Perfil de alto rendimento e proteoma profundo por marcação de etiquetas de massa em tandem de 16 plex acoplada a cromatografia bidimensional e espectrometria de massa

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo otimizado de alto rendimento desenvolvido com reagentes de marcação de massa em tandem de 16 plex, permitindo o perfil quantitativo de proteoma de amostras biológicas. O extenso fracionamento básico de pH e a LC-MS/MS de alta resolução reduzem a compressão da razão e fornecem cobertura profunda do proteoma.

Resumo

A marcação isobárica de massa em tandem (TMT) é amplamente utilizada em proteômica devido à sua alta capacidade de multiplexação e cobertura profunda do proteoma. Recentemente, foi introduzido um método TMT expandido de 16 plex, o que aumenta ainda mais o rendimento dos estudos proteômicos. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo otimizado para perfil de proteoma profundo baseado em TMT de 16 plex, incluindo preparação de amostras de proteínas, digestão enzimática, reação de marcação de TMT, fracionamento bidimensional de cromatografia líquida de fase reversa (LC / LC), espectrometria de massa em tandem (MS / MS) e processamento de dados computacionais. As etapas cruciais de controle de qualidade e melhorias no processo específico para a análise TMT de 16 plex são destacadas. Este processo multiplexado oferece uma ferramenta poderosa para traçar o perfil de uma variedade de amostras complexas, como células, tecidos e amostras clínicas. Mais de 10.000 proteínas e modificações pós-traducionais, como fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação em amostras biológicas altamente complexas de até 16 amostras diferentes, podem ser quantificadas em um único experimento, fornecendo uma ferramenta potente para pesquisa básica e clínica.

Introdução

Os rápidos desenvolvimentos na tecnologia de espectrometria de massa permitiram alcançar alta sensibilidade e cobertura profunda do proteoma em aplicações proteômicas ^1,2. Apesar desses desenvolvimentos, a multiplexação de amostras continua sendo o gargalo para os pesquisadores que lidam com a análise de uma grande coorte de amostras.

As técnicas de marcação isobárica multiplexada são amplamente utilizadas para quantificação relativa de grandes lotes de amostras^em todo o proteoma 3,4,5,6. A quantificação baseada em tags de massa em tandem (TMT) é uma escolha popular por sua alta capacidade de multiplexação ^7,8. Os reagentes TMT foram inicialmente lançados como um kit 6-plex capaz de quantificar até 6 amostras simultaneamente⁹. Essa tecnologia foi expandida para quantificar 10-11 amostras^10,11. Os reagentes TMTpro 16-plex recentemente desenvolvidos (doravante denominados TMT16) aumentaram ainda mais a capacidade de multiplexação para 16 amostras em um único experimento^12,13. Os reagentes TMT16 usam um grupo repórter baseado em prolina, enquanto o TMT 11-plex aplica um grupo repórter derivado de dimetilpiperidina. Tanto o TMT11 quanto o TMT16 usam o mesmo grupo reativo de amina, mas o grupo de balanço de massa do TMT16 é maior que o do TMT11, permitindo que a combinação de 8 isótopos estáveis de C13 e N15 nos íons repórter atinja 16 repórteres (Figura 1).

O aumento da capacidade de multiplexação fornece uma plataforma para projetar experimentos com réplicas suficientes para superar desafios estatísticos¹⁴. Além disso, os canais adicionais no TMT 16-plex ajudam a reduzir a quantidade total de material de partida por canal, o que pode ajudar no desenvolvimento de proteômica de célula única emergente¹⁵. A alta capacidade de multiplexação também será valiosa na quantificação de modificações pós-traducionais, o que normalmente requer grandes quantidades de material de partida^16,17.

Os fluxos de trabalho proteômicos que empregam a tecnologia TMT foram simplificados ^18,19,20 e evoluíram significativamente na última década em termos de preparação de amostras, separação por cromatografia líquida, aquisição de dados por espectrometria de massa e análise computacional 21,22,23,24,25,26. Nosso artigo anterior fornece uma visão geral detalhada da plataforma TMT de 10 plex²⁷. O protocolo descrito aqui apresenta um método detalhado e otimizado para TMT16, incluindo extração e digestão de proteínas, marcação de TMT16, agrupamento e dessalinização de amostras, pH básico e LC de fase reversa (RP) de pH ácido, MS de alta resolução e processamento de dados (Figura 2). O protocolo também destaca as principais etapas de controle de qualidade que foram incorporadas para concluir com sucesso um experimento proteômico quantitativo. Este protocolo pode ser usado rotineiramente para identificar e quantificar mais de 10.000 proteínas com alta reprodutibilidade, para estudar vias biológicas, processos celulares e progressão da doença 20,28,29,30.

