Artigo de método

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/61651

⸱

10 de setembro de 2020

 , 
1Department of Entomology, The Ohio State University, 2Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

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O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Resumo

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Os mosquitos Culex são os principais vetores de várias doenças que afetam negativamente a saúde humana e animal, incluindo o vírus do Nilo Ocidental e doenças causadas por nematoides filarial, como verme canino e elefanta. Recentemente, a edição do genoma CRISPR/Cas9 tem sido usada para induzir mutações direcionadas ao local, injetando uma proteína Cas9 que foi complexada com um guia de RNA (gRNA) em embriões recém-colocados de várias espécies de insetos, incluindo mosquitos que pertencem aos gêneros Anopheles e Aedes. Manipular e injetar mosquitos Culex é um pouco mais difícil, pois esses mosquitos colocam seus ovos em ré em jangadas em vez de individualmente como outras espécies de mosquitos. Aqui descrevemos como projetar gRNAs, complá-los com proteína Cas9, induzir mosquitos fêmeas de pipiens Culex para colocar ovos, e como preparar e injetar embriões recém-colocados para microinjeção com Cas9/gRNA. Também descrevemos como criar e testar mosquitos injetados para a mutação desejada. Os resultados representativos demonstram que essa técnica pode ser usada para induzir mutações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos Culex e, com pequenas modificações, pode ser usada para gerar mutantes nulos em outras espécies de mosquitos também.

Introdução

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Os mosquitos Culex são distribuídos pelas regiões temperadas e tropicais do mundo e transmitem vários vírus mortais, incluindo o vírus do Nilo Ocidental1, encefalite de St. Louis2, bem como nematoides filares que causam verme canino3 e elefantíase4. Membros do complexo Culex pipiens, que inclui Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus,mostram variações marcantes em muitos aspectos de sua biologia. Por exemplo, enquanto Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens molestus são incapazes de entrar em uma dormência overwintering5,6, Pipiens pipiens exibem respostas sazonais robustas e entram em diapausa em resposta a curtos dias7,8. Além disso, cx. pipiens molestus tendem a ser mais antropofílicos, enquanto Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus são mais zoofílicos6. No entanto, nos Estados Unidos e em muitos outros lugares do mundo, essas espécies se cruzaram, o que tem fortes implicações para a transmissão de doenças como híbridos do Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus são alimentadores oportunistas e vão morder aves e humanos9, servindo assim como vetores de ponte para o vírus do Nilo Ocidental. Estudar esses e outros aspectos fascinantes da biologia dos mosquitos Culex tem sido dificultado, em parte, porque os mosquitos Culex são um pouco mais difíceis de criar em laboratório do que os mosquitos Aedes, que produzem ovos quiescentes e resistentes à dessecação10 e porque ferramentas moleculares funcionais não são tão bem desenvolvidas para espécies Culex.

A edição do genoma CRISPR/Cas9 é uma tecnologia poderosa que tem sido usada para avaliar a biologia de várias espécies importantes de mosquitos11,12,13, incluindo o mosquito da casa sulista, Culex quinquefasciatus14,15,16. Esta tecnologia, desenvolvida por Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, explora uma defesa bacteriana natural contra vírus por endonucleases bacterianamente derivadas, associadas a CRISPR (proteínas Cas; ver revisão por Van der Oost et al.17). Quando injetadas em embriões animais, as proteínas Cas9 em combinação com um guia apropriado RNA podem produzir quebras duplas dentro do genoma. Isso é mais frequentemente feito usando a proteína Cas9 que é complexada com rnas guia, que direciona a atividade endonuclease para uma região específica do genoma. Depois que a proteína Cas9 criou uma ruptura de dois fios específicos do local, o maquinário celular tenta reparar a ruptura usando um dos dois mecanismos. O primeiro implica ligar as duas extremidades juntas através da junção final não homólogo (NHEJ), que é propensa a erros e muitas vezes produz inserções e exclusões fora do quadro no genoma que podem resultar em proteínas não funcionais, gerando assim uma mutação de knock-out. Alternativamente, o maquinário celular pode usar reparação direcionada à escoologia (HDR) encontrando sequências semelhantes para reparar corretamente a ruptura. A sequência semelhante pode ser fornecida pelo segundo cromossomo dentro do organismo (ver revisão18). No entanto, se a sequência reparada corresponde exatamente à sequência original, a proteína Cas9 será capaz de cortar novamente o DNA. Alternativamente, os pesquisadores também podem incluir um plasmídeo doador que contém sequências homólogos em ambos os lados do local de corte da sequência de destino com uma sequência de reparo alternativa — muitas vezes uma proteína de marcador fluorescente, versão modificada do gene original ou outra modificação — que pode ser copiada e inserida no genoma, ou "derrubada".

O tempo é crítico ao injetar embriões, e este é especialmente o caso ao usar a edição do genoma CRISPR/Cas9 para criar mutações em insetos. Isso ocorre porque a proteína Cas9 e os gRNAs têm a maior capacidade de gerar mutações somente quando o embrião está em seu estado sincicial, antes que as membranas celulares se formem e quando múltiplos núcleos estiverem acessíveis dentro do embrião. Para os mosquitos, os núcleos atingem a periferia ~2-4 horas após o oviposition, dependendo da temperatura19, e, portanto, a microinjeção bem sucedida deve ocorrer antes deste tempo. Além disso, a proteína Cas9 cortará qualquer DNA nuclear que possa acessar, de tal forma que o indivíduo resultante da injeção conterá um mosaico de células, algumas tendo a mutação desejada, e outras não. Para que essas mutações sejam herdadas com sucesso, a proteína Cas9 deve cortar o DNA que reside na linha germinal que dará origem aos futuros óvulos e espermatozoides. Para garantir que as mutações sejam geradas na linha germinal é melhor injetar todos os materiais próximos à localização das células do polo dentro do embrião, que são os progenitores da germinação de insetos. As células do polo estão localizadas perto da extremidade posterior dos embriões Culex 20. Além de injetar embriões, é imprescindível desenvolver um plano cuidadoso de travessia e triagem de descendentes, a fim de detectar a mutação desejada.

