Summary
यह प्रोटोकॉल कक्षीय शेखर मॉडल का उपयोग करके कतरनी तनाव आवेदन के लिए 6-अच्छी प्लेट के एक विशिष्ट क्षेत्र में एंडोथेलियल सेल विकास को प्रतिबंधित करने के लिए एक कोटिंग विधि का वर्णन करता है।
Abstract
रक्त के प्रवाह से धमनी की दीवार पर लगाया गया कतरनी तनाव एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान और कार्य को प्रभावित करता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं में एक समर्थक एथेरोस्क्लेरोटिक फेनोटाइप को प्रोत्साहित करने के लिए कम परिमाण, दोलनात्मक और बहुदिशात्मक कतरनी तनाव सभी को पोस्टकिया गया है, जबकि उच्च परिमाण और एकदिशात्मक या एकीय कतरनी को एंडोथेलियल होमोस्टेसिस को बढ़ावा देने के लिए सोचा जाता है। इन परिकल्पनाओं को आगे की जांच की आवश्यकता होती है, लेकिन पारंपरिक इन विट्रो तकनीकों की सीमाएं होती हैं, और कोशिकाओं पर बहुदिशात्मक कतरनी तनाव लगाने में विशेष रूप से गरीब होते हैं।
एक विधि जो बढ़ते उपयोग को प्राप्त कर रही है, वह एक कक्षीय शेखर के मंच पर मानक बहु-अच्छी प्लेटों में एंडोथेलियल कोशिकाओं को संस्कृति देना है; इस सरल, कम लागत वाले, उच्च थ्रूपुट और पुरानी विधि में, घूमता माध्यम कुएं के विभिन्न हिस्सों में बहुदिश कतरनी सहित कतरनी के विभिन्न पैटर्न और परिमाण पैदा करता है। हालांकि, इसकी एक महत्वपूर्ण सीमा है: एक क्षेत्र में कोशिकाएं, एक प्रकार के प्रवाह के संपर्क में, मध्यस्थों को उस माध्यम में जारी कर सकती हैं जो अच्छी तरह से अन्य हिस्सों में कोशिकाओं को प्रभावित करती है, विभिन्न प्रवाहों के संपर्क में आती है, इसलिए प्रवाह और फेनोटाइप के बीच स्पष्ट संबंध को विकृत करती है।
यहां हम विधि का एक आसान और किफायती संशोधन प्रस्तुत करते हैं जो कोशिकाओं को केवल विशिष्ट कतरनी तनाव विशेषताओं के संपर्क में लाने की अनुमति देता है। सेल सीडिंग फाइब्रोनेक्टिन के साथ ब्याज के क्षेत्र को कोटिंग करके कुएं के एक परिभाषित क्षेत्र तक सीमित है, जिसके बाद पासिवाटिंग समाधान का उपयोग करके पासिवेशन किया जाता है। इसके बाद, प्लेटों को शेकर पर घूमता जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के संपर्क में आने से कम परिमाण वाले बहुदिशात्मक कतरनी या उच्च परिमाण वाले एकक्षी कतरनी जैसे अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी प्रोफाइल होते हैं, जो उनके स्थान के आधार पर होते हैं। पहले की तरह, मानक सेल-कल्चर प्लास्टिकवेयर का उपयोग कोशिकाओं के सीधे आगे के विश्लेषण की अनुमति देता है। संशोधन पहले से ही घुलनशील मध्यस्थों के प्रदर्शन की अनुमति दी है, परिभाषित कतरनी तनाव विशेषताओं के तहत एंडोथेलियम से जारी है, कि अच्छी तरह से कहीं और स्थित कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं ।
Introduction
रक्त वाहिकाओं के सामान्य कार्य औररोगके विकास में उनके यांत्रिक वातावरण में संवहनी कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं महत्वपूर्ण हैं । एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) की मशीनोबायोलॉजी जो सभी रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सतह को लाइन करती है, मशीनोबायोलॉजिकल अनुसंधान का एक विशेष ध्यान केंद्रित किया गया है क्योंकि ईसीएस सीधे उन पर रक्त प्रवाह से उत्पन्न कतरनी तनाव का अनुभव करते हैं। भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, परिवर्तित कठोरता और आकृति विज्ञान, वासोएक्टिव पदार्थों की रिहाई, और जंक्शनल प्रोटीन के स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति जैसे विभिन्न फेनोटाइपिकपरिवर्तन कतरनी तनाव2,3,4के लिए चुनाव आयोग के संपर्क पर निर्भर करते हैं। कतरनी पर निर्भर एंडोथेलियलगुणों में एथेरोस्क्लेरोसिस5,6,7जैसे रोगों के बद विकास का भी ध्यान हो सकता है।
