As interações neurônio-glial na neurodegeneração não são bem compreendidas devido a ferramentas e métodos inadequados. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para obter neurônios induzidos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos de células-tronco pluripotentes humanas e fornecemos exemplos dos valores desses métodos na compreensão das contribuições específicas do tipo celular na doença de Alzheimer.
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Artigo de método
Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Aviso de errata
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Resumo
Resumo
Na doença de Alzheimer (DA) e outros distúrbios neurodegenerativos, a falha oligodendroglial é uma característica patológica precoce comum, mas como ela contribui para o desenvolvimento e progressão da doença, particularmente na massa cinzenta do cérebro, permanece amplamente desconhecida. A disfunção das células da linhagem de oligodendrócitos é marcada por deficiências na mielinização e auto-renovação prejudicada das células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Esses dois defeitos são causados, pelo menos em parte, pela interrupção das interações entre neurônios e oligodendrócitos ao longo do acúmulo de patologia. Os OPCs dão origem a oligodendrócitos mielinizantes durante o desenvolvimento do SNC. No córtex cerebral maduro, as OPCs são as principais células proliferativas (compreendendo ~ 5% do total de células cerebrais) e controlam a formação de nova mielina de maneira dependente da atividade neural. Tais comunicações neurônio-oligodendrócitos são significativamente pouco estudadas, especialmente no contexto de condições neurodegenerativas, como a DA, devido à falta de ferramentas apropriadas. Nos últimos anos, nosso grupo e outros fizeram progressos significativos para melhorar os protocolos atualmente disponíveis para gerar neurônios funcionais e oligodendrócitos individualmente a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Neste manuscrito, descrevemos nossos procedimentos otimizados, incluindo o estabelecimento de um sistema de co-cultura para modelar as conexões neurônio-oligodendrócitos. Nossos resultados ilustrativos sugerem uma contribuição inesperada dos OPCs/oligodendrócitos para a amiloidose cerebral e a integridade das sinapses e destacam a utilidade dessa metodologia para a pesquisa da DA. Essa abordagem reducionista é uma ferramenta poderosa para dissecar as interações heterocelulares específicas da complexidade inerente dentro do cérebro. Espera-se que os protocolos que descrevemos aqui facilitem futuros estudos sobre defeitos oligodendrogliais na patogênese da neurodegeneração.
Introdução
As células da linhagem de oligodendrócitos – incluindo células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), oligodendrócitos mielinizantes e tipos de transição entre eles – constituem um grupo importante de células cerebrais humanas1 que participam ativamente de muitas funções críticas para o bom funcionamento e manutenção do nosso sistema nervoso central ao longo do desenvolvimento neural e envelhecimento 2,3,4 . Enquanto os oligodendrócitos são bem conhecidos por produzir mielina para facilitar a transmissão da atividade neuronal e apoiar a saúde axonal ....
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Protocolo
1. Indução de neurônios humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas
- Preparação de Lentivirus (~5 dias, protocolo detalhado conforme descrito anteriormente16)
- Placa ~1 milhão de células HEK293T cada frasco T75, para tê-las ~40% confluentes ao realizar a transfecção. Transfecte-os com plasmídeos que expressam Ngn2 induzível por tetraciclina e gene resistente à puromicina (PuroR; sob o mesmo controle promotor de TetO), rtTA e os três plasmídeos auxiliares pRSV-REV, pMDLg/pRRE e VSV-G (12 μg de DNA vetorial lentiviral e 6 μg de cada um dos DNA plasmídeos auxiliares). Preparar pelo menos três frascos por preparação de l....
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Resultados
Geração direta de neurônios induzidos por humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas
É muito importante que as células-tronco pluripotentes humanas iniciantes exibam um alto grau de pluripotência para a geração bem-sucedida de iNs ou iOPCs/iOLs. Portanto, as células devem ser coradas para marcadores específicos, como Oct4 e SOX2, antes de iniciar qualquer um dos protocolos de indução descritos no presente manuscrito (Figura 1A). Células H1 humanas foram util.......
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Discussão
Além do suporte físico e metabólico para estabilizar as estruturas das sinapses e facilitar a condução do sinal salino por mielinização, as células da linhagem de oligodendrócitos podem moldar o padrão de atividade neuronal por meio de conversas cruzadas rápidas e dinâmicas com neurônios 5,6,7. Enquanto na patologia da DA as respostas oligodendrogliais foram inicialmente consideradas meramente secundárias à inflamação e estresse.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R00 AG054616 para Y.A.H. e T32 GM136566 para K.C.), Stanford University School of Medicine e uma Siebel Fellowship (concedida a S.C.). Y.A.H. é professor translacional da GFL do Centro de Neurociência Translacional do Brown Institute for Translational Sciences.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 suplemento | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxiciclina | MilliporeSigma | D3072 | |
| Soro Fetal Bovino | ScienCell | 10 | |
| H1 células ES humanas | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR mais | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| Suplemento de N2 | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A meio | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Aminoácidos não essenciais | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R& D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromicina | ThermoFisher | A1113803 | |
| Inibidor de ROCK Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Progenitor Neural Mídia de Congelamento | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Kit de Indução Neural | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodotironina | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: OPCs derivados de iPSC humano | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-NG2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
Referências
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 6....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.
The fourth paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F).
