Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة طلاء لتقييد نمو الخلايا البطانية إلى منطقة محددة من لوحة من 6 آبار لتطبيق إجهاد القص باستخدام نموذج شاكر المداري.
Abstract
الإجهاد القص المفروضة على جدار الشرايين من تدفق الدم يؤثر على مورفولوجيا الخلايا البطانية ووظيفة. وقد افترض تدني الحجم والتذبذب وضغوط القص متعددة الاتجاهات لتحفيز النمط الظاهري المؤيد للشرايين في الخلايا البطانية، في حين يعتقد أن الحجم الكبير والقص أحادي الاتجاه أو أحادي المحور يعززان التوازن المنزلي البطاني. تتطلب هذه الفرضيات المزيد من التحقيق ، ولكن التقنيات التقليدية في المختبر لها قيود ، وهي سيئة بشكل خاص في فرض ضغوط القص متعددة الاتجاهات على الخلايا.
وتتمثل إحدى الطرق التي تكتسب استخداما متزايدا في استزراع الخلايا البطانية في لوحات قياسية متعددة الآبار على منصة شاكر مداري؛ في هذه الطريقة البسيطة والمنخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية والمزمنة ، تنتج الوسيطة الدوارة أنماطا مختلفة وحجم القص ، بما في ذلك القص متعدد الاتجاهات ، في أجزاء مختلفة من البئر. ومع ذلك ، فإن لها قيدا كبيرا: فالخلايا في منطقة واحدة ، المعرضة لنوع واحد من التدفق ، قد تطلق وسطاء في الوسط تؤثر على الخلايا في أجزاء أخرى من البئر ، معرضة لتدفقات مختلفة ، وبالتالي تشوه العلاقة الظاهرة بين التدفق والنمط الظاهري.
هنا نقدم تعديلا سهلا وبأسعار معقولة للطريقة التي تسمح للخلايا أن تتعرض فقط لخصائص إجهاد القص المحددة. يقتصر بذر الخلايا على منطقة محددة من البئر عن طريق طلاء المنطقة ذات الاهتمام مع فيبروكتين ، يليه التخميل باستخدام محلول التخميل. في وقت لاحق ، يمكن تدوير اللوحات على شاكر ، مما يؤدي إلى تعرض الخلايا لمحات القص محددة جيدا مثل القص متعدد الاتجاهات منخفضة الحجم أو القص أحادي الاتجاه عالية الحجم ، اعتمادا على موقعها. كما كان الحال من قبل ، فإن استخدام أدوات بلاستيكية قياسية لثقافة الخلايا يسمح بإجراء مزيد من التحليل المباشر للخلايا. وقد سمح التعديل بالفعل بعرض الوسطاء القابلين للذوبان ، الذين تم إطلاقهم من الهيليوم تحت خصائص إجهاد القص المحددة ، التي تؤثر على الخلايا الموجودة في مكان آخر في البئر.
Introduction
استجابات خلايا الأوعية الدموية لبيئتهم الميكانيكية مهمة في الوظيفة الطبيعية للأوعية الدموية وفي تطور المرض1. كان علم الأحياء الميكانيكية للخلايا البطانية (ECs) التي تبطن السطح الداخلي لجميع الأوعية الدموية محورا خاصا للأبحاث الميكانيكية لأن ECs تعاني مباشرة من إجهاد القص الناتج عن تدفق الدم فوقها. مختلف التغيرات phenotypic مثل الاستجابات الالتهابية، وتغير صلابة ومورفولوجيا، والإفراج عن المواد النشطة vasoactive، وتوطين والتعبير عن البروتينات التقاطعية تعتمد على التعرض EC لإجهاد القص2،3،4. قد خصائص البطانية التي تعتمد على القص أيضا حساب لتطور غير مكتمل من الأمراض مثل تصلب الشرايين5،6،7.
ومن المفيد دراسة تأثير القص على المركبات الهيدروفلورية في الثقافة، حيث يمكن السيطرة على الضغوط، ويمكن عزل المركبات الهيدروفلورية عن أنواع الخلايا الأخرى. تستخدم عادة في الأجهزة المختبرية لتطبيق الإجهاد القص إلى ECs تشمل غرفة تدفق لوحة موازية ومخروط ولوحة viscometer، ولكن فقط أحادية النبض ثابت، والتذبذب، وتدفق pulsatile يمكن تطبيقها8،9. على الرغم من أن غرف التدفق المعدلة مع هندسات مدببة أو متفرعة ورقائق microfluidic التي تحاكي الهندسة الأنماطية قد تم تطويرها ، إلا أن إنتاجها المنخفض ومدة الثقافة القصيرة نسبيا التي من الممكن أن تشكل تحديا10، 11.