Este protocolo descreve como gerar gRNAs e complexá-los com proteína Cas9 para preparar misturas de injeção, bem como como induzir mosquitos fêmeas de pipiens Culex a colocar ovos e como preparar e injetar esses ovos para edição de genoma mediado por CRISPR/Cas9. Além disso, descrevemos como trás, cruz e tela injetados embriões e sua descendência para confirmar que a mutação desejada foi obtida. Usando este protocolo, geramos mutações nulas para um gene de interesse, ciclo, na cepa Buckeye de Culex pipiens. Esta cepa foi originalmente estabelecida em 2013 a partir de mosquitos coletados em campo em Columbus, Ohio e é mantida pelo laboratório Meuti. Este protocolo pode ser usado para estudos adicionais que requerem edição de genomas CRISPR/Cas9 em mosquitos Culex, bem como outras espécies de mosquitos, e, mais geralmente, é relevante para o uso da edição do genoma CRISPR/Cas9 para qualquer espécie de inseto.

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Protocolo

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Na maioria das instituições de pesquisa, um Protocolo de Biossegurança aprovado deve estar em vigor antes que insetos transgênicos sejam gerados ou mantidos para garantir que organismos geneticamente modificados não escapem ou sejam removidos das instalações de laboratório. Regulamentos adicionais do governo também podem ser aplicados. Antes de iniciar um projeto dessa natureza, verifique todas as políticas e procedimentos institucionais para determinar quais documentos e aprovações são necessários.

1. Projetar gRNAs e preparar misturas de injeção

  1. Projete 2-5 gRNAs para cada gene alvo, pois alguns gRNAs funcionam melhor que outros. gRNAs que visam um gene de interesse podem ser projetadas manualmente ou programas gratuitos, como Chop-Chop, podem ser usados.
  2. Primers de design e ordem que amplificarão fragmentos de 100-200 bp em torno de cada gRNA. Idealmente, o local do corte deve estar localizado aproximadamente no terço médio para metade do produto PCR. Observe quantas bps em cada local do corte serão produzidas.
  3. Obter gRNAs.
    1. Comprar gRNAs de empresas comerciais como Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript e outras. Esta é a opção mais fácil.
    2. Alternativamente, crie gRNAs no laboratório usando amplificação PCR para gerar os modelos para síntese istérmica subsequente. Veja o protocolo descrito por Port et al.21 e Kistler et al.22.
    3. Forneça gRNAs via plasmídeos que são injetados em embriões. Neste caso, o gRNA deve ser conduzido pelo promotor U6 (ver 23,24 para mais detalhes).
  4. Obtenha a proteína Cas9.
    1. Encomendar Cas9 comercialmente de várias empresas, incluindo a Fisher Scientific. Esta é a opção mais fácil.
    2. Faça a proteína Cas9 e purfique em laboratório de acordo com Basu et al.25 e Kistler et al.22.
    3. Injete Cas9 mRNA em embriões, onde mais tarde será traduzido em proteína Cas9 ativa. Cas9 mRNA pode ser sintetizado no laboratório usando transcrição in vitro22 ou comprado de fornecedores como sigma.
      NOTA: A proteína Cas9 traduzida deve conter um sinal de localização nuclear (NLS) no c-terminus, e, portanto, o NLS também deve estar presente no mRNA Cas9 injetado.
    4. Expresse proteína Cas9 in vivo através da expressão à base de plasmídeos. Neste caso, é melhor ter a expressão de Cas9 no plasmídeo conduzido por um promotor embrionário que tem sido bem caracterizado nas espécies-alvo.
      NOTA: Até o momento, os promotores embrionários não foram bem caracterizados em mosquitos Culex e, portanto, recomenda-se injetar proteína purificada ou Cas9 mRNA.
  5. Complexo os gRNAs com a proteína Cas9, adaptado de Kistler et al.22.
    1. Se injetar proteína Cas9 com o gRNA junto (recomendado), certifique-se de que as concentrações finais da proteína Cas9 é de 300 ng/μL e a concentração final de um único gRNA é de 80 μg/μL. Misture a proteína e um gRNA individual em um tubo PCR de 0,2 mL.
    2. Incubar por 20 minutos no gelo.
  6. Testando gRNAs com um ensaio in vitro (por exemplo, Kit de Triagem de Guia sgRNA).
    1. Amplie os fragmentos ao redor do local de corte para cada gRNA usando PCR.
    2. Execute os produtos PCR em um gel para garantir que eles tenham o tamanho correto. Em seguida, purifique os produtos PCR e sequenciá-los para garantir que eles tenham como alvo a região genética correta.
    3. Misture 200 ng do produto PCR purificado restante com 1 μL de tampão de reação Cas9, 1 μL de BSA, 1,5 μL de Cas9:gRNA complexado e leve o volume total de reação a 15 μL. Incubar por 5 min a 37°C.
    4. Execute o produto em um gel novamente. Se a proteína Cas9 cortar com sucesso o produto PCR, a banda primária deve parecer mais fraca e bandas menores adicionais devem estar presentes. Observe a redução do tamanho do produto PCR original e, se desejar, calcule a redução na intensidade da banda para aproximar a eficiência de corte.
  7. Preparando a mistura final de injeção
    1. Para cada gRNA que cortou com sucesso seu produto PCR direcionado, misture volumes de cada Cas9 e gRNA em um tubo de 0,5 mL de forma que o volume final permaneça 300 ng/μL de proteína Cas9 e 80 ng/μL de cada gRNA.
    2. Armazene os Cas9 e gRNAs complexos a -80 °C até que sejam necessários para injeção.

2. Puxando e beveling agulhas

NOTA: Injeções bem sucedidas e sobrevivência de embriões requer agulhas afiadas(Figura 1).

