O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.
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Artigo de método
Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As forças externas são um fator importante na formação, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Os efeitos dessas forças são frequentemente estudados usando métodos especializados de alongamento in vitro. Vários sistemas disponíveis usam macas à base de substrato 2D, enquanto a acessibilidade de técnicas 3D para coar hidrogéis macios, é mais restrita. Aqui, descrevemos um método que permite alongamento externo de hidrogéis macios a partir de sua circunferência, usando uma tira de silicone elástica como portador da amostra. O sistema de alongamento utilizado neste protocolo é construído a partir de peças impressas em 3D e eletrônicos de baixo custo, tornando-o simples e fácil de replicar em outros laboratórios. O processo experimental começa com hidrogéis de fibrina macia polimerizador (>100 μm) (Elastic Modulus de ~100 Pa) em um recorte no centro de uma tira de silicone. As construções de gel de silicone são então anexadas ao dispositivo de alongamento impresso e colocadas no estágio do microscópio confocal. Sob microscopia ao vivo, o dispositivo de alongamento é ativado, e os géis são imageados em várias magnitudes de estiramento. O processamento de imagem é então usado para quantificar as deformações de gel resultantes, demonstrando cepas relativamente homogêneas e alinhamento de fibras ao longo da espessura 3D do gel (eixoZ). As vantagens deste método incluem a capacidade de coar hidrogéis extremamente macios em 3D durante a execução da microscopia in situ, e a liberdade de manipular a geometria e o tamanho da amostra de acordo com as necessidades do usuário. Além disso, com a devida adaptação, este método pode ser usado para esticar outros tipos de hidrogéis (por exemplo, colágeno, poliacrilamida ou polietileno glicol) e pode permitir a análise de células e resposta tecidual a forças externas em condições 3D mais biomiméticas.
Introdução
A resposta tecidual às forças mecânicas é parte integrante de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo expressão genética1,diferenciação celular2e remodelação tecidual3. Além disso, alterações induzidas por força na matriz extracelular (ECM), como alinhamento de fibras e adensamento, podem impactar o comportamento celular e a formação tecidual4,5,6. A estrutura de malha fibrosa do ECM possui propriedades mecânicas intrigantes, como elasticidade não linear, deformação não afine e deformações plástic....
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Protocolo
1. Preparação da solução (a ser realizada com antecedência)
- Rotulagem fibrinogênio
NOTA: A etapa de rotulagem só é necessária se a análise da deformação do gel de fibrina for desejada. Para experimentos celulares, é possível usar um gel sem rótulo.- Adicione 38 μL de 10 mg/mL de corante fluorescente de éster succinimidil (dissolvido em DMSO) a 1,5 mL de solução fibrinogênio de 15 mg/mL (razão molar de 5:1) em um tubo centrífuga de 50 mL e coloque em um agitador por 1 hora à temperatura ambiente. Depois, coloque o tubo na centrífuga por 3 minutos a 800 x g (temperatura ambiente).
- Filtre o supernatante da etapa anterior através de....
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Resultados
Dados representativos de trecho estático de magnitudes crescentes aplicadas à tira de silicone carregando um hidrogel fibrina 3D, embutido com contas fluorescentes de 1 μm, são mostrados na Figura 9. A análise demonstra o efeito do estiramento do silicone nas alterações geométricas do recorte, bem como as cepas desenvolvidas dentro do gel. Imagensde pilha de Z de todo o gel são usadas para avaliar a deformação do recorte em forma de círculo original para a geometria elíptic.......
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Discussão
O método e o protocolo aqui apresentados são em grande parte baseados em nosso estudo anterior por Roitblat Riba et al.41 Incluímos aqui o design completo auxiliado por computador (CAD), Python e códigos microcontroladores do dispositivo SCyUS.
As principais vantagens do método apresentado sobre as abordagens existentes incluem a possibilidade de esticar hidrogéis 3D muito macios (Módulo Elástico de ~100 Pa) de sua circunferência, e sob imagens confocal ao .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Algumas figuras incluídas aqui foram adaptadas por permissão do Centro de Liberação de Direitos Autorais: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Esticando hidrogéis 3D com cepas uniformes de eixo Z ao permitir imagens de microscopia ao vivo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 ácido carboxílico, éster succinimidílico | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Adicione 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamina, 1% Pyruvate de Sódio |
| Lamínula #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22× 40 mm |
| SULFÓXIDO DE DIMETILA 99,5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Selante de Fibrina (Humano) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogênio: 70 mg/mL, Trombina: 800-1200 UI/mL |
| Tampão Fibrinogênio | N/A | Receita para 1L: 7g de NaCl, 2,94g de citrato trissódico di-hidratado, 9g de glicina, 20g de cloridrato de arginina e 0,15g de cloreto de cálcio di-hidratado. Traga o volume final para 1L com PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Micro-esferas fluorescentes FluoSpheres (1 µ m) | Invitrogen | F8820 | Laranja (540/560) Fornecido como suspensão (2% sólidos) em água mais 2 mM azida de |
| sódio Borracha de silicone de alta temperatura | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µ m-espesso E = 1,5 Mpa Razão de Poisson = 0,48 Resistência à tração = 4,8 MPa Limite superior de estiramento = +300% de tensão de engenharia |
| Coluna de dessalinização HiTrap 5 mL (Sephadex G-25 embalado) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G Composto de vedação de alto vácuo | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD | Versão 1.8.0_112 | |
| Microcontrolador (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrífuga | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Microscópio de luz primovert | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systè mes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/ | A N/A | |
| Servomotor - TowerPro SG-5010 | Centrífuga Adafruit | 155 | |
| SL 16R | Thermo Scientific | 75004030 | Para 50 tubos mL |
| Estéril 10 placas de não-cultura cm | Corning | 430167 | |
| Tampão de trombina | N/A | Receita para 1L: 20g de manitol, 8,77g de NaCl, 2,72g de acetato de sódio trihidratado, 24 mL de albumina sérica humana a 25%, 5,88g de cloreto de cálcio. Traga o volume final para 1L com PuW (pH 7.0) | |
| Solução de tripsina EDTA B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| Cabo USB (Tipo B Macho para Tipo A Macho) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Microscópio Confocal | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (preto) | Carl Zeiss AG | Versão de lançamento 14.0.0.0 |
Referências
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816(2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cycli....
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Reimpressões e permissões