Protocolo

Os tecidos humanos para o estudo foram obtidos com aprovações do Programa de Doação de Cérebro e Corpo do Banner Sun Health Research Institute.

1. Extração de proteínas do tecido e controle de qualidade

NOTA: Para reduzir o impacto da colheita de amostras no proteoma, é crucial coletar amostras em tempo mínimo em baixa temperatura, se possível³¹. Isso é especialmente importante ao analisar modificações pós-traducionais, pois elas são tipicamente lábeis, por exemplo, alguns eventos de fosforilação têm apenas alguns segundos de meia-vida^32,33.

1. Excisar e pesar amostras de tecido
   1. Tara um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma balança analítica e pré-resfrie o tubo sobre gelo seco.
   2. Corte um tecido congelado (por exemplo, tecido cerebral humano, ~ 10 mg) de uma região definida em pequenos pedaços e transfira os pedaços de tecido para o tubo pré-resfriado imediatamente.
      NOTA: Para reduzir a heterogeneidade da amostra, é importante usar tamanhos homogêneos e regiões anatômicas para todas as 16 amostras. A quantidade de proteína obtida do tecido é tipicamente de 5 a 10% do peso do tecido.
   3. Pese o tubo junto com o lenço de papel e coloque o tubo imediatamente em gelo seco. Processar as 15 amostras restantes usando o mesmo procedimento. Manter as amostras em gelo seco imediatamente após a dissecação e conservá-las a 80 °C.
2. Lyse amostras de tecido
   1. Prepare um tampão de lise fresco (HEPES 50 mM pH 8,5, ureia 8 M e desoxicolato de sódio a 0,5%) no dia do experimento. Os inibidores da fosfatase devem ser adicionados ao tampão de lise para preservar o estado de fosforilação das proteínas.
      NOTA: Coloque o tampão de lise em temperatura ambiente antes de usá-lo, pois a ureia 8 M precipitará no gelo, o que pode resultar em desnaturação incompleta da proteína durante a lise da amostra e reduzir a eficiência da digestão da proteína.
   2. Adicione o tampão de lise (adicione 100 μL de tampão de lise por 10 mg de tecido para atingir uma concentração final de proteína de 5 a 10 μg / μL) e esferas de vidro (~ 20% do volume do lisado, 0,5 mm de diâmetro) a cada amostra.
   3. Lisar o tecido num misturador a 4 °C com uma velocidade de velocidade 8 durante 30 s, descansar durante 5 s, repetir até que as amostras estejam homogeneizadas (~ 5 ciclos).
3. Prepare alíquotas dos lisados.
   1. Preparar pelo menos duas alíquotas para cada amostra. Uma pequena alíquota (~ 10 μL) é usada para a análise da concentração de proteínas e a avaliação da qualidade da proteína (por exemplo, validação de western blotting de proteínas de controle positivo). Uma alíquota maior (~ 50 μL) é usada para análise do proteoma.
   2. Congelar imediatamente as alíquotas em gelo seco e conservar a -80 °C até nova utilização.
4. Medir a concentração de proteínas
   NOTA: A concentração de proteína pode ser medida pelo ensaio BCA ou pelo método de coloração em gel SDS curto³⁴ (Figura 3A). Como os componentes não redutores de proteínas no lisado tecidual podem afetar a medição no ensaio de BCA, os usuários podem validar a concentração de proteína pelo método de coloração em gel SDS curto. O método de coloração em gel SDS curto é apresentado aqui.
   1. Diluir 16 amostras aliquotadas em 10 vezes e preparar o padrão BSA (por exemplo, titulações BSA de 0,15, 0,5, 1,5 e 3 μg).
   2. Execute as amostras e o padrão BSA em um gel SDS-PAGE a 10% (26 poços) com um gel de empilhamento até que todas as proteínas migrem aproximadamente 3 mm para dentro do gel.
   3. Pinte o gel com azul de Coomassie por 1 h e remova a coloração do gel até que o fundo na região em branco esteja claro.
   4. Escaneie o gel para medir as intensidades das bandas de proteína coradas com Coomassie por ImageJ e crie uma curva padrão BSA de acordo com as medições.
   5. Calcule a concentração absoluta de proteína pela curva padrão.
      NOTA: A concentração final de proteína para cada amostra neste experimento foi de ~ 5-10 μg / μL. Para a análise proteômica baseada em TMT16, 50 μg de proteína por amostra (total de 0,8 mg de proteína para análise de proteoma total) são suficientes.
5. Controle de qualidade da amostra
   NOTA: Esta etapa de controle de qualidade é fundamental para identificar amostras de baixa qualidade antes de realizar a análise TMT. Para amostras com alteração proteica conhecida, sugere-se validar a alteração por western blotting. A análise padrão SDS-PAGE também é recomendada para examinar padrões de proteínas e excluir quaisquer amostras com altos graus de degradação ( Figura 3B ).
   1. Pegue ~ 10 μg de cada amostra da pequena alíquota e execute as amostras em um gel SDS-PAGE gradiente até que o corante azul de bromofenol atinja o fundo do gel.
   2. Pinte o gel com azul Coomassie e retire a coloração do gel. Inspecione a qualidade da proteína para remover amostras de proteína altamente degradadas.
      NOTA: Amostras degradadas podem ser identificadas como aquelas que têm muito poucas bandas de proteína na região de alto peso molecular e bandas intensificadas na região de baixo peso molecular ( Figura 3B ).