  1. Use borossilicato de diâmetro externo de 1 mm ou microcapillaries de vidro de quartzo. Silicone os microcapilários em um capô de fumaça química antes de ser puxado.
    1. Resumindo, coloque 3 mL de Sigmacote em um copo de vidro e o vácuo desenhe em um segundo béquer contendo os microcapillarias de vidro por pelo menos 4h, permitindo que a solução de silício vaporize e se instale em todas as superfícies dos microcapillaries.
    2. Depois, lentamente permita que a câmara de vácuo se equalize à pressão ambiente, abrindo gradualmente a válvula de parapeto e permitindo que o ar retorne para a câmara. As agulhas estão prontas para serem puxadas.
    3. Leia sempre o manual de instruções dos puxadores de agulha antes de usar.
      NOTA: As instruções abaixo detalham como usar um P-2000 Laser Needle Puller para puxar agulhas de vidro. É importante notar que todos os puxadores de agulhas mesmo da mesma marca não estão calibrados para puxar exatamente a mesma agulha em diferentes unidades. A chave para obter boas agulhas é começar em um determinado conjunto de parâmetros e, em seguida, puxar agulhas usando parâmetros que estão acima e abaixo desses valores. Teste as agulhas em cada um desses parâmetros avaliando o quão bem a agulha perfura embriões e quão bem a mistura de injeção flui da agulha. Refine os parâmetros até que uma agulha seja obtida que seja fácil de abrir ou chanfrada, que perfura embriões suavemente e que fornece mistura de injeção facilmente.
  2. Puxando agulhas usando o puxador de agulha laser P-2000
    1. Ligue o puxador de agulha laser e deixe o laser aquecer por 15 minutos antes do primeiro puxão.
    2. Programe a máquina para o tipo de tubo microcapilar de vidro (Lembre-se que qualquer parâmetro de puxador de agulhas é um ponto de partida, uma vez que os puxadores de agulha não são calibrados para produzir a mesma agulha em todos os puxadores):
      Quartzo: Calor = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
    3. Depois de programar o puxador de agulha, carregue uma microcapilaria e fixe-a no lugar, tomando o cuidado de tocar apenas a extremidade do tubo microcapilar e não a área que será aquecida pelo laser.
    4. Depois de fixar o microcapilário, coloque o polegar e o dedo indicador nas barras dos dedos e, em seguida, solte as barras de puxar pressionando a mola libera uma de cada vez.
    5. Aperte o polegar e o dedo indicador para puxar as barras completamente juntas.
    6. Posicione o outro lado do tubo microcapilar em seu grampo de tal forma que uma pequena porção do tubo se estenda de ambos os lados. Aperte os grampos certificando-se de que ambos os grampos estão apertados e que segurem firmemente as "barras de puxar" no lugar.
    7. Feche a mortalha protetora no puxador.
    8. Pressione o botão Puxar e o laser começará a aquecer o vidro, indicado pela luz vermelha "laser on" localizada sob a mortalha. A tração é completada quando as barras de puxar são completamente separadas, acompanhadas de um baque metálico.
    9. Certifique-se de que a luz "laser acesa" não esteja iluminada antes de levantar a mortalha.
    10. Segure a pequena extremidade do tubo microcapilar que se estende além do grampo com o polegar e o indicador e solte o grampo. Em seguida, levante o tubo microcapilar do grampo.
    11. Use fórceps para colocar cuidadosamente o tubo microcapilário em uma placa de Petri quadrada forrada com fita dupla face. Certifique-se de que ao colocar a agulha na caixa de retenção que a parte de trás da agulha toque primeiro e a agulha é suavemente abaixada no lugar para que a ponta afiada não seja danificada.
  3. Puxando agulhas usando um PC-10/PC-100 puxador de agulha
    1. Configure o puxador PC-10 usando 4 pesos e defina a temperatura para 50,4 °C para uma tração de uma etapa.
    2. Coloque um microcapilário de vidro borossilicador no grampo superior. Em seguida, levante o grampo inferior ponderado na posição e aperte a porção inferior do microcapilário, certificando-se de que o capilar está em posição de puxar duas boas agulhas. Este é um ciclo de tração bastante longo, mas produz boas agulhas para chanfrar.
  4. Agulhas de chanfração.
    NOTA: Este método de chanfrado molhado dá feedback em tempo real sobre o tamanho relativo de abertura da agulha.
    1. Monte a placa abrasiva e o anel de retenção do beveler agulha. Certifique-se de que o lado cinza da placa abrasiva esteja orientado para cima entre o anel de retenção superior e inferior. Aperte os parafusos no anel de retenção, alternando do parafuso ao parafuso para garantir que cada parafuso seja apertado uniformemente. A placa abrasiva e os anéis de retenção serão referidos como o conjunto de moagem.
    2. Coloque 13 gotas (~ 520 μL) de óleo de pedestal sobre a superfície plana óptica e, em seguida, coloque o conjunto de moagem em cima da placa. Coloque o conjunto sob um microscópio dissecando e, em seguida, ligue o beveler. Um pouco mais de óleo comparado com a recomendação de Sutter é usado, pois isso mantém a placa abrasiva girando por um período mais longo quando usada em conjunto com este método de chanfração molhada.
    3. Adicione 1% de solução Photo-Flo à superfície de moagem e mova o pavio para a posição para que ele esteja imerso na solução Photo-Flo.
    4. Ligue o ar na fonte principal. Em seguida, coloque uma agulha de borossilicato puxada no suporte e aperte o anel de retenção. Ligue o ar no regulador e aumente até que a pressão chegue a 26 PSI.
    5. Observando de lado, abaixe a agulha usando o botão de ajuste grosseiro até que quase toque a superfície líquida Photo-Flo.
    6. Ajuste o microscópio para localizar a agulha no campo de visão. Comece com a menor ampliação e aumente a ampliação. Ajuste cuidadosamente a posição da agulha usando o botão de ajuste grosseiro até que ele apenas toque a superfície do líquido Photo-Flo.
    7. Usando o botão de ajuste grosseiro e continuando a olhar sob o microscópio, baixe a agulha até que ela esteja perto da superfície abrasiva, mas não a toque.
    8. Usando o botão de ajuste fino, abaixe cuidadosamente e lentamente a agulha, prestando muita atenção à agulha e à sombra que deixa na superfície abrasiva do beveler. Quando a agulha e sua sombra parecerem que estão prestes a tocar a superfície abrasiva, continuem a baixar a agulha ainda mais lentamente e cuidadosamente.
    9. Alternar entre deixar a agulha "bisbisar" abaixando-a sobre a superfície abrasiva e, em seguida, elevando-a. Antes de levantar a agulha, observe rapidamente a configuração no micrômetro no botão de ajuste fino para que a agulha possa ser abaixada para a mesma posição ou, se necessário, para uma posição ligeiramente mais baixa. Lembre-se de manter a agulha abaixo da camada líquida Photo-Flo. Uma vez levantada a agulha acima da superfície abrasiva, pare rapidamente e reinicie a rotação do beveler para verificar se há bolhas. Se a agulha foi adequadamente chanfrada, as bolhas de ar devem fluir para fora da agulha e para o Photo-Flo. Se a placa não for parada, as bolhas provavelmente não se tornarão visíveis até que a abertura da agulha seja muito grande.
    10. Se não aparecerem bolhas quando a agulha for levantada acima da superfície abrasiva e o beveler parar, repita o procedimento de chanfração, baixando a agulha para uma posição ligeiramente mais baixa no micrômetro localizado no botão de ajuste fino, levantando a agulha, parando a placa de beveler e verificando se há bolhas de ar. Repita até que um pequeno, mas constante fluxo de bolhas apareça.
    11. Uma vez que as bolhas de ar estejam presentes, verifique o tamanho relativo da abertura parando a placa abrasiva e baixando a pressão do ar, observando o PSI em que a formação de bolhas pára, pois esta é uma indicação relativa do tamanho da abertura das agulhas chanfradas. Quanto menor a pressão em que o ar pára de escapar da ponta da agulha, maior a abertura da agulha. Agulhas chanfradas ao ponto em que bolhas param de escapar da agulha em 18-20 PSI indica que a agulha tem uma abertura relativamente pequena e deve causar danos mínimos a um embrião quando usado para microinjeções.
    12. Depois de verificar a abertura da agulha, aumente a pressão de ar para 26 PSI para evitar que o líquido entre na agulha. Em seguida, levante a agulha para cima e para fora da camada Photo-Flo usando o botão de ajuste grosseiro. É importante notar que enquanto o ar estiver fluindo para fora da agulha, o Foto-Flo não entra na agulha e, portanto, o interior da agulha está protegido contra contaminação.
    13. Uma vez que a agulha esteja fora do Photo-Flo, desligue o ar e remova a agulha do suporte da agulha.
    14. Usando fórceps, coloque a agulha recém-chanfrada em uma placa de Petri que tem fita dupla lateral ou argila modeladora para mantê-la no lugar. Repita o processo até que 10-20 agulhas chanfradas tenham sido produzidas.