यह संस्कृति में ECs पर कतरनी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जहां तनाव को नियंत्रित किया जा सकता है, और ECs अंय सेल प्रकार से अलग किया जा सकता है । आमतौर पर ECs के लिए कतरनी तनाव लागू करने के लिए विट्रो उपकरणों में इस्तेमाल समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष और शंकु और प्लेट विस्कॉमीटर शामिल हैं, लेकिन केवल एकीय स्थिर, दोलन, और स्पंदन प्रवाह8,9लागू किया जा सकता है । यद्यपि एक स्टेनोटिक ज्यामिति की नकल करने वाले पतला या ब्रांचिंग ज्यामिति और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ संशोधित प्रवाह कक्ष विकसित किए गए हैं, उनके कम थ्रूपुट और अपेक्षाकृत कम संस्कृति अवधि जो संभवहै, एक चुनौती10, 11उत्पन्न करती है।
एंडोथेलियल मेकेनोट्रांसडक्शन के अध्ययन के लिए कक्षीय शेखर (या अच्छी तरह से घूमता हुआ) विधि, जिसमें कोशिकाओं को एक कक्षीय शेखर के मंच पर रखे गए मानक सेल कल्चर प्लास्टिकवेयर में उगायाजाताहै, ध्यान बढ़ाने में सक्षम है क्योंकि यह लंबे समय से जटिल लगाने में सक्षम है, उच्च थ्रूपुट के साथ ECs पर स्थानिक रूप से अलग कतरनी तनाव पैटर्न (वारबॉयस एट अल द्वारा समीक्षा देखें)। कम्प्यूटेशनल फ्लूइड डायनेमिक्स (सीएफडी) सिमुलेशन को एक घूमता हुआ अच्छी तरह से कतरनी तनाव के स्थानिक और लौकिक भिन्नता की विशेषता के लिए नियोजित किया गया है। शेकर मंच की कक्षीय गति के कारण संस्कृति माध्यम की घूमता गति जिस पर प्लेट रखी जाती है, केंद्र में कम परिमाण बहुदिशात्मक प्रवाह (एलएमएमएफ, या ख्यात समर्थक एथेरोजेनिक प्रवाह) और 6-वेल प्लेट के कुओं के किनारे पर उच्च परिमाण यूनिएक्सियल फ्लो (एचएमयूएफ, या ख्यात रूप से एथेरोप्रोटेक्टिव प्रवाह) की ओर जाता है। उदाहरण के लिए, समय औसत दीवार कतरनी तनाव (TAWSS) केंद्र में लगभग 0.3 पीए और 0.7 पीए एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के किनारे पर 5 मिमी कक्षीय त्रिज्या13के साथ 150 आरपीएम पर घूमता है। विधि केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्टिकवेयर और कक्षीय शेखर ही की आवश्यकता है ।
हालांकि, विधि के लिए एक दोष है (और विट्रो में प्रवाह लगाने के अन्य तरीकों के लिए): ईसीएस घुलनशील मध्यस्थों और सूक्ष्मकणों को कतरनी-निर्भर तरीके से14,15,16 जारी करता है और यह स्रावम घूमता माध्यम में मिश्रण के कारण अच्छी तरह से अन्य क्षेत्रों में ईसीएस को प्रभावित कर सकता है। यह चुनाव आयोग फेनोटाइप पर कतरनी तनाव के वास्तविक प्रभाव मुखौटा हो सकता है । उदाहरण के लिए, घाम एट अल ने अनुमान लगाया है कि यह बड़े कणों के पारकोशिकीय परिवहन पर विभिन्न कतरनी प्रोफाइल के समान प्रभाव के लिए खाता है17।
