e estudar a identidade e o destino das células injetadas e sua descendência. Alternativamente, as células microinjetadas podem ser seguidas usando imagens vivas. No âmbito deste protocolo, demonstramos o uso do robô para microinjeção células progenitoras neurais em fatias organotipípicas do rato E14,5 telencephalon dorsal. O robô é ainda capaz de microinjeção em neurônios recém-nascidos no telencephalon do rato, bem como no teleencefalo fetal humano¹².

Em resumo, descrevemos uma plataforma robótica que pode ser usada para seguir e manipular células únicas no tecido. A plataforma faz uso de pressão e é, portanto, extremamente versátil quanto à natureza química do composto a injetar. Além disso, pode ser adaptado para outras células-alvo além de células-tronco. Esperamos que nosso sistema seja facilmente adaptado a outros sistemas de modelos também.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com a legislação alemã de bem-estar animal, e as licenças necessárias foram obtidas da Comissão Ética Regional para Experimentação Animal de Dresden, Alemanha (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden). As fatias organotípicas foram preparadas a partir de 14,5 ou E16,5 C57BL/6 teleencefalon embrionário de camundongos (Janvier Labs).

1. Instalação de software

1. Siga as instruções para instalar o software a partir de https://github.com/bsbrl/Autoinjector.

2. Preparação de reagentes e pipetas

1. Agarose: Prepare 3% de agarose dissolvendo separadamente 3 g de agarose de ampla gama e 3 g de ponto de baixa fusão agarose em 100 mL de PBS de cultura celular em duas garrafas de vidro separadas de 200 mL, respectivamente. Guarde em temperatura ambiente por até 3 meses.
2. Solução de tyrode: Dissolva 1 g de bicarbonato de sódio e sal de Tyrode (use o teor de toda a garrafa) e 13 mL de 1 M HEPES em 1 L de água destilada. Ajuste o pH para 7,4. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 μm de tampa de garrafa.
3. Meio de cultura de fatia (SCM): Adicionar 10 mL de soro de rato, 1 mL de glutamina de 2 mM, 1 mL penicilina-estreptomicina (100x), 1 mL de suplemento N-2 (100x), 2 mL de suplemento B27 (50x) e 1 mL de HEPES (pH 7,3) tampão em 84 mL de meio neurobásal. Alíquota de 5 mL de SCM em tubos de 15 mL. Armazenar a -20 °C.
4. CO₂-Meio independente de microinjeção (CIMM): Prepare 5x solução de baixa glicose modificada DMEM (sem vermelho fenol) dissolvendo o pó em 200 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm de tampa de garrafa (para o pó DMEM, use o conteúdo de toda a garrafa). Para preparar 100 mL de CIMM, misturar 20 mL de solução modificada 5x DMEM, 1 mL de tampão HEPES, 1 mL de suplemento N2 (100x), 2 mL de suplemento B27 (50x), 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 1 mL de glutamina de 2 mM e 74 mL de água destilada. Armazene a solução a 4 °C.
5. Tampão de reconstituição: Prepare o buffer de reconstituição dissolvendo 262 mM NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES em água destilada. Esterilize a solução através de um sistema de filtro de 0,22 μm em uma garrafa de vidro estéril. Alíquota de 500 μL de tampão de reconstituição em tubos de microcentrifuge herméticos. Armazenar a 4 °C.
6. Estoque de corante de microinjeção: Dissolva o Dextran rotulado fluorescentemente em água destilada livre de RNase (concentração final 10 μg/μL). Prepare 5 alíquotas μL e armazene a -20 °C até usar.
7. Puxe as pipetas de microinjeção de capilares de vidro borossilicato (1,2 mm de diâmetro externo, 0,94 mm de diâmetro interno) utilizando o puxador de micropipette. Proteja as pipetas do pó. Não armazene pipetas por mais de 2 a 3 dias. Para este experimento, os parâmetros de puxar foram HEAT: temperatura da rampa +1 – 5; PUXAR: 100; VEL: 110; 100. HEAT e VEL são os parâmetros que afetam mais a forma e o tamanho da pipeta.
   NOTA: A pipeta de microinjeção ideal tem uma ponta longa e flexível, para evitar danos celulares durante a microinjeção.