3. Alimentando a geração parental de mosquitos

  1. Larvas traseiras de mosquitos Cx. pipiens em condições inequívocas de longo dia (>13 h de luz/dia) a 25-27 °C para garantir que os mosquitos não entrem em sua dormência ou diapausa overwintering.
  2. Sete a dez dias após o pico de emergência adulta, prepare o sistema de alimentação hemotek, conectando as unidades de aquecimento na fonte de alimentação. Ajuste a temperatura de cada unidade para 37 °C (temperatura interna do corpo) ou 41 °C (temperatura interna do corpo do frango) usando o parafuso de ajuste na parte superior da unidade. Certifique-se de que a temperatura correta foi atingida usando um termômetro elétrico.
  3. Prepare o reservatório de farinha de sangue para alimentação.
    1. Corte um quadrado de parafilm para cada cilindro de alimentação sanguínea, e esfregue o parafilme contra os pés descalços. Isso fornece aromas que são atraentes para os mosquitos.
    2. Estique o parafilm o mais fino possível, e enrole as bordas firmemente ao redor do reservatório de refeições. Se desejar, fixe no lugar com um anel O de borracha.
    3. Adicione aproximadamente 200 μL de solução ATP de 0,1 M a 15 mL de sangue de frango inteiro fresco ou descongelado, tratado com citrato de sódio. O ATP ajuda a estimular a alimentação sanguínea, e o citrato de sódio evita que o sangue coagula.
    4. Segure o reservatório para que o lado do parafilm esteja virado para baixo, e use cuidadosamente uma pipeta descartável para encher o reservatório. Cada reservatório contém ~3 mL de sangue. Sele as portas de enchimento com plugues plásticos.
    5. Enrosque os reservatórios de refeição nas unidades de aquecimento e coloque em cima da gaiola do mosquito de tal forma que o lado do parafilm esteja virado para baixo e os mosquitos possam se alimentar através da malha.
  4. Cubra as gaiolas com sacos de lixo pretos para simular o crepúsculo e soprar vigorosamente em cada gaiola à medida que o aumento da concentração de CO2 estimula a alimentação sanguínea.
  5. Mantenha o alimentador na gaiola por 2-8 h para maximizar a alimentação sanguínea. Verifique periodicamente e observe a proporção de fêmeas que tomaram uma refeição sanguínea (evidente por seus abdômens vermelhos e distendidos).

4. Induzir a colocação de ovos em mosquitos adultos

  1. Quatro a cinco dias após a alimentação sanguínea, prepare um tubo cônico de 50 mL para oviposição do mosquito.
    1. Crie um orifício de ~20 mm perto da parte inferior do tubo cônico.
    2. Cubra o orifício com dois quadrados (35 mm2) de borracha dentária, um com fenda horizontal e outro com fenda vertical. Use fita adesiva para anexar os quadrados da barragem dentária ao tubo cônico.
    3. Coloque um pedaço de papel filtro de 4,25 cm sobre uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm e molhe o papel filtro com 750 μL de água destilada.
    4. Inverta o tubo cônico sobre o papel do filtro e gire algumas vezes para frente e para trás para garantir que ele esteja seguro.
  2. Use um aspirador bucal para remover cuidadosamente ~10 fêmeas de Cx. pipiens de sua gaiola e transferi-las para o tubo cônico preparado.
  3. Coloque um cilindro opaco sobre o tubo cônico para fornecer escuridão aos mosquitos, pois isso estimula a colocação de ovos, e espere de 20 a 25 minutos.