यहां हम एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के विशिष्ट क्षेत्रों में मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल सेल (HUVEC) आसंजन को बढ़ावा देने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जबकि सतह को खराब करने और कहीं और विकास को रोकने के लिए प्लूरोनिक एफ-127 का उपयोग करते हुए फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग का उपयोग करते हैं। विधि ऊपर वर्णित सीमा को हल करती है क्योंकि, सेल विकास को खंडित करके, ईसीएस केवल एक प्रकार की कतरनी प्रोफ़ाइल का अनुभव करते हैं, और अच्छी तरह से कहीं और अन्य प्रोफाइल के संपर्क में आने वाले ईसीएस से स्रावसेम से प्रभावित नहीं होते हैं।
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Protocol
1. उपकरणों का निर्माण और अभिकर् ती की तैयारी
- स्टेनलेस स्टील मॉड्यूल का निर्माण
- प्रदान की गई इंजीनियरिंग ड्राइंग(चित्रा1) के अनुसार सीएनसी मिलिंग मशीन का उपयोग करके एक ग्रेड 316 स्टेनलेस-स्टील से स्टेनलेस-स्टील मॉड्यूल तैयार करें।
- पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोल्ड की 3डी प्रिंटिंग
- प्रदान की गई इंजीनियरिंग ड्राइंग(चित्रा 2)के अनुसार सॉलिडवर्क्स का उपयोग करके पीडीएमएस मोल्ड का 3डी कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) मॉडल तैयार करें।
- सीएडी मॉडल को एसटीएल फाइल में निर्यात करें और एसटीएल फाइल को कुरा 2.6.2 में आयात करें।
- मॉडल को 50 मिमी/एस की प्रिंट गति और 60% के इनफिल घनत्व के साथ परतों में स्लाइस करें।
- फाइल को जी-कोड के रूप में निर्यात करें और इसे प्रिंटिंग के लिए एक अल्टिमेकर2 3डी प्रिंटर पर अपलोड करें। प्रिंटिंग मटेरियल के रूप में पॉलीलैक्टिक एसिड (पीएलए) का इस्तेमाल करें।
- पीडीएमएस रिंग की कास्टिंग
- 90.9% आधार और 9.1% इलाज एजेंट के अनुपात के साथ पीडीएमएस बेस और इलाज एजेंट (दोनों सिलिकॉन इलास्टोमर किट से) मिलाएं।
- 3 डी मुद्रित मोल्ड में अच्छी तरह से मिश्रित समाधान के लगभग 2.6 एमएल डालो।
- एक वैक्यूम डिगैसिंग कक्ष में बुलबुले निकालें।
- 80 डिग्री सेल्सियस भट्टी में 1 घंटे के लिए इसे ठीक करें।
- पीडीएमएस रिंग को कमरे के तापमान में ठंडा होने दें, फिर मोल्ड से ठीक पीडीएमएस रिंग को ध्यान से हटा दें। पीडीएमएस रिंग की इंजीनियरिंग ड्राइंग चित्र 3में दिखाई गई है ।
- 1% प्लूनिक एफ-127 की तैयारी
- 5 ग्राम प्लूरोनिक एफ-127 का वजन करें, इसे कांच की बोतल में डालें, फिर कांच की बोतल में 100 एमएल बाँझ पानी डालें। इससे 5% प्लेओरोनिक एफ-127 सॉल्यूशन मिलता है।
- सुनिश्चित करें कि सभी Pluronic एफ-127 पाउडर पानी में डूबे हुए हैं, टोपी बंद करें और तरल नसबंदी चक्र कार्यक्रम का उपयोग करके इसे ऑटोक्लेव करें।
- ऑटोक्लेव के बाद, उपयोग से पहले समाधान को कमरे के तापमान में ठंडा होने दें।
- 1% प्लूरोनिक एफ-127 समाधान बनाने के लिए ऑटोक्लेव बाँझ पानी के 40 मिलीलनीय पानी में 5% के 10 एमएल जोड़ें। जैव शिक्षा कैबिनेट (बीएससी) हुड में कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
- कमरे के तापमान पर 1% और 5% Pluronic F-127 दोनों स्टोर करें।
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की तैयारी
- एक ग्लास बीकर में फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 800 मिलियन एमएल जोड़ें और इसे सरगर्मी करते हुए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें (स्टेप 1.5.1 से 1.5.5 तक सरगर्मी रखें)।
- पीएफए पाउडर के 40 ग्राम वजन और गर्म पीबीएस समाधान के लिए जोड़ें।