3. Preparação de fatias de tecido

1. Derreta a agarose de 3% de largura usando um forno de micro-ondas antes da dissecção do tecido cerebral. Não deixe que a agarose solidifique mantendo-se em um banho de água a 37 °C antes de incorporar. Certifique-se de que as pipetas estão protegidas contra poeira. Não armazene pipetas por mais de 2 a 3 dias.
2. Descongele uma alíquota de SCM e aqueça 10 – 12 mL CIMM e 20 mL da solução de Tyrode a 37 °C usando um banho de água.
3. Misture o rastreador fluorescente (Dextran-3000 ou Dextran-10000-Alexa conjugado; concentração final 5 – 10 μg/μL) com os outros produtos químicos a serem injetados. Centrifugar a solução de microinjeção a 16.000 x g por 30 min a 4 °C. Pegue o supernatante e transfira para um novo tubo. Mantenha a solução de microinjeção no gelo até usar.
4. Use as cabeças dos embriões de camundongos E13.5 – E16.5 para preparar fatias de tecido organotipípico do telencephalon. Remova a pele e abra o crânio usando os fórceps, movendo-se ao longo da linha média. Disseca o cérebro embrionário do crânio aberto e remova as meninges que cobrem o tecido cerebral a partir do lado ventral do cérebro. Deixe o cérebro inteiro dissecado na solução de Tyrode em um bloco de aquecimento de 37 °C.
   NOTA: Todas as etapas de dissecção descritas no 3.4 devem ser realizadas na solução de Tyrode pré-armada.
5. Despeje a ampla gama de agarose derretida em um molde de incorporação descartável. Quando a agarose for resfriada a 38 - 39 °C, transfira cuidadosamente os cérebros (no máximo 4) para ele usando uma pipeta Pasteur. Use sempre dicas de corte para esta etapa.
6. Mexa a agarose ao redor do tecido usando uma espátula ou um par de pórceps #1 Dumont sem tocar no tecido. Deixe a agarose solidificar à temperatura ambiente. Uma vez que a ágarose se solidificou, corte o excesso de agarose ao redor do tecido.
7. Encha a bandeja de tampão com PBS. Oriente o cérebro com o eixo rostro-caudal do tecido perpendicular à bandeja (use como marco as lâmpadas olfativas, representando a maior parte rostral do cérebro). Corte 250 fatias de μm usando um vibratome.
8. Encha uma placa de Petri de 3,5 cm com 2 mL de mídia pré-armada. Usando uma pipeta pasteur de plástico, transfira fatias (10 - 15) para este prato. Uma vez feito, mude a placa de Petri com as fatias na incubadora de cultura de fatias. Mantenha as fatias a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 40% O₂ / 5% CO₂ / 55% N₂ até o uso.