5. Micro-manipulação de ovos culex recém-colocados

  1. Prepare o slide para anexar os embriões do mosquito para microinjeção.
    1. Conecte um pedaço de fita dupla face à largura de um copo de cobertura.
    2. Conecte uma fina tira de curativo médico transparente (por exemplo, Tegaderme, 2-3 mm de largura) à fita de dupla face, de tal forma que ela funcione paralelamente à extremidade curta do vidro de cobertura e seja posicionada aproximadamente 5 mm da extremidade do vidro de cobertura.
    3. Remova o excesso de fita dupla face com uma lâmina afiada e remova 2-3 mm de curativo médico e fita dupla face de cada extremidade do vidro de cobertura. Isso permite que uma camada de óleo permaneça na lâmina depois que os ovos foram montados no vidro da tampa.
    4. Usando um lápis de cera, desenhe uma forma "D" em torno da fita de dupla face e tira de curativo médico. Isso funcionará como uma barreira para segurar a água ao redor dos ovos após a injeção.
  2. Depois que o slide tiver sido preparado e 20-25 minutos se passaram, remova o tubo opaco e determine se os mosquitos colocaram ou não ovos.
    1. Se não, cubra-os por mais 5-10 minutos.
    2. Se os mosquitos tiverem colocado ovos, cuidadosamente, mas rapidamente levante o tubo cônico e cubra com uma tampa. Coloque os mosquitos em uma gaiola separada e regise o tempo em que os ovos foram coletados em uma planilha. Em seguida, adicione 50-100 μL de água DI ao papel filtro contendo as jangadas de ovos.
  3. Sob um microscópio dissecando, alinhá os ovos.
    1. Posicione um pedaço de papel filtro (retângulos de 10 mm x 30 mm cortados de papel filtro grosseiro com vazão rápida) sob um vidro de cobertura de 24 mm x 40 mm, de forma que o vidro de cobertura cubra 50-60% do lado esquerdo do papel filtro.
    2. Molhe o papel filtro com 50 μL de água DI. A água se espalhará lentamente sob o vidro da tampa, criando um reservatório para manter o papel filtro e os ovos molhados durante a micromanipulação. Um menisco se formará entre o vidro de cobertura e o papel filtro quando a quantidade correta de água for aplicada.
    3. Separe os ovos de suas jangadas de ovos usando uma escova de tinta fina, e posicione para que a extremidade estreita e posterior do embrião esteja tocando o vidro de cobertura (esquerda) e a extremidade anterior mais larga é para a direita.
    4. Alinhe os ovos por 20 minutos, observando cuidadosamente a mudança de sua cor de um branco leitoso para um cinza muito claro. Inspecione rotineiramente o filme de água sob o vidro da tampa para garantir que haja uma quantidade adequada de água. Se os ovos parecerem estar secando, adicione uma pequena quantidade de água DI (20-30 μL) ao papel filtro.
    5. Depois de 20 min, descarte todos os ovos restantes.
  4. Transfira os ovos para o slide de microinjeção.
    1. Use um pequeno pedaço (10 mm x 30 mm) de papel filtro grosseiro para retirar a água do lado do papel filtro saturado e remova o papel filtro de pavio com fórceps. Repita 2-3 vezes para garantir que o papel filtro com os ovos esteja o mais seco possível.
    2. Coloque um retângulo fresco e seco de papel filtro e segure-o no lugar com um par de fórceps. Retire cuidadosamente o vidro da tampa para a esquerda, longe dos ovos alinhados.
    3. Seque o excesso de água no palco sem perturbar o pequeno papel filtro que contém os ovos alinhados. Continue a secar o papel filtro molhado com os ovos várias vezes, pressionando os pequenos retângulos de papel filtro com polegares e/ou fórceps, para garantir que os ovos estejam o mais secos possível antes de transferi-los para o slide de injeção.
    4. Usando fórceps, remova o papel recuando da tira de curativo médico do slide de montagem.
    5. Segure o slide de montagem com um polegar e um dedo médio e o curativo médico exposto voltado para baixo, e abaixe em um ângulo de 45° sobre a linha de ovos alinhados. Posicione o slide de tal forma que a extremidade anterior mais larga dos ovos (esquerda) esteja pendurada ligeiramente fora da extremidade do curativo médico, pois isso aumenta a capacidade das larvas Culex de eclodir com sucesso dos ovos montados.
    6. Pressione o dedo indicador na parte inferior do vidro da tampa, enquanto continua a segurar o vidro de cobertura entre o polegar e o dedo médio, para garantir que todos os ovos alinhados estejam firmemente ligados ao curativo médico.
    7. Inverta imediatamente o vidro de cobertura para que os ovos estejam voltados para cima, e aplique uma fina camada de óleo de óleo halocarboneto (2-3 gotas; ~20 μL) nos ovos. Isso evita que os ovos se dessecando durante a microinjeção. Remova todos os ovos que não estejam ligados ao curativo médico ou não estejam cobertos pelo óleo.
    8. Coloque a tampa de vidro com os ovos montados voltados para dentro de uma placa de Petri quadrada com um grande quadrado de papel filtro molhado para transporte para microinjeção.