सावधानी: पीएफए खतरनाक है, एक धुएं हुड में 1.5.2 से 1.5.6 चरणों का प्रदर्शन करें। - 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) धीरे-धीरे पीएफए समाधान में ड्रॉपवाइज जोड़ें जब तक समाधान स्पष्ट नहीं हो जाता है।
- पीएफए समाधान के पीएच को 1 मीटर हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ लगभग 7.4 में समायोजित करें।
- 1X पीबीएस के साथ 1 एल के लिए समाधान ऊपर। यह 4% पीएफए के 1 एल देता है।
- पीएफए समाधान को 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें ताकि किसी भी कण, एलिकोट और फ्रीज को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में हटाया जा सके।
- 0.1% ट्राइटन-एक्स की तैयारी
- 0.1% ट्राइटन-एक्स समाधान बनाने के लिए पीबीएस के 50 एमएल में शुद्ध ट्राइटन-एक्स के 50 माइक्रोन जोड़ें।
- 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) की तैयारी
- बीएसए के 0.5 ग्राम वजन, यह एक 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में डालना, और फिर ट्यूब में पीबीएस के 50 एमएल जोड़ें।
- इसे भंग करने के लिए रोलर पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रोल करने दें।
- दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% बीएसए स्टोर करें।
2. 6-अच्छी प्लेट की कोटिंग
- उपयोग से पहले ऑटोक्लेव स्टेनलेस-स्टील मॉड्यूल, पीडीएमएस रिंग और चिमटी। बीएससी हुड में बाद की सभी प्रक्रियाओं को करें और बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए एसेप्टिक तकनीकों का निरीक्षण करें।
- चिमटी का उपयोग कर 6-अच्छी तरह से पीडीएमएस रिंग में रखें। पीडीएमएस रिंग के बाहरी रिम का उपयोग अच्छी तरह से अनुकूल रूप से पीडीएमएस रिंग को संरेखित करने के लिए करें।
नोट: केवल गैर ऊतक संस्कृति अच्छी तरह से इलाज प्लेटों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । - चिमटी का उपयोग कर पीडीएमएस रिंग के शीर्ष पर स्टेनलेस-स्टील मॉड्यूल रखें।
- बनाए रखने की अंगूठी के ग्रिप छेद में आंतरिक बनाए रखने की अंगूठी चिमटा के सुझावों डालें, धारक को बनाए रखने की अंगूठी के व्यास को कम करने के लिए निचोड़। इसे 6-वेल में फिट करें, इसे स्टेनलेस-स्टील मॉड्यूल पर मजबूती से दबाएं और कुएं में पीडीएमएस रिंग को सुरक्षित करने के लिए चिमटा छोड़ें।
- पीडीएमएस रिंग और स्टेनलेस-स्टील मॉड्यूल के उद्घाटन के माध्यम से केंद्र या कुएं के किनारे (ब्याज के क्षेत्र के आधार पर) में 5 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन के 1 एमएल जोड़ें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को भंवर करें कि फाइब्रोनेक्टिन समाधान ब्याज के सभी क्षेत्रों को कवर करता है।
- 95% हवा/
- फाइब्रोनेक्टिन समाधान को कुएं से निकालें और पीबीएस के साथ दो बार धोएं। पीबीएस को पूरी तरह से कुएं से हटा दें।
- बनाए रखने की अंगूठी, स्टेनलेस स्टील मॉड्यूल, और पीडीएमएस अंगूठी अच्छी तरह से हटा दें।
- केंद्र या कुएं (अनकोटेड सतह) के किनारे में 1% प्लूरोनिक एफ-127 का 1.5 एमएल जोड़ें और अनकोटेड सतह को निष्क्रिय करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- कुएं से प्लेरोनिक एफ-127 समाधान निकालें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- लेपित को तुरंत अच्छी तरह से उपयोग करें या इसे दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जो लेपित कुएं में पीबीएस की एक परत के साथ है।