4. Microinjeção

1. Ligue o computador, microscópio, câmera de microscópio, manipuladores, plataforma de pressão e sensor de pressão. Carregue o aplicativo clicando no arquivo "launchapp.py" na pasta principal baixada do GitHub e especifique as configurações do dispositivo na tela pop-up (veja o passo 1.1 para instruções de instalação).
2. Crie uma pressão externa para evitar entupimento indesejado antes de submergir a pipeta na solução. Para aplicar pressão na pipeta, deslize a barra de pressão de compensação para 24 – 45% e clique em Definir Valores. Em seguida, ajuste a pressão a uma pressão suficiente girando o botão da válvula de pressão mecânica para 1 – 2 PSI (69 – 138 mbar) conforme indicado pelo sensor de pressão.
3. Transfira as fatias para uma placa de Petri de 3,5 cm contendo 2 mL de CIMM pré-aquecido. Coloque as fatias para serem microinjetadas no centro da placa de Petri. Transfira a placa de Petri para o estágio de microinjeção pré-aquecido (37 °C).
4. Carregue a pipeta de microinjeção com 1,4 –1,6 μL de solução microinjetada (a partir da etapa 3.3) usando uma pipeta de plástico de ponta longa. Insira a pipeta de microinjeção no suporte da pipeta.
5. Usando a menor ampliação no microscópio, leve a fatia em foco e guie a micropipette para este campo de visão (FOV) para que ela se concentre no mesmo plano que o alvo da fatia. Alterne a saída do microscópio para a câmera para ver o FOV no aplicativo.
6. Clique no botão de ampliação no canto superior esquerdo da interface para iniciar a calibração do dispositivo. Uma janela solicitará a seleção da ampliação. Selecione a ampliação de 10x ou qualquer ampliação que a lente esteja definida (por exemplo, 4x, 10x, 20x, 40x) e pressione Ok. O software pressupõe que a lente objetiva interna seja de 10x (a ampliação da lente objetiva mais comum).
7. Refoque a ponta da pipeta usando a roda micrométrica do microscópio e clique na ponta da pipeta com o cursor. Em seguida, pressione o botão passo 1.1 e pressione OK na janela pop-up. A pipeta se moverá na direção Y. Clique na ponta da pipeta e pressione o botão passo 1.2. Por fim, digite 45 na caixa de ângulo pipeta e pressioneo ângulo definir .
8. Digite parâmetros desejados no painel de controles automatizados de microinjeção. Para microinjeção em progenitores a apical, ajuste a distância de injeção para 20 – 40 μm e profundidade para 10 – 15 μm. Para microinjeção em neurônios, ajuste a distância de injeção de 30 – 40 μm do lado basal e profundidade de 10 a 30 μm dependendo do que está sendo alvo. Sempre defina velocidade para 100%. Clique em Definir valores.
   NOTA: A distância de aproximação é a distância que a pipeta puxa para fora do tecido antes de se mover para a próxima distância de injeção, profundidade é a profundidade no tecido a microinjeção vai, espaçamento é a distância ao longo da linha entre injeções sequenciais, a velocidade é a velocidade da pipeta em μm/s.
9. Clique no botão Desenhar borda e arraste o cursor ao longo da trajetória desejada na janela pop-up para definir a trajetória da injeção. Para células-tronco progenitoras microinjetoras, o lado ventral da superfície do telencephalon é alvo, conforme mostrado na Figura 2A. Leve a pipeta para o início da linha e clique na ponta da pipeta. Clique na trajetória de Executar para iniciar a microinjeção. Repita este passo para cada plano de injeção direcionado (geralmente feito para 3 – 4 aviões com 40 – 75 injeções por avião).

5. Cultura tecidual e processamento de fatias de tecido para imunofluorescência

1. Prepare a mistura de colágeno (1,5 mg/mL): Para um tubo adicionar 1,25 mL da solução matricial, 0,5 mL de água destilada, 0,5 mL de solução 5x DMEM-F12 e 0,25 mL de tampão de reconstituição. Mantenha-o no gelo até usar.
2. Obtenha a placa de Petri contendo as fatias microinjetadas da câmara de incubação da cultura da fatia e mergulhe as fatias na mistura de colágeno.
3. Transfira as fatias com 200 – 300 μL de mistura de colágeno em um poço de 14 mm de um prato de fundo de vidro de 35 mm. Certifique-se de que as fatias estão cobertas de muito menos colágeno. Esta configuração permite as condições ideais para nutrientes e absorção de oxigênio.
4. Oriente as fatias, garantindo que haja espaço suficiente entre as fatias usando dois pares de fórceps. Incubar a placa de Petri por 5 min a 37 °C usando um bloco de aquecimento para permitir que o colágeno se solidifique. Considere este tempo como t = 0 de cultura de fatia.
5. Mova a placa de Petri de volta para a incubadora de cultura de fatias por mais 40 minutos. Em seguida, adicione 2 mL do SCM pré-armado. As fatias são mantidas na cultura até o ponto de tempo desejado.
6. Tire as fatias da incubadora de cultura de fatias e aspire o SCM. Lave as fatias embutidas de colágeno com 1x PBS. Adicione 4% (wt/vol) paraformaldeído (em tampão fosfato de 120 mM, pH 7.4) e deixe o tecido em RT por 30 minutos. Em seguida, mova-o para 4 °C para permitir a fixação durante a noite.
7. Aspire a solução de paraformaldeído no dia seguinte e realize 1x lavagens PBS. Para remover as fatias do colágeno, use dois pares de fórceps para extrair suavemente as fatias sob um estereótipo.
8. Use um micro-ondas para derreter o ponto de fusão baixo de 3% (wt/vol) para processar as fatias microinjetadas. Despeje a agarose derretida em um molde descartável de incorporação e deixe esfriar para cerca de 38 – 39 °C.
9. Transfira as fatias de tecido da etapa 5.7 para este molde contendo baixa ágarose de fusão usando uma pipeta pasteur de plástico. Certifique-se de que o lado pial da fatia está para cima e a superfície ventricular fica de frente para baixo. Se necessário oriente em conformidade. Deixe a agarose esfriar até RT para solidificar.
10. Corte a agarose extra em torno das fatias. Oriente o bloco de agarose para garantir que a superfície de corte seja paralela à lâmina de corte do vibratome. Usando vibratome, corte seções de 50 μm de espessura.
11. Encha um prato de 24 poços com 1x PBS. Transfira as seções para este prato usando um pincel de ponta fina. Realizar a imunofluorescência conforme os protocolos padrão.

