Uveíte Autoimune Experimental: Um Modelo de Rato Inflamatório Intraocular

Resumo

Neste relato apresentamos um protocolo que permite ao investigador gerar um modelo de uveíte intraocular em camundongo. Mais comumente referido como uveíte autoimune experimental (EAU), este modelo estabelecido captura muitos aspectos da doença humana. Aqui, descreveremos como induzir e monitorar a progressão da doença usando várias leituras.

Resumo

A Uveíte Autoimune Experimental (EAU) é impulsionada por células imunes que respondem a autoantígenos. Muitas características deste modelo de doença inflamatória intraocular não infecciosa recapitulam o fenótipo clínico da uveíte posterior que afeta humanos. A EAU tem sido usada de forma confiável para estudar a eficácia de novas terapias inflamatórias, seu modo de ação e para investigar melhor os mecanismos que sustentam a progressão da doença de distúrbios intraoculares. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado sobre a indução de EAU no camundongo C57BL/6J - o organismo modelo mais utilizado com suscetibilidade a esta doença. A avaliação clínica da gravidade e progressão da doença será demonstrada por meio de fundoscopia, exame histológico e angiografia fluoresceína. O procedimento de indução envolve a injeção subcutânea de uma emulsão contendo um peptídeo (IRBP_1-20) da proteína ocular interfotorreceptor retinóide proteína (também conhecida como proteína de ligação ao retinol 3), Adjuvante de Freund Completo (CFA) e suplementado com Mycobacterium tuberculosis morto. A injeção desta emulsão viscosa na parte de trás do pescoço é seguida por uma única injeção intraperitoneal de toxina Bordetella pertussis . No início dos sintomas (dia 12-14) e sob anestesia geral, são obtidas imagens fundoscópicas para avaliar a progressão da doença através do exame clínico. Esses dados podem ser comparados diretamente com aqueles em momentos posteriores e pico de doença (dia 20-22) com diferenças analisadas. Ao mesmo tempo, este protocolo permite que o investigador avalie possíveis diferenças na permeabilidade e dano dos vasos usando angiografia fluoresceína. A EAU pode ser induzida em outras cepas de camundongos - tanto selvagens quanto geneticamente modificadas - e combinada com novas terapias que oferecem flexibilidade para estudar a eficácia de medicamentos e/ou mecanismos de doenças.

Introdução

Este protocolo demonstrará como induzir a Uveíte Autoimune Experimental (EAU) em camundongos C57BL/6J por uma única injeção subcutânea de um antígeno da retina em um adjuvante emulsionado. Os métodos para monitorar e avaliar a progressão da doença serão detalhados por meio de imagens fundoscópicas e exame histológico, com parâmetros de medição delineados dentro. Além disso, a angiografia fluoresceína, uma técnica para examinar a estrutura e a permeabilidade dos vasos sanguíneos da retina, será discutida.

Este modelo EAU recapitula as características centrais da uveíte posterior não infecciosa em humanos no que diz respeito às características clínico-patológicas e aos mecanismos celulares e moleculares básicos que impulsionam a doença. A EAU é mediada por subconjuntos Th1 e/ou Th17 de linfócitos CD4⁺T auto-reativos, como demonstrado em experimentos de transferência adotiva e com camundongos empobrecidos de IFNγ¹. Grande parte da nossa compreensão dos papéis potenciais para essas células na uveíte vem do estudo da EAU², onde as células Th1 e Th17 são detectadas nos tecidos da retina³. Muitas vezes, a EAU é usada como um modelo pré-clínico para avaliar a utilidade de novas terapias na atenuação da doença. Abordagens terapêuticas que modularam com sucesso a doença EAU mostraram alguma eficácia na clínica e atingiram o status de aprovação da FDA. Exemplos disso são grupos de drogas imunorreguladoras, como as terapias direcionadas às células T: ciclosporina, FK-506 e rapamicina ^4,5,6. Recentemente, intervenções direcionadas a novas vias também foram exploradas neste modelo para investigar o mecanismo e o efeito no desfecho da doença. Estes incluem o direcionamento da regulação transcricional através de proteínas Bromodomain Extra-Terminal (BET) leitoras de cromatina e inibidores de P-TEFb³. Além disso, abordagens mais convencionais, como um inibidor de VLA-4, demonstraram recentemente supressão na EAU via modulação de células T CD4⁺ efetoras⁷. Além disso, a segmentação de células Th17 com TMP778, um agonista inverso RORγt, também foi encontrada para suprimir significativamente EAU⁸. Além disso, este modelo oferece uma oportunidade para estudar a inflamação autoimune crônica na retina e os mecanismos subjacentes que o acompanham, como o priming de linfócitos.