3. एचयूवीईसी की सीडिंग
- प्रयोग में 5 मार्ग के नीचे HUVECs का उपयोग करें ।
- सभी संस्कृति माध्यम निकालें और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
- 95% एयर/5% सीओ2के तहत आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 3 मिनट के लिए 0.05% ट्राइपसिन और 3 मिनट के लिए 3 07 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें। कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए फ्लास्क को धीरे-धीरे टैप करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल का परीक्षण एचयूवीसी का उपयोग करके किया गया है और ट्राइप्सिन की एकाग्रता और इसका इनक्यूबेशन समय अन्य प्रकार के ईसीएस के लिए अलग हो सकता है। - समाधान को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 6 एमएल कल्चर मीडियम (जैसे, लोन्ज़ा ईजीएम-2) का उपयोग करके ट्राइप्सिन को बेअसर कर 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म्ड करें।
- 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। प्रीवार्म्ड कल्चर मीडियम के 1 मिलील के साथ बेअसर ट्राइप्सिन सॉल्यूशन और रिसिपेंड सेल्स को हटा दें।
- एक हीमोसाइटोमीटर और बीज 180k कोशिकाओं का उपयोग कर कोशिकाओं को प्रीवार्म्ड संस्कृति माध्यम के 1.5 एमएल में लेपित 6-अच्छी प्लेट में गिनें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं अच्छी तरह से समान रूप से वितरित करें, अच्छी तरह से प्लेट को बाद में हिलाएं।
- इसे रात भर 95% हवा/5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में छोड़ दें।
- असंबद्ध कोशिकाओं और संस्कृति माध्यम को हटा दें और प्रीवार्मेड कल्चर माध्यम के 2mL के साथ बदलें।
नोट: माध्यम में तैरने वाली कई असंबद्ध कोशिकाओं की उम्मीद है।
4. एक कक्षीय शेखर का उपयोग कर कतरनी तनाव आवेदन
- एचयूवीसी को विकास के 3 दिनों के बाद संगम पहुंचना चाहिए। मध्यम को प्रीवार्मेड कल्चर माध्यम (2 मिमी की ऊंचाई प्राप्त करने के लिए) के 1.9 एमएल के साथ बदलें।
- 95% एयर/5% सीओ 2 के तहत एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में एक कक्षीय शेखर के मंच पर प्लेट रखें और इसे3 दिनों के लिए 150 आरपीएम पर घूमता है।
नोट: इनक्यूबेटर में रखने से पहले 70% इथेनॉल का उपयोग करके कक्षीय शेखर की बाहरी सतह को मिटा दें। - (वैकल्पिक) कतरनी के 2 दिनों के बाद, साइटोकिन्स और कतरनी तनाव के बीच परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए संस्कृति माध्यम में साइटोकिन्स जोड़ा जा सकता है। उपचार के बाद, कोशिकाओं को एक और दिन के लिए कतरनी। इस अध्ययन में कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए टीएनएफ-α का इस्तेमाल किया गया।
- कतरनी तनाव आवेदन के 3 दिनों के बाद विश्लेषण करते हैं।
5. कोशिकाओं का धुंधला और इमेजिंग
- कतरनी के 3 दिन बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
- कोशिकाओं को कुएं में 4% पीएफए के 1.5 एमएल जोड़कर ठीक करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- कुएं से 4% पीएफए निकालें और पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
- कोशिकाओं को कुएं में 0.1% ट्राइटन-एक्स जोड़कर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके।