وتكتسب طريقة شاكر المداري (أو البئر الدوار) لدراسة التنظير البطاني، الذي تزرع فيه الخلايا في أدوات بلاستيكية قياسية لثقافة الخلايا توضع على منصة شاكر مداري، اهتماما متزايدا لأنها قادرة على فرض أنماط إجهاد معقدةمتغيرة مكانيا على المركبات الإلكترونية ذات الإنتاجية العالية (انظر الاستعراض الذي أجراه Warboys وآخرون. وقد استخدمت محاكاة ديناميات السوائل الحاسوبية (CFD) لتوصيف الاختلاف المكاني والزمني لإجهاد القص في بئر دوارة. الحركة الدوامية للوسط الثقافي الناجم عن الحركة المدارية لمنصة شاكر التي يتم وضع اللوحة عليها تؤدي إلى تدفق متعدد الاتجاهات منخفض الحجم (LMMF ، أو تدفق مفترض مؤيد للذرية) في المركز وتدفق أحادي المحور عالي الحجم (HMUF ، أو تدفق غير مركزي مفترض) على حافة آبار لوحة من 6 آبار. على سبيل المثال، ضغط القص الجداري متوسط الوقت (TAWSS) هو حوالي 0.3 باسكال في المركز و 0.7 باسكال على حافة لوحة 6-جيدا تدور في 150 دورة في الدقيقة مع دائرة نصف قطرها 5 ملم المداري13. تتطلب هذه الطريقة فقط الأواني البلاستيكية المتاحة تجاريا وشاكر المداري نفسه.
ومع ذلك ، هناك عيب في الطريقة (وإلى طرق أخرى لفرض التدفقات في المختبر): تطلق ECs الوسطاء القابلين للذوبان والجسيمات الدقيقة بطريقة تعتمد على القص14و15و16 وهذا السرومي قد يؤثر على ECs في مناطق البئر الأخرى غير تلك التي تم إطلاقها فيها ، بسبب الاختلاط في الوسط الدوار. قد يخفي هذا الآثار الفعلية للإجهاد القص على النمط الظاهري EC. على سبيل المثال، تكهن غيم وآخرون بأن هذا يفسر التأثير المطابق على ما يبدو لملامح القص المختلفة على النقل عبر الخلايا للجسيمات الكبيرة17.
هنا نحن نصف طريقة لتعزيز الالتصاق الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVEC) في مناطق محددة من لوحة 6-جيدا باستخدام طلاء فيبروكتين أثناء استخدام Pluronic F-127 لتمرير السطح ومنع النمو في أماكن أخرى. الأسلوب يحل القيد المذكور أعلاه لأنه ، عن طريق تقسيم نمو الخلايا ، ECs تجربة نوع واحد فقط من ملف القص ، ولا تتأثر الإفرازات من ECs تتعرض لمحات أخرى في مكان آخر في البئر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع الأجهزة وإعداد الكواشف
- تصنيع وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ
- تصنيع وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ من الصف 316 الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام آلة الطحن CNC وفقا للرسم الهندسي المقدمة(الشكل 1).
- الطباعة ثلاثية الأبعاد لقالب بوليديمثيلسيلوكسيان (PDMS)
- إعداد تصميم بمساعدة الكمبيوتر 3D (كندي) نموذج من قالب PDMS باستخدام SolidWorks وفقا للرسم الهندسي المقدمة(الشكل 2).
- تصدير طراز CAD إلى ملف STL واستيراد ملف STL إلى Cura 2.6.2.
- شريحة النموذج إلى طبقات مع سرعة الطباعة من 50 ملم / ثانية وكثافة التعبئة من 60٪.
- تصدير الملف كرمز G وتحميله إلى طابعةUltimaker 2 3D للطباعة. استخدم حمض البوليلاكتيك (PLA) كمادة الطباعة.