Resultados

A microinjeção serve ao propósito de rastrear e manipular células-tronco neurais únicas e sua descendência em tecido vivo e seguir sua progressão de linhagem em um ambiente fisiológico. Neste artigo, demonstramos o uso do robô de microinjeção para segmentar e microinjetar automaticamente fatias organotípicas do telecefalão do rato. A Figura 2 ilustra imagens representativas de células progenitoras injetadas com sucesso e a Figura 3 ilustra neurônios recém-nascidos injetados. Quando injetadas com corante Dextran Alexa-488 (ou Alexa-A555), as células aparecem totalmente preenchidas com o corante. Quanto aos progenitores apical(Figura 2) a imagem confocal permite reconstruir com alta resolução espacial a morfologia celular, a presença - ou ausência - do apego apical e basal, e combinar a indagação morfológica com expressão de marcador. Combinando esses critérios, o usuário pode atribuir um destino celular específico às células microinjetadas e à sua descendência. Quanto à injeção de neurônio, o usuário pode reconstruir a morfologia neuronal, incluindo a estrutura e características de dendrite apical e axônio. A microinjeção automatizada pode fornecer rendimento significativamente maior em comparação com a microinjeção manual(Figura 2B). Além disso, a rotulagem edu confirma que a viabilidade celular não é afetada pela automação (Figura 2C). Manter a fatia organotipípica na cultura permite acompanhar a progressão da linhagem das células microinjetadas (mostramos 4 - 24h na Figura 2D). Se a solução de microinjeção contém material genético (DNA, mRNA, guias CRISPR-Cas9) ou proteínas recombinantes, então isso permite estudar se e como a progressão da linhagem é afetada pela manipulação.

A microinjeção em células-tronco neurais únicas no tecido fornece excelente resolução celular única e, por essa razão, tem sido usada para dissecar a biologia celular da progressão de células-tronco neurais e a transição do destino(Figura 3A). A microinjeção permite a entrega de mistura complexa de produtos químicos. Anteriormente, fizemos uso deste recurso para estudar o acoplamento juncional em células progenitoras neurais, misturando espaço-juncional permeável com corantes fluorescentes impermeáveis de junção^{gap 12}. Estendemos o trabalho anterior estudando o acoplamento juncional em neurônios recém-nascidos, injetando Amarelo Lúcifer junto com o Dextran-A555 (Figura 3B). Como mostrado na Figura 3B,uma proporção de neurônios piramilhos recém-nascidos são acoplado através de junções de lacunas aos neurônios vizinhos. Esta observação é consistente com a ideia de que neurônios imaturos se comunicam através da junção^{de lacunas 13,14}. Além disso, os neurônios alvo mostram que o uso do robô de microinjeção pode ser generalizado para vários tipos de células no cérebro mamífero em desenvolvimento. Esta configuração experimental será útil para dissecar a biologia celular dos neurônios no tecido, por exemplo, fornecendo oligopeptídeos específicos para interferir nas interações proteína-proteína.

