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Perfil de alto rendimento e proteoma profundo por marcação de etiquetas de massa em tandem de 16 plex acoplada a cromatografia bidimensional e espectrometria de massa

DOI:

10.3791/61684

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August 18th, 2020

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1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

In This Article

Summary

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Apresentado aqui é um protocolo otimizado de alto rendimento desenvolvido com reagentes de marcação de massa em tandem de 16 plex, permitindo o perfil quantitativo de proteoma de amostras biológicas. O extenso fracionamento básico de pH e a LC-MS/MS de alta resolução reduzem a compressão da razão e fornecem cobertura profunda do proteoma.

Abstract

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A marcação isobárica de massa em tandem (TMT) é amplamente utilizada em proteômica devido à sua alta capacidade de multiplexação e cobertura profunda do proteoma. Recentemente, foi introduzido um método TMT expandido de 16 plex, o que aumenta ainda mais o rendimento dos estudos proteômicos. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo otimizado para perfil de proteoma profundo baseado em TMT de 16 plex, incluindo preparação de amostras de proteínas, digestão enzimática, reação de marcação de TMT, fracionamento bidimensional de cromatografia líquida de fase reversa (LC / LC), espectrometria de massa em tandem (MS / MS) e processamento de dados computacionais. As etapas cruciais de controle de qualidade e melhorias no processo específico para a análise TMT de 16 plex são destacadas. Este processo multiplexado oferece uma ferramenta poderosa para traçar o perfil de uma variedade de amostras complexas, como células, tecidos e amostras clínicas. Mais de 10.000 proteínas e modificações pós-traducionais, como fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação em amostras biológicas altamente complexas de até 16 amostras diferentes, podem ser quantificadas em um único experimento, fornecendo uma ferramenta potente para pesquisa básica e clínica.

Introduction

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Os rápidos desenvolvimentos na tecnologia de espectrometria de massa permitiram alcançar alta sensibilidade e cobertura profunda do proteoma em aplicações proteômicas 1,2. Apesar desses desenvolvimentos, a multiplexação de amostras continua sendo o gargalo para os pesquisadores que lidam com a análise de uma grande coorte de amostras.

As técnicas de marcação isobárica multiplexada são amplamente utilizadas para quantificação relativa de grandes lotes de amostrasem todo o proteoma 3,4,5,6.

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Protocol

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Os tecidos humanos para o estudo foram obtidos com aprovações do Programa de Doação de Cérebro e Corpo do Banner Sun Health Research Institute.

1. Extração de proteínas do tecido e controle de qualidade

NOTA: Para reduzir o impacto da colheita de amostras no proteoma, é crucial coletar amostras em tempo mínimo em baixa temperatura, se possível31. Isso é especialmente importante ao analisar modificações pós-traducionais, pois elas são tipicamente lábeis, por exemplo, alguns eventos de fosforilação têm apenas alguns segundos de meia-vida32,33....

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Results

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O protocolo para o TMT16 recém-desenvolvido, incluindo reação de marcação, dessalinização e condições de LC-MS, foi sistematicamente otimizado41. Além disso, comparamos diretamente os métodos 11-plex e 16-plex usando-os para analisar as mesmas amostras de DA humana41. Após a otimização dos parâmetros-chave para TMT16, os métodos TMT11 e TMT16 produzem cobertura, identificação e quantificação de proteoma semelhantes > 100.000 peptídeos em > 10.000 proteínas humanas.

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Discussion

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Um protocolo otimizado para perfil de proteoma profundo baseado em TMT16 foi implementado com sucesso em publicações anteriores 12,13,41. Com este protocolo atual, mais de 10.000 proteínas únicas de até 16 amostras diferentes podem ser quantificadas rotineiramente em um único experimento com alta precisão.

Para obter resultados de alta qualidade, é importante prestar .......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 e U54NS110435) e ALSAC (American Lebanese Syrian Associated Charities). A análise de EM foi realizada no Centro de Proteômica e Metabolômica do St. Jude Children's Research Hospital, que é parcialmente apoiado pelo NIH Cancer Center Support Grant (P30CA021765). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% Criterion TGX Gel de Proteína Midi Pré-moldadoBiorad5671035
10X TGS (Tris/Glicina/SDS) BufferBioRad161-0772
4-ndash; 20% Criterion TGX Precast Midi Protein GelBiorad5671095
50% HidroxilaminaThermo Scientific90115
6 X SDS Tampão de Carregamento de AmostrasBoston Bioproducts IncBP-111R
Formato de Amônio (NH4COOH)Sigma70221-25G-F
Hidróxido de Amônio, 28%Sigma338818-100ml
Bullet LiquidificadorNext AdvanceBB24-AU
Aquecedor de Portfólio BorboletaPhoenix S& Aparelho de TPST-BPH-20
C18 ZiptipsHarvard74-4607usado para dessalinizar
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
fórmicoSigma94318
GilsonFC203B
Gel Code Blue Stain ReagentThermo24592
grânulos de vidroAvanço seguinteGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC grau AcetonitrileBurdick & JacksonAH015-4
HPLC Grau ÁguaBurdick & JacksonAH365-4
Iodoacetamida (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
Espectrômetro de massaThermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA Digestão PadrãoÁguas 186002329
MetanolBurdick & JacksonAH230-4
Nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA Kit de ensaio de proteínaThermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 resina, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self-Pack ColunasNovo objetivoPF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgÁguasWAT054960usado para desoxicolato
sódioSigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex Conjunto de reagentes de etiquetaThermo ScientificA44520
Ácido trifluoroacético (TFA)Applied Biosystems400003
TripsinaPromegaV511C
Coluna de rotação Ultra-micro, aparelho C18Harvard74-7206Usado para dessalinizar
Coluna C18 de uréiaSigmaU5378
Xbridge Colunaságua186003943usadas para pH básico LC
Coletor de frações de ácido de de

References

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  1. Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
  2. Bekker-Jensen, D. B., et al.

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16 plex TMT LabelingTandem Mass TagTwo dimensional ChromatographyMass SpectrometryProteome ProfilingProtein Sample PreparationEnzymatic DigestionLC LC FractionationTandem Mass SpectrometryComputational Data Processing
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