- صب حلقة PDMS
- مزيج قاعدة PDMS وعامل علاج (سواء من مجموعة elastomer السيليكون) مع نسبة 90.9٪ قاعدة و 9.1٪ عامل علاج.
- صب ما يقرب من 2.6 مل من الحل مختلطة جيدا في قالب المطبوعة 3D.
- إزالة فقاعات في فراغ غرفة إزالة الغاز.
- علاج لمدة 1 ساعة في فرن 80 درجة مئوية.
- السماح للحلقة PDMS لتبرد لدرجة حرارة الغرفة، ثم إزالة حلقة PDMS الشفاء بعناية من القالب. الرسم الهندسي لحلقة PDMS يظهر في الشكل 3.
- إعداد 1٪ Pluronic F-127
- تزن 5 غرام من Pluronic F-127، صب في زجاجة، ثم إضافة 100 مل من الماء العقيم في زجاجة. وهذا يعطي 5٪ Pluronic F-127 الحل.
- تأكد من أن جميع مسحوق Pluronic F-127 مغمور في الماء ، وإغلاق الغطاء وautclave باستخدام برنامج دورة التعقيم السائل.
- بعد الأوتوكلاف، دع الحل يبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- إضافة 10 مل من 5٪ Pluronic F-127 حل إلى 40 مل من المياه العقيمة autoclaved لجعل 1٪ Pluronic F-127 الحل. تنفيذ التخفيف في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) غطاء محرك السيارة.
- تخزين كل من 1٪ و 5٪ Pluronic F-127 في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)
- أضف 800 مل من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) إلى كوب زجاجي وسخنيه إلى 60 درجة مئوية أثناء التحريك (استمر في التحريك من الخطوة 1.5.1 إلى 1.5.5).
- وزن 40 غرام من مسحوق PFA وإضافته إلى حل برنامج تلفزيوني دافئ.
تنبيه: PFA خطر، قم بتنفيذ الخطوات من 1.5.2 إلى 1.5.6 في غطاء الدخان. - أضف هيدروكسيد الصوديوم 1 M (NaOH) ببطء إلى محلول PFA حتى تصبح الحلول واضحة.
- ضبط درجة الحموضة من محلول PFA إلى حوالي 7.4 مع 1 M من حمض الهيدروكلوريك (HCl).
- أعلى حل ل 1 L مع برنامج تلفزيوني 1X. وهذا يعطي 1 لتر من 4٪ PFA.
- تصفية الحل PFA مع مرشحات 0.2 ميكرومتر لإزالة أي الجسيمات، aliquot وتجميد في الفريزر -20 درجة مئوية.
- إعداد 0.1٪ تريتون-X
- إضافة 50 ميكرولتر من تريتون X نقية إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني لجعل 0.1٪ تريتون-X الحل.
- إعداد 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)
- تزن 0.5 غرام من BSA، صب في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، ومن ثم إضافة 50 مل من برنامج تلفزيوني في الأنبوب.
- السماح لها لفة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على الأسطوانة لتذوب.
- تخزين 1٪ BSA في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. طلاء لوحة من 6-جيدا
- وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ الأوتوكلاف، حلقة PDMS، وملاقط قبل الاستخدام. إجراء جميع الإجراءات اللاحقة في غطاء محرك السيارة BSC ومراقبة التقنيات العقيمة لضمان العقم.
- ضع حلقة PDMS في 6-well باستخدام ملاقط. استخدم الحافة الخارجية لحلقة PDMS لمحاذاة حلقة PDMS بشكل متحد المركز مع البئر.
ملاحظة: يجب استخدام الصفائح غير النسيجية فقط المعالجة بشكل جيد. - ضع وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ على رأس حلقة PDMS باستخدام ملاقط.
- إدراج نصائح من كماشة حلقة الاحتفاظ الداخلية في ثقوب قبضة من حلقة الاحتفاظ، والضغط على حامل للحد من قطر حلقة الاحتفاظ. تناسبها في 6-جيدا، اضغط عليه بقوة على وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ والإفراج عن كماشة لتأمين حلقة PDMS في البئر.
- إضافة 1 مل من 5 ميكروغرام / مل فيبروكتين في وسط أو حافة البئر (اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام) من خلال فتح حلقة PDMS والفولاذ المقاوم للصدأ وحدة.