6. Injetar embriões culex

  1. Enchimento das agulhas de injeção com a mistura de injeção
    1. Escolha um enchimento de agulha ou ponta de carregamento de gel que caberá facilmente na parte de trás da agulha de injeção selecionada, e terá um pouco de espaço entre a extremidade do enchimento da agulha e a agulha de injeção.
    2. Coloque cuidadosamente uma única e pequena gota de mistura de injeção (~0,5-1 μL) na agulha de injeção, usando o enchimento da agulha para encher a agulha. Coloque a mistura de gota de injeção perto de onde a agulha de injeção começa a afunilar.
  2. Coloque a agulha de injeção no micro-injetor.
  3. Coloque o slide contendo os embriões no estágio do microscópio.
  4. Abrindo a agulha
    NOTA: Se usar agulhas chanfradas, isso não é necessário.
    1. Use uma pressão de injeção inicial de ~30 PSI e ajuste conforme necessário para fornecer um volume apropriado de mistura de injeção.
    2. Sob um microscópio de dissecção, posicione a agulha acima do embrião, e use cuidadosamente o micromanipulador para baixar a agulha sobre o embrião. Uma vez que a agulha mal toque o embrião, mova rapidamente o embrião perpendicular para o longo eixo da agulha.
    3. Para determinar se a agulha foi aberta com sucesso, pressione o gatilho de injeção e veja se alguma bolha/mistura de injeção escapa da agulha. Se não, repita movendo o embrião contra a agulha até que a agulha esteja aberta e a mistura de injeção escape quando o gatilho for pressionado.
  5. Injetando os embriões
    1. Posicione o primeiro embrião em linha no centro de visão no microscópio e certifique-se de que ele está em foco.
    2. Coloque a agulha sobre o primeiro ovo, também dentro do centro do campo de visão dentro do microscópio.
    3. Aumente progressivamente a ampliação do microscópio, baixando cuidadosamente a agulha para mantê-la logo acima do primeiro embrião, centrada e em foco. Prossiga até que o microscópio tenha atingido sua maior ampliação e tanto o embrião quanto a agulha estão em foco.
    4. Mova cuidadosamente o embrião no palco ligeiramente para a esquerda e abaixe ligeiramente a agulha para que a agulha e o embrião estejam agora no mesmo plano de visão.
    5. Usando o estágio do microscópio para mover o embrião, toque cuidadosamente e suavemente o embrião na ponta da agulha. A extremidade estreita e posterior do embrião deve desviar ligeiramente. Ajuste a altura da agulha se estiver muito alta ou muito baixa.
    6. Usando o estágio do microscópio, mova a extremidade posterior do embrião para a agulha e observe a agulha penetrando no acorde do ovo mosquito. A agulha deve apenas penetrar a membrana na localização aproximada das células do polo dentro dos embriões Culex. Uma vez que isso ocorra, puxe o gatilho de injeção 1-3 vezes para atirar mistura de injeção no embrião. Entregue uma pequena quantidade de mistura de injeção, apenas o suficiente para que uma pequena clareira no embrioplasma possa ser detectada.
    7. Usando o palco, mova o embrião para a direita, para longe e para fora da ponta da agulha. Se a injeção correu bem, pouco ou nenhum fluido deve vazar do embrião.
    8. Mova o palco para baixo para que o próximo embrião da linha esteja posicionado na frente da agulha. Em seguida, novamente, mova o palco para a esquerda, posicionando o embrião sobre a agulha de injeção e puxe o gatilho de injeção.
    9. Se a mistura de injeção não parecer estar saindo e/ou se uma grande quantidade de fluido escapar do embrião depois que a agulha for removida, substitua a agulha de injeção e comece novamente.
    10. Destrua quaisquer ovos não injetados ou danificados.
  6. Cuidando dos embriões pós-injeção
    1. Depois de todos os embriões no slide terem sido injetados, lave o óleo de Halocarbon, aplicando água de osmose reversa com uma garrafa de esguicho, de talão de talão de água direcionada para o topo da tampa de vidro acima dos embriões injetados e permitindo que a água flua pela tampa e sobre os embriões para enxaguar o óleo. Certifique-se de não direcionar o fluxo de água diretamente para os embriões, pois isso pode danificá-los ou desvinculá-los do curativo médico. Este processo remove a maioria, mas não todos, do óleo de halocarbono.
    2. Cubra o slide com 150 μL de água DI.
    3. Coloque o slide com os embriões injetados em papel filtro molhado dentro de uma placa de Petri quadrada.
    4. Coloque a placa de Petri contendo os embriões injetados em uma câmara ambiental definida para 25-27 °C, 70-80% RH com um longo dia de fotoperíodo (>13 h luz/dia).

7. Criação de embriões injetados (F0) até a idade adulta e criação de cruzes

  1. Examine os slides dos embriões injetados diariamente, esperando que 1st instar larvas deve emergir 1,5 dias após a injeção.
  2. Conte o número de 1st larvas instar, e coloque 100-200 larvas em um recipiente tupperware do tamanho de uma caixa de sapatos com 450 mL de água DI, e 50 mg de alimentos para peixes moídos. Neste momento, crie 1-5 vezes mais recipientes contendo larvas do tipo selvagem ou não injetadas que serão usadas para atravessar com os mosquitos injetados.
  3. Alimente as larvas diariamente, aumentando ligeiramente a quantidade de alimentos que recebem todos os dias até chegar a 300-500 mgs no6º dia de vida larval.
  4. Uma vez que a pupae apareça, use uma pipeta de transferência para colocar uma pupa em um microcentrifuge de 2 mL cheios de 50-75% cheios de água DI. Repita para todas as pupas, tanto as pupas que foram injetadas como embriões como pupas não injetadas e selvagens. Pressione cuidadosamente as tampas para que fiquem ligeiramente entreabertas, impedindo que os mosquitos escapem, mas ainda permitindo uma pequena quantidade de troca de gás.
  5. Uma vez que os mosquitos adultos emergem dentro de seus tubos de microcentrifuuge, solte mosquitos fêmeas injetadas em uma gaiola contendo mosquitos machos selvagens virgens, alcançando uma proporção de pelo menos 1 macho selvagem para cada fêmea injetada. Da mesma forma, liberar mosquitos machos injetados em uma gaiola contendo fêmeas virgens do tipo selvagem, alcançando uma proporção de aproximadamente 5-10 fêmeas virgens do tipo selvagem para cada macho injetado. Uma maior proporção de fêmeas do tipo selvagem para machos injetados é recomendada, pois cada mosquito macho pode acasalar várias vezes. Portanto, ter um número maior de fêmeas do tipo selvagem que acasalam com machos injetados aumenta o número de descendentes de F1 que podem ser produzidos.

