O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.
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Artigo de método
Análise de repertório imune do receptor de células T e B usando sequenciamento de última geração
Neste artigo
Resumo
Resumo
A memória imunológica, a marca registrada da imunidade adaptativa, é orquestrada por linfócitos T e B. Em circulação e diferentes órgãos, há bilhões de clones de células T e B únicos, e cada um pode ligar um antígeno específico, levando à proliferação, diferenciação e/ou secreção de citocinas. A grande heterogeneidade nas células T e B é gerada pela recombinação aleatória de diferentes segmentos genéticos. As tecnologias de sequenciamento de última geração (NGS), desenvolvidas na última década, permitem uma visão aprofundada sem precedentes do repertório imunológico do receptor de células T e B. Estudos em várias condições inflamatórias, imunodeficiências, infecções e malignidades demonstraram mudanças acentuadas na clonalidade, uso genético e propriedades biofísicas do repertório imunológico, fornecendo importantes insights sobre o papel das respostas imunes adaptativas em diferentes distúrbios.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para NGS de repertório imunológico de células T e B a partir de sangue e tecido. Apresentamos um pipeline a partir do isolamento do DNA através da preparação da biblioteca, sequenciamento no sequenciador NGS e terminando com análises básicas. Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido, podendo assim identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes doenças. Esta técnica está entrando lentamente na prática clínica e tem potencial para identificação de novos biomarcadores, estratificação de risco e medicina de precisão.
Introdução
O sistema imunológico adaptativo, composto por linfócitos T e B, utiliza memória imunológica para reconhecer um antígeno previamente encontrado e iniciar uma resposta rápida. Os linfócitos são gerados na medula óssea e maduros nas células timo (células T) ou medula óssea (células B). Tanto o receptor de células T (TCR) quanto o receptor de células B (BCR) exibem configurações únicas que permitem o reconhecimento de antígenos específicos. Na homeostase, as células T e B circulam constantemente e pesquisam os trilhões de peptídeos diferentes apresentados em células que apresentam antígenos. A ligadura TCR ou BCR de um antígeno específico com alta afinidade, juntamente c....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Sheba Medical Center, e o consentimento por escrito informado foi obtido de todos os sujeitos participantes.
1. Isolamento e quantificação do DNA
- Digestão e lise celular de biópsias intestinais
- Recuperar biópsias intestinais, coletadas recentemente ou armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Se usar biópsias congeladas, descongele no gelo.
- Adicione 600 μL de solução de lise nuclei a um tubo de microcentrífugo estéril de 1,7 mL, refrigerado no gelo.
- Coloque a biópsia em um tubo de microcentrifusagem com solução de lise e incubar a 65 °C por 15-....
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Resultados
Aqui, descrevemos um método para isolamento do DNA do tecido intestinal e sangue, preparação de bibliotecas para NGS, e etapas básicas de um sequenciamento para sequenciamento do repertório imunológico. A execução gerará arquivos fastq, que podem ser convertidos em arquivos fasta para uso na plataforma internacional IMGT)/HighV-QUEST. Este HTS realiza e gerencia muitas análises de dezenas de milhares de sequências TCRβ e IGH reorganizadas, no nível nucleotídeo15. O IMGT/HighV-QUEST permite a análi.......
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Discussão
Alterações na abundância e função de linfócitos B e T são frequentemente encontradas em diferentes malignidades18, distúrbios inflamatórios crônicos (por exemplo, colite ulcerativa e artrite reumatoide)10,19, e em várias imunodeficiências17,20. O método atual utiliza o NGS para facilitar uma visão aprofundada dos repertórios TCR e BCR, permitindo a detecção de alterações sutis na c.......
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Divulgações
Todos os autores não têm nada a revelar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL | Axygen | 8187631104051 | |
| Tubos de centrífuga de 15 mL | Greiner | 188261 | |
| Etanol absoluto | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bloco de calor | Bioer | Não aplicável | |
| Tampão de amostra D1000 de alta sensibilidade | Agilent | 5067-5603 | para Tapestation |
| D1000 de alta sensibilidade ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | Para Tapestation. Tubos vendidos separadamente |
| Kit de ensaio Lymphotrack | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Cada um inclui 24 índices |
| Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos) | Illumina | MS-102-2003 | Inclui tipo de célula de fluxo padrão e todos os reagentes necessários |
| Sequenciador MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Tiras de PCR | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorômetro | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Kit | de Ensaio Thermo Fisher | Q32854 | Inclui tampão, corante, padrões e tubos especializados |
| Shaker | Biosan | Não aplicável | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra água pura | Bio-lab | 7501 | |
| Kit de isolamento de DNA Wizard | Promega | A1120 | Inclui solução de lise celular, solução de lise de núcleos e tampão de precipitação de proteína |
Referências
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J.....
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Reimpressões e permissões