- دوامة لوحة لضمان أن حل فيبروكتين يغطي جميع المنطقة ذات الاهتمام.
- حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحت 95٪ الهواء / 5٪ CO2.
- إزالة محلول فيبروكتين من البئر ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني تماما من البئر.
- إزالة خاتم الاحتفاظ، وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ، وحلقة PDMS من البئر.
- إضافة 1.5 مل من 1٪ Pluronic F-127 في مركز أو حافة البئر (سطح غير المصقول) واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لتمرير السطح غير المصقول.
- إزالة محلول Pluronic F-127 من البئر وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- استخدام المغلفة جيدا على الفور أو تخزينه في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين مع طبقة من برنامج تلفزيوني في البئر المغلفة.
3. البذر من HUVECs
- استخدم HUVECs أسفل المقطع 5 في التجربة.
- إزالة كل ثقافة المتوسطة وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 3 مل من 0.05٪ تريبسين واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 °C في حاضنة مرطبة تحت 95٪ الهواء / 5٪ CO2. اضغط برفق على القارورة لطرد الخلايا.
ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام HUVECs وتركيز التريبسين ووقت الحضانة قد تكون مختلفة لنوع آخر من ECs. - نقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتحييد التريبسين باستخدام 6 مل من الثقافة المتوسطة (على سبيل المثال، لونزو EGM-2) قبل الحرب إلى 37 درجة مئوية.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة محلول التربسين تحييد وخلايا resuspend مع 1 مل من المتوسط ثقافة ما قبل الحرب.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والبذور 180k الخلايا في لوحة مغلفة 6-جيدا في 1.5 مل من المتوسط ثقافة ما قبل الحرب.
- يهز لوحة البئر أفقيا لضمان توزيع الخلايا بالتساوي في البئر.
- اتركه في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية تحت 95٪ هواء / 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
- إزالة الخلايا غير المرتبطة والثقافة المتوسطة واستبدالها مع 2mL من المتوسط ثقافة ما قبل الحرب.
ملاحظة: من المتوقع العديد من الخلايا غير المرفقة العائمة في الوسط.
4. تطبيق الإجهاد القص باستخدام شاكر المدارية
- يجب أن تصل HUVECs إلى التقاء بعد 3 أيام من النمو. استبدال الوسط مع 1.9 مل من المتوسطة ثقافة ما قبل الحرب (لتحقيق ارتفاع 2 ملم).
- ضع اللوحة على منصة شاكر مداري في حاضنة رطبة تحت 95٪ هواء / 5٪ CO2 ودوامة في 150 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام.
ملاحظة: مسح أسفل السطح الخارجي للهزاز المداري باستخدام الإيثانول 70٪ قبل وضعه في الحاضنة. - (اختياري) بعد يومين من القص، يمكن إضافة السيتوكينات إلى وسيط الثقافة للتحقيق في التفاعل بين السيتوكينات والإجهاد القص. بعد العلاج، قص الخلايا ليوم آخر. في هذه الدراسة، تم استخدام TNF-α لتنشيط الخلايا.
- إجراء التحليلات بعد 3 أيام من تطبيق الإجهاد القص.
5. تلطيخ وتصوير الخلايا
- بعد 3 أيام من القص، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1.5 مل من 4٪ PFA في البئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة PFA 4٪ من البئر ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- Permeabilize الخلايا بإضافة 0.1٪ تريتون-X في البئر واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل 0.1٪ تريتون X من البئر وإضافة 1.5 مل من 1٪ BSA في البئر لمنع. احتضان الخلايا مع 1٪ BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع أرنب المضادة للإنسان ZO-1 الأجسام المضادة في تخفيف 1:200 في 1٪ BSA. إضافة 1.5 مل من الأجسام المضادة المخففة في البئر واحتضانه مع الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وإزالة الأجسام المضادة المخففة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- تمييع اليكسا فلور 488 وصفت الماعز المضادة للأرانب IgG الأجسام المضادة الثانوية في تخفيف 1:300 في برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في البئر واحتضانه مع الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية المخففة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- تمييع DRAQ5 في تخفيف 1:1000 في برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل من DRAQ5 المخفف في البئر واحتضانه مع الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ نواة الخلية.
- إزالة DRAQ5 المخفف ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إجراء مسح البلاط من الحافة إلى مركز البئر مع المجهر confocal.