2. Digestão de proteínas em solução, redução e alquilação de peptídeos, teste de eficiência de digestão e dessalinização de peptídeos

1. Digestão de proteínas por Lys-C e tripsina
   1. Pegue ~ 50 μg de proteína da alíquota grande de cada amostra e adicione tampão de lise a 50 μL.
   2. Adicione 100% de acetonitrila (ACN) para atingir uma concentração final de 10%.
   3. Realize a digestão de Lys-C adicionando Lys-C a uma proporção proteína:Lys-C de 100:1 (p/p) e incubando à temperatura ambiente por 3 h.
   4. As amostras são diluídas para conter uma concentração final de 2 M de ureia por 50 mM de HEPES (pH 8,5).
   5. Adicione tripsina em cada amostra a uma proporção proteína: tripsina de 50:1 (p/p) e realize a digestão em temperatura ambiente por 3 h ou durante a noite.
2. Redução e alquilação de peptídeos
   1. Adicione a solução de ditiotreitol (1 M DTT) recém-preparada a uma concentração final de 1 mM e incube por 1 h em temperatura ambiente para reduzir as ligações dissulfeto.
   2. Adicionar a solução de iodoacetamida (IAA 1 M) recém-preparada a uma concentração final de 10 mM durante 30 min no escuro para alquilar os resíduos de cisteína.
   3. Extinguir o IAA não reagido adicionando 1 M de DTT a uma concentração final de 30 mM e incubar à temperatura ambiente por mais 30 min.
3. Examine a eficiência da digestão
   1. Pegue ~ 1 μg de cada amostra e dessalinize usando ponteiras de pipeta revestidas com resina C18 de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Analise cada amostra por uma execução de LC-MS/MS de gradiente curto (veja mais detalhes na etapa 5).
   3. Execute uma pesquisa no banco de dados para dados brutos do MS (veja mais detalhes na etapa 6). Calcule a porcentagem de peptídeos identificados com pelo menos um local de misclivagem de tripsina. A porcentagem geralmente é inferior a 15%.
   4. Se a porcentagem for maior que 15%, adicione tripsina adicional às amostras para repetir a digestão.
   5. Após a digestão, acidifique as amostras adicionando TFA a 0,5% (v/v). Verifique o pH por uma faixa de pH para garantir que o pH seja inferior a 3.
4. Dessalinização de peptídeos
   1. Centrifugue os peptídeos acidificados a 21.000 x g por 10 min. Transferir os sobrenadantes para um novo tubo.
   2. Lave as colunas de dessalinização C18 (~ 25 μL de resina) duas vezes com 250 μL de metanol 100% centrifugando a 500 x g por 30 s.
      NOTA: Para reduzir a perda de peptídeos durante o processo de dessalinização, escolha colunas de dessalinização com capacidade de ligação correspondente à quantidade de entrada.
   3. Lave as colunas duas vezes usando 250 μL de tampão de eluição (60% ACN, 0,1% TFA) centrifugando a 500 x g por 30 s.
   4. Equilibre as colunas duas vezes com 250 μL de equilíbrio e tampão de lavagem (0,1% TFA) centrifugando a 500 x g por 30 s.
   5. Carregue amostras nas colunas pré-equilibradas. Deixe as amostras se ligarem a colunas girando a 100 x g por 6 min. Certifique-se de que toda a solução tenha passado pela coluna.
   6. Lave as colunas três vezes com 250 μL de equilíbrio e lave o tampão centrifugando a 500 x g por 30 s.
   7. Eluir os peptídeos adicionando 125 μL de tampão de eluição a cada coluna e girando a 100 x g por 3 min. Verifique se a coluna não contém nenhuma solução restante.
   8. Seque os peptídeos eluídos em um concentrador a vácuo e armazene os peptídeos a -80 °C para futura rotulagem de TMT.