8. Obtenção e criação de mosquitos F1 e triagem para mutações

  1. Sete a dez dias após o surgimento do adulto, ofereça uma refeição de sangue às fêmeas em cada gaiola como descrito acima (passo 3).
  2. Quatro dias após a alimentação sanguínea, coloque água de oviposição em cada gaiola. Cada jangada de ovos representa a prole de um único mosquito fêmea e, portanto, deve ser colocada em seu próprio recipiente de criação de plástico, do tamanho de uma caixa de sapatos logo após a oviposição. Rotule cada recipiente com um identificador único, e também indique que as larvas pertencem à geração F1 para o gene de interesse, se o pai masculino ou feminino foi injetado, a data em que a panela foi estabelecida, condições de criação e as iniciais do experimentador.
  3. Monitore as panelas de larvas diariamente. Assim que as larvas chocarem nas panelas, forneça 50 mg de alimentos para peixes moídos. Aumente o alimento diariamente por 6 dias conforme descrito acima (passo 7.3).
  4. Transfira pupas individuais para tubos de microcentrifuus de 2 mL contendo entre 1-1,5 mL de água DI, rotule cada tubo e quebre as tampas.
  5. Uma vez que os mosquitos adultos emergem, abra cuidadosamente o tubo de microcentrifuuge de 2 mL, cobrindo com um dedo indicador, e usando a outra mão, coloque um frasco de vidro de 3 dram sobre o topo do tubo de microcentrifuuge. O instinto natural do mosquito deve ser voar para cima e para dentro do frasco de vidro. Uma vez que isso aconteça, deslize um dedo sobre a abertura do frasco de vidro, e inverta-o rapidamente, colocando uma pequena bola de algodão que foi ligeiramente molhada com 10% de solução de sacarose no topo do frasco. Isso evita que o mosquito escape e fornece uma fonte de alimento e água necessária.
  6. Rotule tanto o tubo contendo a exuvia pupal quanto o frasco de vidro contendo o mosquito adulto para indicar a panela larval da qual se originou, o sexo do mosquito, e o identificador único para esse indivíduo. Ex: II.C.M32, onde "II" representa que o pai masculino foi injetado, "C" representa a balsa pan/ovo da qual o indivíduo se originou, e "M32" designa que foi o 32º macho a emergir daquele recipiente de criação larval.
  7. Coloque mosquitos adultos dentro de seus frascos de vidro individuais de volta à câmara ambiental, e adicione uma pequena quantidade (~20 μL) de solução de sacarose de 10% ao seu algodão diariamente. Certifique-se de não alimentar ou saturar o algodão, pois os mosquitos ficarão presos na solução de sacarose e morrerão.
  8. Triagem de mosquitos para a mutação desejada
    1. Extrair DNA genômico de 5-10 exuvia pupal de cada jangada de ovos/panela de larvas usando o Kit Phire Direct PCR de acordo com as instruções do fabricante, bem como 1-2 indivíduos do tipo selvagem que servirão como controle.
      NOTA: Como a prole de cada jangada são provavelmente irmãos completos, a triagem de 5-10 larvas de cada panela determinará se a mutação foi transmitida para a prole. Se nenhuma das larvas monitoradas de uma panela tiver a mutação desejada, não trie adultos adicionais. Se algumas das larvas têm a mutação, então cada indivíduo daquela panela deve ser examinado.
    2. Usando os primers PCR previamente projetados (passo 1.2), amplie o fragmento em torno da localização prevista de sua mutação usando o kit Phire PCR tanto na prole tipo selvagem quanto na F1 e execute fragmentos de PCR em um gel de 3-4% de agarose para determinar se há inserções ou exclusões visíveis (indels).
      NOTA: Todos os indivíduos que tiverem a mutação desejada serão heterozigosos e deverão exibir 2 bandas, um tipo selvagem e um ligeiramente mais curto ou mais longo na posição desejada. Para distingui-los, compare a posição e a espessura das bandas dos indivíduos do tipo selvagem com os das bandas da prole f1. Idealmente 2 bandas discretas serão visíveis, mas se o indel for muito pequeno, a banda pode parecer mais larga e/ou embaçada.
    3. Purifique o produto PCR, seja extirpando a banda contendo os indelés suspeitos (recomendado) ou purificando o produto PCR restante que não foi carregado no gel. Envie o PCR purificado para sequenciamento para determinar se a mutação desejada está presente.