6. القياس الكمي للشكل الرقم القياسي وعدد الخلايا
- قم بمعالجة الصور باستخدام MATLAB R2016a.
- قراءة ملف LIF من المجهر confocal في MATLAB وتحويل مسح البلاط المدمجة إلى صورة ثنائية، ثم عتبة الصورة حسب المنطقة وكثافة لتمييز النوى من الخلفية.
- تقسيم المسح الضوئي البلاط ثنائي إلى شرائح شعاعي 1 ملم.
- تناسب القطع الناقص لكل نواة على حدة.
- عد عدد القطع الناقص داخل كل مقطع شعاعي لإعطاء رقم الخلية.
- تحديد مؤشر الشكل = كما SI = 4π × منطقة / محيط2. حساب فهرس الشكل لكل قطع ناقص18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إلغاء التصاق HUVECs إلى مناطق من لوحة البئر غير المغلفة بالفيبروكتين من قبل Pluronic F-127 passivation؛ اقتصر النمو على المنطقة المغلفة مع فيبروكتين حتى بعد 72 ساعة من الثقافة، مع وبدون تطبيق الإجهاد القص (الشكل 4A، الشكل 4C). دون مرور Pluronic F-127، HUVECs تعلق على السطح دون فيبروكتين وانتشرت أكثر من ذلك من قبل 72 ساعة من الثقافة (الشكل 4B، الشكل 4D).
محاذاة وإطالة HUVECs واضحة على حافة بئر دوامة ، والتي لديها HMUF ، في حين أن الخلايا في وسط البئر ، والتي لديها LMMF ، أظهرت مورفولوجيا مرصوفة بالحصى وليس محاذاة (الشكل 5A، الشكل 5B). تم قياس استطالة HUVECs كمؤشر الشكل: 4π x منطقة / محيط2. يشير فهرس الشكل 1 إلى دائرة، بينما تشير قيمة 0 إلى خط. انخفض مؤشر الشكل مع المسافة الشعاعية من المركز ، ولم يكن هناك فرق كبير بين الآبار المجزأة والكاملة. زيادة العلاج TNF-α استطالة HUVECs مقارنة مع الضوابط غير المعالجة(الشكل 5C). كما زاد HMUF عدد مركبات HUVECs لكل مم2 مقارنة ب LMMF في كلا الشرطين. وازداد عدد مركبات الكربون الهيدروفلورية تدريجيا مع المسافة على طول نصف القطر. ولم يلاحظ أي فرق كبير في عدد مركبات الكربون الهيدروفلورية التي تنمو في آبار مجزأة وكاملة(الشكل 6).
الرسم الهندسي الشكل 1من وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الأبعاد في مم.
الشكل 2 الرسم الهندسي من قالب PDMS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الأبعاد في مم.
الشكل 3 الرسم الهندسي للحلقة PDMS المستخدمة لتقسيم الآبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الأبعاد في مم. من غيم وآخرون13.
الشكل 4صور المجهر تبين أن Pluronic F-127 منعت الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) الالتصاق إلى المنطقة دون طلاء فيبروكتين.
لم يتم إرفاق HUVECs إلى جزء من سطح البئر التي لم تكن قد عولجت مسبقا مع فيبروكتين قبل تخدير مع Pluronic F-127، بعد 24 ساعة (A) و 72 ح (ج) من النمو. دون Pluronic F-127 passivation, تم إرفاق HUVECs إلى السطح دون فيبروكتين 24 ح بعد البذر (ب) وانتشرت أكثر من 72 ح (D). (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). من غيم وآخرون13.