3. Rotulagem TMT16 de peptídeos, teste de eficiência de rotulagem, agrupamento de amostras e dessalinização de peptídeos rotulados

1. Marcação TMT16 de peptídeos
   1. Ressuspenda cada amostra de peptídeo dessalinizado em 50 μL de HEPES 50 mM (pH 8,5) por vórtice várias vezes ou dissolução ultrassônica seguida pelo uso de uma faixa de pH para verificar o pH.
      NOTA: A amostra pode ser ácida se não for completamente seca antes da rotulagem, o que influencia negativamente a eficiência da rotulagem. Certifique-se de que o pH esteja entre 7 e 8.
   2. Pegue ~ 1 μg de peptídeos não marcados de cada amostra como controles negativos para o teste de eficiência de marcação TMT.
   3. Dissolva os reagentes TMT16 em ACN anidro. Realize a reação de marcação adicionando os reagentes a uma proporção TMT:proteína de 1,5:1 (p/p) e incubando em temperatura ambiente por 30 min.
      NOTA: A proporção TMT:proteína usada para TMT16 é 50% maior do que a proporção usada para TMT11. Essa pequena discrepância pode ser devido à massa molecular do TMT16 ser maior (1,2 vezes) do que a dos reagentes do TMT11. A quantidade de proteína é estimada a partir das amostras sem considerar a perda durante a dessalinização.
2. Teste de eficiência de rotulagem
   1. Pegue ~ 1 μg de peptídeos marcados de cada amostra para o teste de eficiência de marcação. Colocar as amostras restantes a -80 °C sem extinguir a reação.
   2. Dessalinize ~ 1 μg de cada uma das amostras marcadas e não marcadas com TMT16 por ponteiras de pipeta revestidas com resina C18 de acordo com o protocolo do fabricante.
   3. Analise as amostras por LC-MS/MS (consulte a seção 5, com a exceção de que o gradiente é de 10 min).
   4. Estime a eficiência de marcação analisando a redução da intensidade MS1 de peptídeos não marcados entre amostras não marcadas e marcadas. Selecione de 6 a 10 peptídeos diferentes para verificar a eficiência da rotulagem e garantir que todos os peptídeos sejam rotulados.  Para a rotulagem completa, peptídeos não marcados não são observados.
      NOTA: É importante garantir a rotulagem completa de todas as amostras para identificação e quantificação precisas de proteínas a jusante.
   5. Se a rotulagem não estiver completa, adicione reagentes TMT adicionais para rotular os peptídeos restantes e verifique a eficiência da rotulagem novamente antes de extinguir. Depois que a amostra estiver completamente marcada, extinguir a reação à temperatura ambiente adicionando hidroxilamina a uma concentração final de 0,5% e incubar em temperatura ambiente por 15 min.
3. Pooling e dessalinização de amostras
   1. Junte metade de cada amostra marcada com TMT para fazer uma mistura.
   2. Retire 1 μg da mistura e dessalinize com ponteiras de pipeta revestidas com resina C18 e, em seguida, analise por LC-MS/MS usando um gradiente curto (~30 min).
   3. Calcule a concentração relativa usando a intensidade média de cada íon repórter TMT16 e comparando as discrepâncias entre os 16 canais. Para obter uma mistura igual de cada canal, adicione o restante das amostras marcadas com TMT na mistura de acordo com a intensidade média calculada. Repita o ajuste até que todas as amostras estejam igualmente misturadas. Os dados representativos que mostram o processo de agrupamento de amostras são mostrados na Tabela 1.
      NOTA: Como os erros de pipetagem podem afetar a precisão das concentrações e a quantificação de proteínas, é importante garantir a quantidade de pooling corretamente. As discrepâncias de intensidade entre 16 amostras devem ser inferiores a 5%.
4. Dessalinização de peptídeos rotulada
   NOTA: Como os derivados de fundo na reação de marcação TMT16 (por exemplo, TMTpro-NHOH da reação de extinção de hidroxilamina e TMTpro-OH da hidroxilação de TMT) são hidrofóbicos, uma condição de lavagem extensiva é usada para amostras marcadas com TMT16 para remover efetivamente os derivados. Utiliza-se a adição de 5% de ACN no tampão de lavagem regular (0,1% de TFA) e 10x volumes de leito de tampão de lavagem.
   1. Acidificar a amostra agrupada adicionando 10% de TFA ao pH < 3.
   2. Centrifugue a amostra combinada a 21.000 x g por 10 min e coloque o sobrenadante em um novo tubo.
   3. Seque a amostra usando um concentrador de vácuo para remover o ACN.
   4. Pré-condicione um cartucho de extração em fase sólida contendo 50 mg de coluna adsorvente lavando a coluna com 2 mL de metanol a 100% seguido de 2 mL de tampão de eluição (60% ACN mais 0,1% TFA) e, por último, 2 mL de tampão de lavagem (0,1% TFA).
   5. Carregue a amostra na coluna. Ajuste a taxa de fluxo para ~ 100 μL / min para garantir a extensão total da ligação do peptídeo. Salve o fluxo.
   6. Lave a coluna três vezes com 1 mL de tampão de lavagem.
   7. Eluir peptídeos com 1 mL de tampão de eluição.
   8. Seque os peptídeos eluídos em um concentrador a vácuo e armazene os peptídeos a -80 ° C para posterior fracionamento.