- कुएं से 0.1% ट्राइटन-एक्स समाधान निकालें और अवरुद्ध करने के लिए 1% बीएसए के 1.5 एमएल को अच्छी तरह से जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% बीएसए के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- तनु खरगोश विरोधी मानव ZO-1 एंटीबॉडी 1% बीएसए में एक 1:200 कमजोर पड़ने पर । कुएं में पतला एंटीबॉडी का 1.5 एमएल जोड़ें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट करें।
- रात भर इनक्यूबेशन के बाद, पतला एंटीबॉडी को हटा दें और पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं।
- तनु एलेक्सा फ्लोर ४८८-लेबल बकरी विरोधी खरगोश IgG माध्यमिक एंटीबॉडी PBS में एक 1:300 कमजोर पड़ने पर । अच्छी तरह से पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 1.5 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ इसे इनक्यूबेट करें।
- पतला माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
- पीबीएस में 1:1000 के कमजोर पड़ने पर DRAQ5 पतला करें। अच्छी तरह से पतला DRAQ5 के 1.5 एमएल जोड़ें और कोशिका नाभिक दाग करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ इसे इनक्यूबेट।
- पतला DRAQ5 निकालें और PBS के साथ तीन बार धो ।
- एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कुएं के केंद्र में किनारे से एक टाइल स्कैन करें।
6. आकार सूचकांक और कोशिकाओं की संख्या का मात्राकरण
- MATLAB R2016a का उपयोग कर छवियों को पोस्ट करें।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से एलआईएफ फ़ाइल को मैटलैब में पढ़ें और विलय किए गए टाइल स्कैन को बाइनरी इमेज में परिवर्तित करें, फिर पृष्ठभूमि से नाभिक को अलग करने के लिए क्षेत्र और तीव्रता से छवि को दहलीज करें।
- बाइनरी टाइल को 1 मिमी रेडियल सेगमेंट में स्कैन करें।
- प्रत्येक व्यक्ति नाभिक के लिए एक अंडा फिट।
- सेल नंबर देने के लिए प्रत्येक रेडियल सेगमेंट के भीतर एलिप्सेस की संख्या गिनें।
- आकार सूचकांक = एसआई के रूप में परिभाषित= 4 एक्स क्षेत्र / प्रत्येक एलिप्स18के लिए आकार सूचकांक की गणना करें ।
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Representative Results
फाइब्रोनेक्टिन से लेपित नहीं अच्छी प्लेट के क्षेत्रों में एचएचवीसी का आसंजन प्लूरोनिक एफ-127 पासिवेशन द्वारा निरस्त किया गया था; विकास संस्कृति के ७२ घंटे के बाद भी फाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित क्षेत्र तक ही सीमित था, के साथ और कतरनी तनाव आवेदन के बिना(चित्रा 4A, चित्रा 4C)। प्लूरोनिक एफ-127 पासिवेशन के बिना, एचवीवीसी फाइब्रोनेक्टिन के बिना सतह से जुड़े थे और संस्कृति के 72 घंटे(चित्रा 4B, चित्रा 4D)द्वारा आगे बढ़ गए थे।
एचयूवीसी का संरेखण और विस्तार एक घूमता हुआ कुएं के किनारे पर स्पष्ट है, जिसमें एचएमयूएफ है, जबकि कुएं के केंद्र में कोशिकाओं, जिसमें एलएमएमएफ है, ने एक कोबलस्टोन आकृति विज्ञान और कोई संरेखण नहीं प्रदर्शित किया(चित्रा 5A, चित्रा 5B)। HUVECs के विस्तार को आकार सूचकांक के रूप में निर्धारितकिया गया था: 4ο x क्षेत्र/ 1 का एक आकार सूचकांक एक चक्र इंगित करता है, जबकि 0 का मूल्य एक पंक्ति को इंगित करता है। आकार सूचकांक केंद्र से रेडियल दूरी के साथ कमी आई, और खंडित और पूर्ण कुओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। टीएनएफ-α उपचार अनुपचारित नियंत्रण(चित्रा 5C)की तुलना में HUVECs की वृद्धि हुई । एचएमयूएफ ने दोनों शर्तों के तहत एलएमएमएफ की तुलना मेंएलएमएमएफ की तुलना में प्रति एमएम 2 एचयूवीसी की संख्या में भी वृद्धि की । एचयूवीसी की संख्या धीरे-धीरे त्रिज्या के साथ दूरी के साथ बढ़ी। खंडित और पूर्ण कुओं(चित्रा 6)में उगाए गए एचयूवीसी की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया ।