Figura 1: Configuração e protocolo automatizado de microinjeção. (A) Protocolo geral para preparação de tecidos e microinjeções automatizadas usando o robô de microinjeção. Inset certo: Esquema de desenho animado do mouse Telencephalon direcionado para microinjeção neste protocolo. (B) Fluxograma das etapas de microinjeção automatizada. (C) Esquema do hardware do robô de microinjeção. (D) Interface gráfica do usuário (GUI) do software usado para controlar e operar o robô de microinjeção. Este valor é adaptado do árbitro¹². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Microinjeção robótica em progenitores apical. Resultados esquemáticos e esperados ao usar o robô de microinjeção para atingir progenitores a apical (APs) através da superfície apical (injeção apical). (A)Primeira fila. À esquerda: esquema do processo. À direita: GUI com parâmetros relevantes para injeção apical. Linha de fundo. À esquerda: imagem de contraste de fase tirada durante o procedimento de injeção (V: ventrículo; BL: lamina basal). À direita: resultados representativos mostrando APs microinjetados. A linha tracejada representa o ventrículo (V). Barra de escala: 10 μm. (B) Injeções bem sucedidas por minuto para um usuário iniciante no sistema de microinjeção manual, um usuário experiente no sistema de microinjeção manual e o robô de microinjeção. (C) Incorporação da EdU em células microinjetadas e em células não injetadas na área injetada. As fatias organotípicas do mouse E14.5 telencephalon dorsal foram (i) não injetadas ou (ii) submetidas a microinjeção manual ou automatizada (fatia injetada) utilizando Dextran-A488 (para manual e autoinjetor). As fatias foram mantidas na cultura na presença de EdU por 24 h, depois foram fixadas e manchadas para DAPI e EdU. Células injetadas e não injetadas na área injetada foram pontuadas para positividade edu. (D) Utilização do robô de microinjeção Rastreamento de linhagem. Um corante fluorescente (Dx3-A555, magenta) é injetado em célula-tronco neural única (t = 0 h). O corante fluorescente é particionado para as células filhas (d1, d2) durante a mitose. Isso permite seguir a progêneria da célula injetada (t = 4h e 24 h) e revelar a progressão da linhagem ao longo do tempo. Para t = 24 h, mostramos vários exemplos da prole que se espera encontrar. Barras de escala: 10 μm. Gráficos em B e C são retirados do ref.¹²Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Microinjeção robótica em neurônios. Resultados esquemáticos e esperados ao usar o robô de microinjeção para atingir neurônios pirambulais (N) através da superfície basal (injeção basal). (A)Primeira fila. À esquerda: esquema do processo. À direita: GUI com parâmetros relevantes para injeção basal. Linha de fundo. À esquerda: imagem de contraste de fase tirada durante o procedimento de injeção (V: ventrículo; BL: lamina basal). À direita: resultados representativos mostrando uma linha N. Dashed microinjetada representa a lamina basal (BL). Barra de escala: 10 μm. (B) Uso do autoinjetor para estudar a comunicação juncional gap no tecido. Os neurônios piramidais foram injetados com uma solução contendo dois corantes: o gap juncional-impermeável Dx-A555 (não mostrado) e o permeável permeável lucifer amarelo (verde). O Dx-A555 está confinado à célula alvo (asteriscos), enquanto o LY se difunde às células que são conectadas através da junção de lacunas à célula alvo (linhas tracejadas). Painel esquerdo: Baixa exposição, apenas as células microinjetadas são visíveis. Painel direito: A alta exposição permite a visualização das células injetadas, bem como das células acopladas (linhas tracejadas). Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar: Solução de problemas de vários erros comuns que surgem durante a microinjeção. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A microinjeção em células-tronco neurais únicas no tecido proporciona excelente resolução celular única e, por essa razão, tem sido usada para dissecar a biologia celular da progressão de células-tronco neurais e transição do destino(Figura 2; ver também^10,11,12). O procedimento automatizado de microinjeção pode ser realizado em outros tipos de células em camundongos embrionários e tecido cerebral humano. Resultados representativos da microinjeção de neurônios recém-nascidos mirando a superfície basal do telencephalon são mostrados na Figura 3.