4. Pré-fracionamento básico offline de pH LC

1. Preparação do sistema de fracionamento
   1. Prepare o tampão A (formato de amônio 10 mM, pH 8,0) e o tampão B (formato de amônio 10 mM, 90% ACN, pH 8,0) para um sistema LC de alto desempenho de fluxo de microlitros.
   2. Configure uma coluna de HPLC contendo partículas híbridas de etileno em ponte (tamanho de partícula de 3,5 μm, 4,6 mm × 25 cm) em um sistema LC de alto desempenho de fluxo de microlitros para fracionamento.
   3. Instale um laço de amostra de 100 μL e lave o laço com 300 μL de metanol, água e tampão A, sequencialmente.
   4. Use 100 μL de proporção 1:1:1:1 de isopropanol: metanol: acetonitrila: água para lavar a coluna. Em seguida, equilibre ainda mais a coluna por 0,5 h em 95% do tampão A.
2. Preparação da amostra
   1. Dissolva a amostra TMT16 agrupada e dessalinizada em 70 μL de tampão A. Confirme se o pH da amostra é ~ 8,0. Se ainda estiver ácido, ajuste o pH para 8,0 usando hidróxido de amônio a 28% (NH₄OH).
      NOTA: Para evitar sample perda, o sample volume deve ser inferior a 70% do volume do loop.
   2. Centrifugue a amostra a 21.000 x g por 10 min para remover os precipitados.
3. Fracionamento e concatenação
   NOTA: Antes do fracionamento real da amostra, um experimento piloto é altamente recomendado para garantir que o sistema LC esteja em boas condições. Isso pode ser realizado com uma pequena quantidade de sua amostra real (~ 5%) ou com uma mistura de peptídeos não marcada com TMT.
   1. Injete a amostra e fracione-a pelo seguinte gradiente: 5% de tampão B por 10 min, 5-15% de tampão B por 2 min, 15-45% de tampão B por 148 min e 45-95% de tampão B por 5 min. Use uma taxa de fluxo de 0,4 mL / min.
   2. Defina o coletor de frações para coletar frações a cada 1 min e concatene 160 frações de volta para 40 frações em 4 ciclos.
      NOTA: A concatenação é realizada combinando frações LC iniciais, médias e tardias eluídas do mesmo tempo internos em uma fração concatenada. As frações concatenadas têm pouca sobreposição na primeira dimensão da LC, aumentando assim o uso eficiente da janela de eluição na segunda dimensão da LC. Além disso, por meio de várias rodadas de concatenação, os peptídeos podem ser distribuídos uniformemente por todas as frações concatenadas. Foi demonstrado que essa abordagem aumenta a cobertura do proteoma em comparação com a análise de frações individuais^35,36.
   3. Secar todas as fracções concatenadas num concentrador de vácuo e armazenar as amostras secas a -80 °C para posterior análise LC-MS/MS.