स्टेनलेस-स्टील मॉड्यूल की चित्रा 1इंजीनियरिंग ड्राइंग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।
आयाम मिमी में हैं।
पीडीएमएस मोल्ड की चित्रा 2 इंजीनियरिंग ड्राइंग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
आयाम मिमी में हैं।
पीडीएमएस रिंग की चित्र 3 इंजीनियरिंग ड्राइंग कुओं को खंडित करने के लिए उपयोग की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
आयाम मिमी में हैं। घाम एट अलसे 13।
चित्रा 4 माइक्रोस्कोप छवियां दिखाती हैं कि प्लूरोनिक एफ-127 ने फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग के बिना इस क्षेत्र में मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) आसंजन को रोका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
24 एच(ए)और 72 एच(सी)के विकास के बाद, प्लूरोनिक एफ-127 के साथ पासिवेशन से पहले फाइब्रोनेक्टिन के साथ प्री-इलाज नहीं किया गया था कि अच्छी तरह से सतह के हिस्से से कोई HUVECs संलग्न नहीं थे। प्लूरोनिक एफ-127 पासिवेशन के बिना, एचयूवीसी को सीडिंग(बी)के बाद 24 घंटे के बिना सतह से जोड़ा गया था और 72 एच(डी)द्वारा आगे बढ़ाया गया था। (स्केल बार = 500 माइक्रोन)। घाम एट अलसे 13।
चित्र 5एकखंडित या पूर्ण अच्छी तरह से कतरनी HUVECs की आकृति विज्ञान । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
परमाणु (लाल) दाग केंद्र में कतरनी HUVECs (ए) की आकृति विज्ञान से पता चलता है और (बी) एक पूर्ण अच्छी तरह से (पैमाने पर बार = १०० μm) के किनारे पर । ए और बी भी सेल रूपरेखा दिखाते हैं, जो जेडओ-1 (हरे रंग) के इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा चित्रित किए गए हैं। संरेखण और किनारे पर कोशिकाओं के विस्तार पर ध्यान दें, लेकिन केंद्र में नहीं (सी) परमाणु आकार सूचकांक में कोई महत्वपूर्ण अंतर, गोलाई का संकेत है, HUVECs के बीच पूर्ण कुओं और खंडित कुओं में उगाया अनुपचारित या TNF-α इलाज HUVEC के लिए देखा गया था । कोशिकाओं को अच्छी तरह से किनारे के पास अधिक लम्बी थे । टीएनएफ-α-इलाज एचयूवीसी में अधिक विस्तार की प्रवृत्ति स्थानों पर लगातार महत्वपूर्ण नहीं थी। (दो तरह से ANOVA और Bonferroni के बाद तदर्थ परीक्षण; n = 3) । इस आंकड़े को Ghim एट अल से संशोधित किया गयाहै ।
अंक 6 एक घूमता अच्छी तरह से थाली में रेडियल दूरी के साथप्रति मिमी 2 HUVECs की संख्या में वृद्धि हुई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
विभिन्न रेडियल स्थानों पर (ए) अनुपचारित और (बी) टीएनएफ-α-उपचारित एचयूवीसी के घनत्व में पूर्ण और खंडित कुओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया । दोनों ही मामलों में, कुएं के केंद्र की तुलना में किनारे पर प्रति इकाई क्षेत्र अधिक कोशिकाएं थीं। (दो तरह से ANOVA और Bonferroni के बाद तदर्थ परीक्षण; n = 3) । इस आंकड़े को घाम एट अल13से संशोधित किया गयाहै ।
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Discussion