O princípio aqui estabelecido pode ser aplicado para atingir vários tipos de células diferentes em cérebros de camundongos embrionários e cérebros humanos. Já mostramos anteriormente que o robô de microinjeção também pode ser usado para atingir células progenitoras únicas no cérebro traseiro do rato e telencephalon e neurônios recém-nascidos no camundongo e no desenvolvimento humano do neocórtex¹². Para obter os melhores resultados do procedimento de injeção, deve-se otimizar todas as etapas antes de iniciar a injeção. É importante considerar e otimizar cuidadosamente a preparação de fatias de tecido organotípica viável e bem preservada do tecido cerebral(Figura 1). É crucial ser rápido no procedimento de dissecção e corte ilustrado na Figura 1. Para a injeção apical direcionada aos APs, deve-se escolher as fatias mostrando a orientação ideal da superfície apical. Para a injeção de APs, a orientação ideal é a superfície apical perpendicular ao fundo da placa de Petri. Qualquer outra orientação também será permissiva, no entanto, a superfície apical perpendicular à placa de Petri fornece uma área de superfície mais ampla para injeção, aumentando assim o sucesso da injeção. Para injeção em neurônios, a orientação da fatia joga pouco ou nenhum efeito.

Uma vez selecionadas as fatias a serem injetas, o procedimento de injeção por fatia leva aproximadamente 5 minutos. Considerando que se trabalha com tecido vivo, é altamente recomendável acelerar o procedimento de injeção. Para isso, recomendamos definir todos os parâmetros para injeção através da GUI (Figura 1D) antes que o tecido esteja pronto, para reduzir qualquer tempo de espera desnecessário. Para solucionar problemas, consulte o arquivo Suplementar.

No caso da cultura de fatias de longo prazo, passos após o procedimento automatizado de microinjeção podem afetar a saúde das células e, assim, o experimento. Por isso, é altamente recomendável executar um teste de controle de qualidade e otimizar as condições de cultura de fatias. Para avaliar a viabilidade celular após o procedimento de corte e injeção, realizamos a rotulagem edu durante a cultura e quantificamos o número de núcleos pitnóticos (um proxy para células apoptóticas) nas culturas e tecido injetado¹². Essas quantificações não revelaram nenhum impacto significativo da microinjeção na viabilidade tecidual(Figura 2C). Recomendamos executar controles de qualidade semelhantes ao estabelecer o corte de tecido organotipado e o oleoduto de microinjeção no laboratório.

Comparado com a microinjeção manual, o robô de microinjeção oferece várias vantagens. Primeiro, a curva de aprendizado para o usuário é menos íngreme em comparação com a injeção manual: um novo usuário atingirá uma alta proficiência após um número limitado de sessões, tipicamente 1 ou 2. Em segundo lugar, no caso da microinjeção manual, uma proficiência comparável requer meses de treinamento. O procedimento de injeção é mais rápido e eficiente(Figura 2B). Quantificamos esses parâmetros e descobrimos que o robô de microinjeção superou um usuário manual qualificado em relação ao sucesso da injeção (% de injeção bem sucedida/número total de injeções) e no número total de injeções por unidade de tempo¹². Isso resulta em um aumento global de 300% da eficiência da injeção (% de injeção/min bem sucedida) para o robô de microinjeção em comparação com um usuário qualificado. O aumento da eficiência foi ainda mais acentuado quando se comparava ao robô de microinjeção com um usuário iniciante e chegou a 700%. Por último, mas não menos importante, o robô de microinjeção pode ser facilmente programado para explorar sistematicamente todos os parâmetros espaciais. Isso é particularmente vantajoso ao adaptar o robô de microinjeção para atingir novas células ou tecidos, ou ao usar o robô de microinjeção para fins que requerem resolução espacial diferente.