5. Análise ácida de pH RPLC-MS/MS

1. Preparação do sistema de pH RPLC-MS/MS ácido
   1. Embale uma coluna vazia (75 μm ID com um orifício de ponta de 15 μm) com resina C18 de 1,9 μm com 10-15 cm de comprimento.
   2. Aqueça a coluna a 65 °C usando um aquecedor de portfólio borboleta para reduzir a contrapressão.
   3. Lave bem a coluna com tampão B a 95% (3% de dimetilsulfóxido, 0,2% de ácido fórmico e 67% de ACN). Em seguida, equilibre totalmente a coluna em tampão A a 95% (3% de dimetilsulfóxido e 0,2% de ácido fórmico).
   4. Verifique o desempenho do sistema LC-MS/MS executando 100 ng de peptídeos cerebrais de ratos ou peptídeos BSA antes de analisar as amostras experimentais.
2. Análise LC-MS/MS de frações concatenadas
   1. Reconstitua os peptídeos secos das frações básicas de pH em 5% FA e centrifugue a 21.000 × g por 5 min. Transfira o sobrenadante de cada amostra para um frasco para injetáveis de HPLC.
   2. Carregar peptídeos de ~ 1 μg de cada fração na coluna. Os peptídeos são eluídos a uma taxa de fluxo de 0,25 μL / min com um gradiente de 60 min de 18 a 45% do tampão B.
      NOTA: Para obter números de identificação altos, execute uma fração e ajuste o gradiente para as frações restantes com base na primeira execução. O melhor gradiente deve ter peptídeos uniformemente distribuídos em todo o gradiente ( Figura 4A ).
   3. Opere o espectrômetro de massa com os seguintes parâmetros para a análise de amostras marcadas com TMT16: varreduras MS1 (faixa completa de varredura MS: 450-1600 m/z; Resolução do Orbitrap: 60.000; alvo de controle automático de ganho: 1 x 10⁶; tempo máximo de íon: 50 ms) e 20 varreduras MS2 dependentes de dados (resolução Orbitrap: 60.000; Alvo AGC: 1 x 10⁵; tempo máximo de íon: 110 ms; Energia de colisão normalizada HCD: 32%; janela de isolamento: 1,0 m/z; deslocamento de isolamento: 0,2 m/z; exclusão dinâmica: 10 s).
      NOTA: Os parâmetros usados aqui são otimizados em um tipo de espectrômetro de massa (consulte a Tabela de Materiais). Para diferentes instrumentos MS, os usuários devem ajustar os parâmetros do instrumento para obter resultados de alta qualidade. Uma configuração é monitorar a energia de colisão normalizada do HCD, pois a energia ideal pode variar entre os instrumentos, bem como entre TMT11 e TMT16.

6. Processamento de dados

NOTA: A análise de dados foi realizada usando um pacote de software JUMP 37,38,39, incluindo um mecanismo de pesquisa de banco de dados híbrido (baseado em padrões e tags), software de filtragem que controla a taxa de descoberta falsa (FDR) de peptídeos/proteínas identificados e software de quantificação para conjuntos de dados TMT. Dependendo da situação do usuário, a análise de dados pode ser feita usando outros programas comerciais ou disponíveis gratuitamente.