9. Obtenção e criação de mosquitos F2 e F3 e triagem para mutações

  1. Libere todos os mosquitos adultos F1 para os quais a mutação desejada foi encontrada através da triagem de sua exuvia pupal de seus frascos de vidro individuais e em uma gaiola contendo mosquitos selvagens e não injetados do sexo oposto. O backcrossing para esta segunda geração deve remover todos os efeitos deletérios da injeção e da endogamia.
  2. O sangue alimenta as gaiolas dos mosquitos mutantes F1 e seus homólogos selvagens como descrito anteriormente. Quatro a cinco dias depois, colete as jangadas de ovos F2 resultantes.
  3. Rotule e vire as larvas F2 como descrito acima, colocando cada jangada de ovos em um recipiente separado e rotulado. Após a pupação, separe novamente a pupa individual em tubos individuais de microcentrifuuge de 2 mL e transfira cada adulto em frascos de vidro separados cobertos com algodão encharcado de sacarose após o surgimento. Em seguida, trie a exuvia pupal de cada indivíduo F2 a mutação desejada como descrito anteriormente (etapas 8.5-8.8).
    NOTA: Aqui todos os indivíduos que têm a mutação desejada serão heterozigosos, e, portanto, o produto PCR deve produzir idealmente 2 bandas distintas quando executado em um gel de 3-4% de agarose.
  4. Uma vez que as larvas mutantes F2 tenham sido identificadas, coloque todos os machos e fêmeas que têm a mutação na mesma gaiola para acasalar. Alimentação sanguínea 7-10 dias após o surgimento de adultos, e 4-5 dias depois, coletar as jangadas de ovos F3.
  5. Coloque cada jangada de ovos F3 em um recipiente de criação larval separado, e rotule e alimente como descrito acima.
  6. Separe o pupae F3 em tubos individuais de microcentrifuuge de 2 mL. Uma vez que os adultos emergem, transfira-os para frascos de vidro individuais cobertos com 10% de algodão encharcado de sacarose. Tela a exuvia pupal como descrito anteriormente. Desta vez, aproximadamente 25% da prole em cada panela deve ser homozigosa para a mutação nula. Coloque esses indivíduos em uma única gaiola, e use-os para criar e manter a linha mutante recém-gerada de mosquitos.
    NOTA: Se houver um baixo número de mosquitos homozigos, machos e fêmeas heterozigos F3 podem ser cruzados entre si para gerar mosquitos homozigos-nulos adicionais na geração F4.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando o protocolo descrito, conseguimos injetar com sucesso embriões de Cx. pipiens,e observamos uma alta taxa de sobrevivência entre os embriões injetados (~55%, Figura 1). Os ensaios anteriores tiveram uma menor porcentagem de sobrevivência, provavelmente porque o anterior do folículo do ovo estava ligado à tira de curativo médico, impedindo que larvas de mosquito escapassem do acorde e nadassem com sucesso na água. Garantir que a extremidade anterior se estenda além da faixa de ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta métodos para introduzir mutações específicas no genoma dos mosquitos Culex e pode ser usado para editar o genoma de outros mosquitos também. O protocolo é significativo na medida em que fornece detalhes específicos não apenas de como preparar os materiais de injeção, mas também uma visão detalhada de vídeo de como induzir mosquitos a colocar ovos, bem como como preparar e injetar esses ovos. Também resumimos como aproveitar a biologia do Cx. pipiens feminino para colocar ovos em...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A RH funciona para a Instalação de Transformação de Insetos, que presta serviços de modificação genética de insetos.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. David O'Brochta e a todos os membros da Rede de Pesquisa de Coordenação de Tecnologias Genéticas de Insetos pela ajuda e treinamento que eles nos fornecem e outros sobre a implementação de tecnologias genéticas. Agradecemos especialmente a Channa Aluvihare por otimizar o protocolo de micromanipulação para permitir que embriões Culex sejam injetados e hatch. Agradecemos também a Devante Simmons e Joseph Urso, estudantes de graduação que trabalham no laboratório Meuti, por sua assistência ao cuidado e triagem de mosquitos transgênicos, e Zora Elmkami, da ITF, por assistência à criação e preparação de mosquitos para injeção. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Sementes Interdisciplinares do Instituto de Doenças Infecciosas da OSU fornecida ao MEM.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alimentador de membrana artificialHemotekSP5W1-3Localização da empresa: Blackburn, UK
ATPInvitrogen18330019Localização da empresa: Carlsbad, CA, USA
Tubos mirocapilares de vidro borossilicato, diâmetro externo de 1 mmWorld Precision Instruments1B100-6Localização da empresa: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle BevelerSutter InstrumentsBV-10-BLocalização da empresa: Nobato, CA, USA
Papel de filtro circular Whatman (12.5 cm)Sigma AldrichWHA1001125Localização da empresa: St. Louis, MO, USA
Tubo cônico (50 mL)Thermo Fisher Scientific339652Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Papel de filtro de curso Fisherbrand com taxa de fluxo rápidoThermo Fisher Scientific09-800Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Vidro de cobertura (24 x 40 mm)Thermo Fisher Scientific50-311-20Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Barragem dentáriaHenry Schein Inc1010171Localização da empresa: Melville, NY EUA
Fita dupla face escocesaThermo Fisher ScientificNC0879005Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Microinjetor FemtoJet 4iEppendorf5252000021Localização da empresa: Hamburgo, Alemanha
Frasco de vidro (2 dram)Thermo Fisher Scientific033401CLocalização da empresa: Waltham, MA, USA
Óleo halocarbonoSigma AldrichH8898-50MLLocalização da empresa: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle PullerSutter InstrumentsP-2000/GLocalização da empresa: Nobato, CA, USA
ParafilmThermo Fisher Scientific50-998-944Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Extrator de agulha ponderado PC-100NarishigePC-100Isso é compatível com o modelo PC-10 anterior, que foi descontinuado. Localização da empresa: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR KitThermo Fisher ScientificF140WHLocalização da empresa: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)Thermo Fisher Scientific50-268-05Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Tubos mirocapilares de vidro de quartzo, tubo capilar de diâmetro externo de 1 mmSupplies LimitedQGCT 1.0Localização da empresa: Cornwall, UK
Guia-o&comércio; Kit de triagem de sgRNATakara, Bio USA632639Este kit permite determinar se os gRNAs cortam sequências de DNA in vitro. Localização da empresa: Mountain View, CA, USA
SigmacoteSigma AldrichSL2-100MLLocalização da empresa: St. Louis, MO, USA
Placas de Petri pequenas (35X10 mm)Thermo Fisher Scientific50-190-0273Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Citrato de sódio sangue de galinhaLampire biologicals7201406Localização da empresa: Everett, PA, USA
Placa de Petri quadrada Fisherbrand (10 cm x 10 cm)Thermo Fisher ScientificFB0875711ALocalização da empresa: Waltham, MA, USA
TegadermHenry Schein Inc.7771180Localização da empresa: Melville, NY USA
Alimentos para peixes tropicaisTetraminN/A
Papel de filtro WhatmanThermo Fisher Scientific09-927-826Localização da empresa: Waltham, MA, USA
Papel de filtro Whatman, 4.25 cmSigma Aldrich1001-042Localização da empresa: St. Louis, MO, USA

Referências

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