الشكل 5 مورفولوجيا HUVECs المقص في بئر مجزأة أو كاملة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تظهر البقعة النووية (الحمراء) مورفولوجيا مركبات HUVECs المقصة (A) في الوسط و (B) على حافة بئر كامل (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). A و B تظهر أيضا الخطوط العريضة للخلية، التي حددتها مناعة ZO-1 (الأخضر). لاحظ محاذاة وإطالة الخلايا على الحافة ولكن ليس في المركز (C) لم يكن هناك فرق كبير في مؤشر الشكل النووي ، مما يشير إلى استدارة ، بين HUVECs التي تزرع في آبار كاملة والآبار المجزأة شوهد ل HUVEC المعالجة غير المعالجة أو TNF-α. كانت الخلايا ممدودة أكثر بالقرب من حافة البئر. ولم يكن الاتجاه نحو المزيد من الاستطالة في مركبات HUVECs المعالجة α TNF مهما باستمرار عبر المواقع. (اختبار ANOVA وBonferroni اللاحق في الاتجاهين؛ n = 3). وقد تم تعديل هذا الرقم من غيم وآخرون13
الشكل 6 ازداد عدد مركبات HUVECs لكل مم2 مع المسافة الشعاعية في لوحة بئر دوارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ولم يلاحظ فرق كبير بين الآبار الكاملة والمجزئة في كثافة (أ) غير المعالجة و(ب) مركبات HUVECs المعالجة α TNF في مواقع شعاعية مختلفة. في كلتا الحالتين، كان هناك خلايا أكثر لكل وحدة منطقة على الحافة من مركز البئر. (اختبار ANOVA وBonferroni اللاحق في الاتجاهين؛ n = 3). تم تعديل هذا الرقم من غيم وآخرون13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة الدوامة جيدا قادرة على توليد ملامح تدفق معقدة في بئر واحد - انخفاض حجم التدفق متعدد الاتجاهات (LMMF) في المركز وتدفق أحادي المحور عالية الحجم (HMUF) على حافة البئر. ومع ذلك ، سيتم خلط إفرازات القص بوساطة الإجهاد من الوسيط القابل للذوبان في الوسط الدوامي وتؤثر على الخلايا في البئر بأكمله ، مما قد يخفي التأثير الحقيقي لملف إجهاد القص الخاص على الخلايا.
طريقة الطلاء أظهرت هنا يتغلب على هذه المسألة عن طريق تقييد نمو الخلايا إلى منطقة معينة من البئر. ترتبط الخلايا عادة بالأسطح المائية بدلا من الأسطح الكارهة للماء. لهذا السبب، البوليسترين ثقافة وير هو المعالجة مسبقا مع أكسدة البلازما. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون مغلفة السطوح الكارهة للماء مع البروتينات مصفوفة خارج الخلية مثل فيبروكتين، كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم تمرير المناطق المغلفة غير فيبروكتين مع Pluronic F-127 لمنع أي التصاق المتبقية إلى سطح الكاره للماء.
يعتمد هذا البروتوكول على دقة القالب المطبوع. اعتمادا على الطابعة ثلاثية الأبعاد، قد يكون هناك اختلاف في الأبعاد الدقيقة للقالب. سيؤثر هذا على بناء PDMS النهائي ، والذي سيؤدي بدوره إلى التزام الخلايا في موقع غير صحيح داخل البئر. وبالتالي فإن الخلايا تجربة ملف الإجهاد القص غير تلك التي وضعتها CFD. عيب آخر لاستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد هو أن القالب قد لا يكون مسطحا ، بسبب تزييفه أثناء الطباعة. سيؤدي ذلك إلى بناء PDMS النهائي مما يسمح Pluronic F-127 لتسرب تحت، ومنع الخلايا من التمسك في المواقع المطلوبة. ولذلك فمن الأهمية بمكان للتحقق من وجود تسرب وقياس البعد من بناء PDMS قبل الاستخدام.
هذه الطريقة بسيطة ولكنها فعالة في السماح بتطبيق نوع معين من إجهاد القص (HMUF أو LMMF) على الخلايا. كما أنها مريحة لإعداد معظم المواد الاستهلاكية، والكواشف، والمعدات المتاحة تجاريا. ولا يسمح استخدام هذه الطريقة بفحص أو حصاد الخلايا المعرضة لتدفقات محددة جيدا فحسب، بل يسمح أيضا بجمع الخلايا المتوسطة المكيفة. توفر هذه الطريقة وسيلة جديدة للتحقيق في علم الأحياء الميكانيكية البطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بامتنان بمنحة مشروع مؤسسة القلب البريطانية (إلى PDW) ، والمجلس الوطني للبحوث الطبية في سنغافورة TAAP وDALM Grant (إلى XW ، NMRC / OFLCG /004/2018 ، NMRC / OFLCG / 001/2017) ، ومنحة A * STAR للدراسات العليا (إلى KTP) ، ومركز مؤسسة القلب البريطانية للتميز البحثي (إلى MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