1. Pesquisa de banco de dados
   1. Converta os arquivos .raw do instrumento MS em arquivos .mzXML e pesquise espectros MS2 em um banco de dados de isca-alvo não redundante⁴⁰ gerado a partir de sequências de proteínas humanas UniProt (ou outro banco de dados específico de espécie apropriado) para calcular o FDR de proteínas identificadas.
      NOTA: Gere o banco de dados não redundante combinando sequências de proteínas dos bancos de dados Swiss-Prot e TrEMBL. Também é possível adicionar sequências de proteínas personalizadas não contidas nesses bancos de dados de referência, incluindo proteínas clivadas por protease, proteínas com polimorfismos de nucleotídeo único e contaminantes comuns.
   2. Realize pesquisas usando os seguintes parâmetros. Tolerância de massa para precursor: 10 ppm; tolerância de massa para íons do produto: 15 ppm; clivagens máximas perdidas: 2; locais de modificação máxima: 3; modificações estáticas: 304.20715 Da para etiquetas TMT16 em resíduos de Lys e terminais N, 57.02146 Da para carbamidometilação em resíduos de Cys; modificação dinâmica: 15.99492 Da para oxidação em Met.
2. Filtrar os resultados da pesquisa
   1. Filtre as correspondências de espectro de peptídeos (PSMs) resultantes por comprimento de peptídeo (>6 aminoácidos), precisão de massa do íon precursor e pontuações de correspondência baseadas em JUMP (Jscore e ΔJn). Os peptídeos são então agrupados por comprimento do peptídeo, extremidades trípticas, modificações, locais de clivagem perdidos e estado de carga.
   2. Filtre ainda mais os dados com as pontuações correspondentes para obter um FDR abaixo de 1% no nível de proteína (análise de proteoma total) ou peptídeo (análise de fosfoproteoma).
      NOTA: Se os peptídeos/proteínas de controle positivo estiverem faltando nas etapas de filtragem, o FDR pode ser aumentado para um nível razoável para que esses peptídeos/proteínas possam ser resgatados.
   3. Para os peptídeos compartilhados por mais de um membro de uma família de proteínas, agrupe os membros correspondentes em um grupo.
      NOTA: Com a regra da parcimônia, o grupo é representado pela proteína homóloga com o maior número de peptídeos compartilhados e outras proteínas combinadas por peptídeos únicos.
3. Quantificação de proteínas
   1. Quantifique proteínas usando um programa integrado de um pacote de software estatístico para resumir as intensidades de íons do repórter TMT em todos os PSMs correspondentes.
   2. Extraia as intensidades de íons repórter TMT de cada PSM aceito e corrija as intensidades brutas de acordo com a distribuição isotópica de cada reagente de marcação (por exemplo, TMT16-126 gera 92,6%, 7,2% e 0,2% de íons 126, 127C e 128C m/z, respectivamente) e filtre PSMs de baixa intensidade e/ou altamente ruidosos com base em limites definidos pelo usuário. Normalize os dados de quantificação usando intensidades médias aparadas (ou medianas) de amostras para corrigir o viés de carregamento.
   3. Para cada proteína identificada, calcule as intensidades centradas na média entre as amostras (ou seja, intensidades relativas) de PSMs correspondentes e resuma as intensidades relativas dos PSMs tomando a média da amostra. Converta os sinais relativos em absolutos multiplicando a intensidade média geral dos três PSMs correspondentes mais abundantes.
   4. Corrigir a interferência de quantificação usando uma abordagem de correção de íons y1 relatada anteriormente³⁷ , que pressupõe que a intensidade do íon y1 está correlacionada com a intensidade do íon repórter. Ao estimar a relação linear entre y1 e as intensidades de íons repórteres a partir de varreduras limpas, o nível de interferência da intensidade do íon y1 contaminado em varreduras ruidosas é derivado e corrigido.
      NOTA: Para peptídeos trípticos marcados com TMT, os resíduos K-TMT e R são dois íons y1 representativos (376,27574 Da e 175,11895 Da, respectivamente) em um espectro MS2. Se apenas um íon y1 for detectado e for consistente com o peptídeo identificado, o MS2 será considerado uma varredura limpa. Se ambos os íons y1 forem detectados, o MS2 será considerado uma varredura ruidosa.
   5. Transfira os valores de quantificação de proteínas para uma planilha para análise posterior. Use métodos de análise de dados não supervisionados, como PCA ou análise de agrupamento, para explorar a distribuição de amostras. Para identificar proteínas expressas diferencialmente, use métodos estatísticos como teste t e análise de variância (ANOVA).