A construção do robô de microinjeção requer alterações mínimas em um microscópio de epi-fluorescência existente¹². Já fornecemos instruções para esta adaptação em https://github.com/bsbrl/Autoinjector. Uma vez que o hardware é configurado, este protocolo fornece detalhes metodológicos importantes para realizar com sucesso microinjeções automatizadas. No geral, o robô de microinjeção tem uma taxa de injeção bem sucedida de 15,52 + 2,48 injeções/min, o que é 15x maior que um usuário inexperiente (1,09 ± 0,67 injeções/min), e 3x maior que um usuário especialista (4,95 ± 1,05 injeções/min)¹². Essa melhoria na taxa de injeção bem-sucedida capacita tanto os usuários iniciantes quanto os especialistas a injetar mais células em um período menor de tempo, o que é essencial para preservar a viabilidade do tecido. Além disso, o robô de microinjeção é personalizável e a trajetória, profundidade da injeção, número de injeções, espaçamento entre injeções podem ser todos sintonizados usando a GUI. Esses recursos permitem que o robô de microinjeção seja usado como uma ferramenta para otimizar experimentos anteriormente trabalhosos, e para explorar fundamentalmente novos experimentos que requerem maior rendimento do que o possível anteriormente.

As principais limitações do procedimento de microinjeção que descrevemos aqui estão relacionadas à preparação de fatias teciduais, um passo crucial que precisa de ampla otimização. Além disso, a microinjeção conta com a presença de uma superfície que pode ser abordada pela pipeta de vidro. Esse recurso limita o tipo de tecidos e locais de tecido que podem ser direcionados através de microinjeção usando a configuração atual.

O robô de microinjeção atualmente usa imagens de campo brilhante e tem sido usado em preparações in vitro de fatias cerebrais. No futuro, o robô de microinjeção poderia ser combinado com imagens de 2 fótons para aumentar a especificidade do alvo de célula única in vivo para marcação molecular ou de corante. Tais esforços já foram feitos para a eletrofisiologia celular única^15,16. O dispositivo atual requer observação manual do procedimento de microinjeção. As versões futuras podem incluir estratégias para limpar pipetas de microinjeção entupidas¹⁷ ou integração de robôs de manuseio de fluidos¹⁸ para microinjeções multiplexadas e totalmente autônomas. Esses dispositivos poderiam aumentar a escala de microinjeção por ordens de magnitude. A adaptação de algoritmos para controle paralelo de várias pipetas de microinjeção¹⁹ poderia permitir a entrega multiplexada de dezenas de corantes e reagentes moleculares nas mesmas células dentro dos mesmos experimentos. Isso tem o potencial de abrir novos caminhos para a triagem molecular no tecido.

O robô de microinjeção poderia ser usado para marcar células identificadas funcionalmente usando códigos de barras de DNA ou RNA. Isso poderia, por sua vez, ser combinado com outras técnicas de análise de células únicas, como sequenciamento de RNA de células únicas (scRNAseq) e microscopia eletrônica. Nossos resultados preliminares mostram que as células microinjetadas e sua prole podem ser recuperadas e isoladas usando dissociação tecidual seguida de classificação FACS (Taverna, resultados inéditos). As células classificadas FACS podem então ser usadas para scRNAseq. Além disso, resultados preliminares mostram que as capacidades de resolução celular única do robô de microinjeção podem ser usadas em combinação com análise microscópica eletrônica para explorar a biologia celular em células-tronco neurais em tecido em alta resolução espacial (Taverna e Wilsch-Bräuninger, resultados inéditos). Esses dados sugerem que o robô de microinjeção pode ser usado como uma ferramenta para microscopia de luz correlativa e elétrons no tecido e em sentido mais amplo, para a análise multimodal da identidade celular e comportamento no tecido.

