O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.
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Artigo de método
Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os mosquitos Culex são os principais vetores de várias doenças que afetam negativamente a saúde humana e animal, incluindo o vírus do Nilo Ocidental e doenças causadas por nematoides filarial, como verme canino e elefanta. Recentemente, a edição do genoma CRISPR/Cas9 tem sido usada para induzir mutações direcionadas ao local, injetando uma proteína Cas9 que foi complexada com um guia de RNA (gRNA) em embriões recém-colocados de várias espécies de insetos, incluindo mosquitos que pertencem aos gêneros Anopheles e Aedes. Manipular e injetar mosquitos Culex é um pouco mais difícil, pois esses mosquitos colocam seus ovos em ré em jangadas em vez de individualmente como outras espécies de mosquitos. Aqui descrevemos como projetar gRNAs, complá-los com proteína Cas9, induzir mosquitos fêmeas de pipiens Culex para colocar ovos, e como preparar e injetar embriões recém-colocados para microinjeção com Cas9/gRNA. Também descrevemos como criar e testar mosquitos injetados para a mutação desejada. Os resultados representativos demonstram que essa técnica pode ser usada para induzir mutações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos Culex e, com pequenas modificações, pode ser usada para gerar mutantes nulos em outras espécies de mosquitos também.
Introdução
Os mosquitos Culex são distribuídos pelas regiões temperadas e tropicais do mundo e transmitem vários vírus mortais, incluindo o vírus do Nilo Ocidental1, encefalite de St. Louis2, bem como nematoides filares que causam verme canino3 e elefantíase4. Membros do complexo Culex pipiens, que inclui Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus,mostram variações marcantes em muitos aspectos de sua biologia. Por exemplo, enquanto Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens molestus são incapazes de ....
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Protocolo
Na maioria das instituições de pesquisa, um Protocolo de Biossegurança aprovado deve estar em vigor antes que insetos transgênicos sejam gerados ou mantidos para garantir que organismos geneticamente modificados não escapem ou sejam removidos das instalações de laboratório. Regulamentos adicionais do governo também podem ser aplicados. Antes de iniciar um projeto dessa natureza, verifique todas as políticas e procedimentos institucionais para determinar quais documentos e aprovações são necessários.
1. Projetar gRNAs e preparar misturas de injeção
- Projete 2-5 gRNAs para cada gene alvo, pois alguns gRNAs funcionam ....
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Resultados
Usando o protocolo descrito, conseguimos injetar com sucesso embriões de Cx. pipiens,e observamos uma alta taxa de sobrevivência entre os embriões injetados (~55%, Figura 1). Os ensaios anteriores tiveram uma menor porcentagem de sobrevivência, provavelmente porque o anterior do folículo do ovo estava ligado à tira de curativo médico, impedindo que larvas de mosquito escapassem do acorde e nadassem com sucesso na água. Garantir que a extremidade anterior se estenda além da faixa de .......
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Discussão
Este protocolo apresenta métodos para introduzir mutações específicas no genoma dos mosquitos Culex e pode ser usado para editar o genoma de outros mosquitos também. O protocolo é significativo na medida em que fornece detalhes específicos não apenas de como preparar os materiais de injeção, mas também uma visão detalhada de vídeo de como induzir mosquitos a colocar ovos, bem como como preparar e injetar esses ovos. Também resumimos como aproveitar a biologia do Cx. pipiens feminino para colocar ovos em.......
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Divulgações
A RH funciona para a Instalação de Transformação de Insetos, que presta serviços de modificação genética de insetos.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. David O'Brochta e a todos os membros da Rede de Pesquisa de Coordenação de Tecnologias Genéticas de Insetos pela ajuda e treinamento que eles nos fornecem e outros sobre a implementação de tecnologias genéticas. Agradecemos especialmente a Channa Aluvihare por otimizar o protocolo de micromanipulação para permitir que embriões Culex sejam injetados e hatch. Agradecemos também a Devante Simmons e Joseph Urso, estudantes de graduação que trabalham no laboratório Meuti, por sua assistência ao cuidado e triagem de mosquitos transgênicos, e Zora Elmkami, da ITF, por assistência à criação e preparação de mosquitos para injeção. Este trabalho foi ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alimentador de membrana artificial | Hemotek | SP5W1-3 | Localização da empresa: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Localização da empresa: Carlsbad, CA, USA |
| Tubos mirocapilares de vidro borossilicato, diâmetro externo de 1 mm | World Precision Instruments | 1B100-6 | Localização da empresa: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Localização da empresa: Nobato, CA, USA |
| Papel de filtro circular Whatman (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Localização da empresa: St. Louis, MO, USA |
| Tubo cônico (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Papel de filtro de curso Fisherbrand com taxa de fluxo rápido | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Vidro de cobertura (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Barragem dentária | Henry Schein Inc | 1010171 | Localização da empresa: Melville, NY EUA |
| Fita dupla face escocesa | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Microinjetor FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | Localização da empresa: Hamburgo, Alemanha |
| Frasco de vidro (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Óleo halocarbono | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Localização da empresa: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Localização da empresa: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Extrator de agulha ponderado PC-100 | Narishige | PC-100 | Isso é compatível com o modelo PC-10 anterior, que foi descontinuado. Localização da empresa: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Tubos mirocapilares de vidro de quartzo, tubo capilar de diâmetro externo de 1 mm | Supplies Limited | QGCT 1.0 | Localização da empresa: Cornwall, UK |
| Guia-o&comércio; Kit de triagem de sgRNA | Takara, Bio USA | 632639 | Este kit permite determinar se os gRNAs cortam sequências de DNA in vitro. Localização da empresa: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Localização da empresa: St. Louis, MO, USA |
| Placas de Petri pequenas (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Citrato de sódio sangue de galinha | Lampire biologicals | 7201406 | Localização da empresa: Everett, PA, USA |
| Placa de Petri quadrada Fisherbrand (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Localização da empresa: Melville, NY USA |
| Alimentos para peixes tropicais | Tetramin | N/A | |
| Papel de filtro Whatman | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Localização da empresa: Waltham, MA, USA |
| Papel de filtro Whatman, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Localização da empresa: St. Louis, MO, USA |
Referências
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephaliti....
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Reimpressões e permissões