घूमता-अच्छी विधि केंद्र में एक अच्छी तरह से कम परिमाण बहुदिशात्मक प्रवाह (एलएमएमएफ) और अच्छी तरह से किनारे पर उच्च परिमाण यूनिएक्सियल फ्लो (एचएमयूएफ) में जटिल प्रवाह प्रोफाइल उत्पन्न करने में सक्षम है। हालांकि, कतरनी तनाव-घुलनशील मध्यस्थ के मध्यस्थ मध्यस्थ घूमता माध्यम में मिलाया जाएगा और पूरी अच्छी तरह से कोशिकाओं को प्रभावित, संभवतः कोशिकाओं पर एक विशेष कतरनी तनाव प्रोफ़ाइल के सही प्रभाव मास्किंग ।
यहां प्रदर्शित कोटिंग विधि कोशिकाओं के विकास को कुएं के एक विशिष्ट क्षेत्र में सीमित करके इस मुद्दे पर काबू पा रही है। कोशिकाएं आमतौर पर हाइड्रोफोबिक वाले के बजाय हाइड्रोफिलिक सतहों से जुड़ी होती हैं। इस कारण से पॉलीस्टीरिन कल्चर वेयर को प्लाज्मा ऑक्सीकरण से पहले से ट्रीट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, हाइड्रोफोबिक सतहों को फाइब्रोनेक्टिन जैसे एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित किया गया है; हाइड्रोफोबिक सतह पर किसी भी अवशिष्ट आसंजन को रोकने के लिए गैर-फाइब्रोनेक्टिन लेपित क्षेत्रों को प्लूरोनिक एफ-127 के साथ निष्क्रिय किया गया था।
यह प्रोटोकॉल मुद्रित मोल्ड की सटीकता पर निर्भर है। 3 डी प्रिंटर के आधार पर, मोल्ड के सटीक आयामों में भिन्नता हो सकती है। यह अंतिम पीडीएमएस निर्माण को प्रभावित करेगा, जिसके परिणामस्वरूप कुएं के भीतर एक गलत स्थान पर पालन करने वाली कोशिकाएं होंगी। इसलिए कोशिकाओं को सीएफडी द्वारा मॉडलिंग की गई एक के अलावा एक कतरनी तनाव प्रोफ़ाइल का अनुभव होगा । 3 डी प्रिंटर का उपयोग करने के लिए एक और दोष यह है कि प्रिंटिंग के दौरान वारिंग के कारण मोल्ड फ्लैट नहीं हो सकता है। इसके परिणामस्वरूप अंतिम पीडीएमएस निर्माण होगा जो प्लूरोनिक एफ-127 को नीचे रिसाव करने की अनुमति देगा, जिससे कोशिकाओं को वांछित स्थानों में पालन करने से रोका जा सकेगा। इसलिए यह लीक के लिए जांच और उपयोग से पहले उत्पादन PDMS के आयाम को मापने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यह विधि कोशिकाओं को एक विशिष्ट प्रकार के कतरनी तनाव (एचएमयूएफ या एलएमएमएफ) के अनुप्रयोग की अनुमति देने में अभी तक सरल है। यह भी स्थापित करने के लिए सुविधाजनक है के रूप में उपभोक्ताओं, अभिकर्दकों के अधिकांश, और उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । इस विधि का उपयोग न केवल अच्छी तरह से परिभाषित प्रवाह के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की परीक्षा या कटाई की अनुमति देता है बल्कि उन कोशिकाओं द्वारा संचालित मध्यम के संग्रह की अनुमति देता है। विधि एंडोथेलियल मैकेनोबायोलॉजी की जांच करने के लिए एक नया एवेन्यू प्रदान करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों कृतज्ञता से एक ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन परियोजना अनुदान स्वीकार (PDW के लिए), एक राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद सिंगापुर TAAP और डायनेमो अनुदान (XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), एक एक * स्टार स्नातक छात्रवृत्ति (KTP के लिए), और एक ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन सेंटर ऑफ रिसर्च एक्सीलेंस स्टूडेंटशिप (एमए के लिए) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
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