7. Validação de dados MS

NOTA: Antes de realizar experimentos biológicos demorados, use pelo menos um método de validação para avaliar a qualidade dos dados de MS.

1. Inspecione manualmente os espectros MS/MS de proteínas de interesse para validar a sequência peptídica e as intensidades de íons repórter TMT.
2. Use abordagens baseadas em anticorpos (por exemplo, western blotting ou análise imuno-histoquímica) para verificar as alterações nos níveis de proteína. Para confirmar a presença de peptídeos nativos, use peptídeos sintéticos como padrões internos. Os espectros MS/MS dos peptídeos e o tempo de retenção durante LC-MS/MS devem ser idênticos nas mesmas condições.
3. Use uma abordagem de EM direcionada para verificar as alterações proteicas.

Resultados

O protocolo para o TMT16 recém-desenvolvido, incluindo reação de marcação, dessalinização e condições de LC-MS, foi sistematicamente otimizado⁴¹. Além disso, comparamos diretamente os métodos 11-plex e 16-plex usando-os para analisar as mesmas amostras de DA humana⁴¹. Após a otimização dos parâmetros-chave para TMT16, os métodos TMT11 e TMT16 produzem cobertura, identificação e quantificação de proteoma semelhantes > 100.000 peptídeos em > 10.000 proteínas humanas.

Discussão

Um protocolo otimizado para perfil de proteoma profundo baseado em TMT16 foi implementado com sucesso em publicações anteriores 12,13,41. Com este protocolo atual, mais de 10.000 proteínas únicas de até 16 amostras diferentes podem ser quantificadas rotineiramente em um único experimento com alta precisão.

Para obter resultados de alta qualidade, é importante prestar ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% Criterion TGX Gel de Proteína Midi Pré-moldado	Biorad	5671035
10X TGS (Tris/Glicina/SDS) Buffer	BioRad	161-0772
4-ndash; 20% Criterion TGX Precast Midi Protein Gel	Biorad	5671095
50% Hidroxilamina	Thermo Scientific	90115
6 X SDS Tampão de Carregamento de Amostras	Boston Bioproducts Inc	BP-111R
Formato de Amônio (NH4COOH)	Sigma	70221-25G-F
Hidróxido de Amônio, 28%	Sigma	338818-100ml
Bullet Liquidificador	Next Advance	BB24-AU
Aquecedor de Portfólio Borboleta	Phoenix S& Aparelho de T	PST-BPH-20
C18 Ziptips	Harvard	74-4607	usado para dessalinizar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545
DMSO	Sigma	41648
fórmico	Sigma	94318
	Gilson	FC203B
Gel Code Blue Stain Reagent	Thermo	24592
grânulos de vidro	Avanço seguinte	GB05
HEPES	Sigma	H3375
HPLC grau Acetonitrile	Burdick & Jackson	AH015-4
HPLC Grau Água	Burdick & Jackson	AH365-4
Iodoacetamida (IAA)	Sigma	I6125
Lys-C	Wako	125-05061
Espectrômetro de massa	Thermo Scientific	Q Exactive HF
MassPrep BSA Digestão Padrão		Águas 186002329
Metanol	Burdick & Jackson	AH230-4
Nanoflow UPLC	Thermo Scientific	Ultimate 3000
Pierce BCA Kit de ensaio de proteína	Thermo Scientific	23225
ReproSil-Pur C18 resina, 1.9um	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.0003
Self-Pack Colunas	Novo objetivo	PF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mg	Águas	WAT054960	usado para desoxicolato
sódio	Sigma	30970
Speedvac	Thermo Scientific	SPD11V
TMTpro 16plex Conjunto de reagentes de etiqueta	Thermo Scientific	A44520
Ácido trifluoroacético (TFA)	Applied Biosystems	400003
Tripsina	Promega	V511C
Coluna de rotação Ultra-micro, aparelho C18	Harvard	74-7206	Usado para dessalinizar
Coluna C18 de uréia	Sigma	U5378
Xbridge Colunas	água	186003943	usadas para pH básico LC