A microinjeção depende do uso da pressão e pode-se permitir soluções de injeção com alta complexidade molecular (por exemplo, um transcriptome inteiro). Essa característica da microinjeção foi explorada no passado para isolar e clonar receptores com ligantes²⁰. Ao longo desta linha, o robô de microinjeção pode ser usado para modelar e estudar traços multigênicos no nível celular. Combinado com uma estratégia de subcoamento, o robô de microinjeção também pode ser usado como uma plataforma para identificar o conjunto mínimo de genes que conduzem um certo traço/comportamento celular. Até agora, o robô de microinjeção tem sido usado para manipular a bioquímica da célula através da entrega de proteínas mRNA, DNA ou recombinante^10,21,22. Prevemos uma aplicação do robô de microinjeção na sondagem da biofísica do espaço intracelular, por exemplo, fornecendo nanomateriais ou nanomáquinas que permitem a detecção e/ou manipulação das propriedades biofísicas do espaço intracelular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Chemicals
Agarose, Low Melt	Carl Roth	Cat# 6351.2
Agarose, Wild Range	Sigma-Aldrich	Cat# A2790
Best-CA 221 Cola	Best Klebstoffe GmbH & Co.KG	Cat# CA221-10ml
B-27 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17504044
Cellmatrix Type-IA (Colágeno, Tipo!)	FUJIFILM Wako Chemicals	Cat# 637-00653
Água
DMEM-F12, independente de CO2 (sem vermelho de fenol)	Sigma-Aldrich	Cat# D2906
DMEM-F12, independente de CO2 (com vermelho de fenol)	Sigma-Aldrich	Cat# D8900
HEPES-NAOH, pH 7,2, 1M (tampão HEPES)	Carl Roth	Cat# 9105.3
L-Glutamina, 200 mM	Thermo Fisher Sientific	Cat# 25030024
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	Cat# 81381
N-2 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17502048
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	Cat# 21103049
Água livre de nuclease	Thermo Fisher Scientific	Cat# AM9937
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 litros
Paraformaldeído	Merck	Cat# 818715
PBS
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15140122
Soro de rato	Charles River Laboratories
	Japan
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Merck	Cat# 106323
Hidróxido de sódio (NaOH)	Merck	Cat# 106482
Tyrode» s sal	Sigma	Cat# T2145-10x1L)
Equipment
Capilares de vidro borossilicato, 1,2 mm de diâmetro externo x 0,94 mm de diâmetro interno	Sutter Instruments	Cat# BF-120-94-10
Sistema de filtro de topo de garrafa, 500 mL	Corning	Cat# 430769
Computer PC
Equipamento			pressão personalizado
Regulador de pressão eletrônico	Parker Hannifin	Cat# 990-005101-002
Tubos Falcon, 15 mL	Corning	Cat# 430791
Tubos Falcon, 50 mL	Corning	Cat# 430829
Pincel
Extrator de micropipeta flamejante/ marrom	Sutter Instruments	Cat# P-97
Fórceps, Dumont nº 3	Ferramentas de Belas Ciências	Cat# 11231-30
Fórceps, Dumont nº 5	Ferramentas de Belas Ciências	Cat# 11255-20
Fórceps, Dumont nº 55	Ferramentas de Ciências Finas	Cat# 11252-20
Bloco de aquecimento	Labtech International	Cat # Dri block Digi2
Microscópio de fluorescência invertida	Zeiss	Cat# Axiovert 200
Fonte de luz	Olympus	Cat# Highlight 3100
Regulador de pressão manual	McMaster Carr	Cat# 0-60 PSI 41795K3
Pontas de microcarregador	Eppendorf	Cat# 5242956.003
Microcontrolador	Arduino	Cat# Arduino Due
Microscópio câmera Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3
Platina motorizada XY para microscópio
Placa multipoços, 24 poços	Nunc	Cat# 142475
Pipetas Pasteur, placa de Petri de plástico
, 60 x 15 mm	Greiner	Cat# 628102
Placa de Petri, 35 x 10 mm	Nunc	Cat# 153066
Placa de Petri, 34 x 14 mm, incluindo vidro de cobertura Microwell no. 1.5	MatTek	Cat# P35G-1.5-14-C
Suporte de pipeta	Warner Instruments	Cat# 64-2354 MP-s12u
Pipeta e pontas
Filamento extrator, filamento de caixa quadrada de 3,0 mm	Sutter Instrument	Cat# FB330B
Caixa de incubação de cultura de fatia	MPI-CBG	Cat # válvula solenóide personalizada
	Cat # LHDA053321H-A
Estereomicroscópio	Olympus	Cat # SZX12
Centrífuga de mesa	Heraeus	Cat # 5431622
Termômetro
Manipulador de três eixos	Sensapex Inc	Cat# eixo-árvore uMP
Vibratome	Leica	Cat# VT1000s
Incubadora de sistema de cultura de embriões inteiros	Ikemoto Company Cat	# RKI-10-0310
Banho-maria
Software e Algoritmos
Arduino	Arduino
Fiji	RRID: SCR_002285
Python	Python Software Foundation	Python 2.7.12
ZEN		RRID: SCR_013672