As leituras primárias para estudos pré-clínicos de EAU são a avaliação clínica por meio da realização de imagens de fundoscopia da retina e, com menor frequência, pela avaliação da integridade da retina por Tomografia de Coerência Óptica (OCT). A avaliação histopatológica da retina e a imunofenotipagem das células da retina por citometria de fluxo são então realizadas no término. A fundoscopia é um sistema de imagem ao vivo fácil de usar que permite uma avaliação clínica rápida e reprodutível de toda a retina. Para as avaliações imuno-histoquímicas, as técnicas baseiam-se na preparação de cortes da retina que permitem estudar a arquitetura tecidual quanto ao grau de inflamação e dano estrutural⁹. Os critérios de avaliação e os sistemas convencionais de pontuação, para todas as técnicas utilizadas, serão descritos neste protocolo. A extensão do dano registrado usando imagens fundoscópicas geralmente se correlaciona estreitamente com alterações histológicas. Essa abordagem dupla para monitorar e avaliar a gravidade da doença proporciona maior sensibilidade e resultados de medição mais confiáveis.

A EAU é um modelo bem estabelecido e comumente usado para testes pré-clínicos e investigação de doenças oculares imunomediadas. Esse modelo é confiável e reprodutível com incidência de doença de >95% e gera dados abrangentes que podem ser utilizados para validar ou repudiar novas terapias para o tratamento da doença inflamatória intraocular que representa uma das principais causas de cegueira em idade ativa em todo o mundo¹⁰.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986 e as diretrizes institucionais do Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB).

1. Ratos C57BL/6J de alojamento

1. Abrigar ratos em um ambiente livre de patógenos específicos, em um ciclo claro-escuro de 12 horas e comida e água disponíveis ad libitum.
2. Realizar todos os experimentos em mulheres adultas C57BL/6J (as fêmeas são escolhidas preferencialmente, pois há uma incidência de mulheres para homens de 1,4 a 1 em pacientes com uveíte). Randomize camundongos fêmeas C57BL/6J entre 6-8 semanas de idade por peso e idade. Hospede os ratos em gaiolas ventiladas individualmente (IVC) em grupos de 5-6 ratos por gaiola.

2. Imunização de camundongos C57BL/6

1. IRBP_{1-20 -} Preparação de emulsão CFA
   NOTA: A preparação da emulsão é essencial para a reprodutibilidade e incidência da doença; como tal, todos os esforços devem ser feitos para manter a consistência durante todo o processo de preparação e entre os experimentos. Ao preparar a emulsão, a perda deve ser contabilizada nos cálculos de todos os reagentes de antemão. Essa perda pode ser de aproximadamente 1,5x (ou 50% a mais do volume preparado), com base no número de camundongos planejados para imunização. Veja o exemplo a seguir abaixo. Para imunizar 10 camundongos, prepare 15 camundongos e use 400 μg (peptídeo por 20 g de camundongo) x 15 camundongos = 6 mg. Cada rato deve receber 200 μL para imunização (3 ml no total). O volume final compreende uma proporção de 1:1 de solução peptídica e CFA, portanto, 1,5 mL de solução peptídica e 1,5 mL de CFA.
   1. Prepare todas as soluções estéreis em um gabinete de fluxo laminar usando técnicas assépticas.
   2. Pesar a quantidade desejada (400 μg por rato 20 g) de péptido liofilizado IRBP_1-20 humano (LAQGAYRTAVDLESLASQLT). Dissolva o peptídeo em 100% DMSO. Armazenar as existências na forma liofilizada a -20 °C.
      NOTA: Para garantir que o pó está totalmente dissolvido, cada floco deve fazer contato com o DMSO primeiro e não mostrar nenhum sinal de sólido residual. Adicione o PBS em pequenas porções para chegar ao volume final. Não misture com um vórtice, em vez disso, use agitação suave com uma pipeta. A concentração final de DMSO não deve exceder 1% do volume total de preparação peptídica. A preparação da emulsão em um tubo de plástico de 20 mL com fundo cônico deve permitir uma melhor acessibilidade do DMSO ao pó liofilizado.
   3. Adicionar solução peptídica DMSO-PBS a 1:1 v/v ao CFA, que já foi suplementado com 1,5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis morto, para dar uma concentração final de 2,5 mg/mL. Adicione gota a gota, pipetando suave e frequentemente para formar uma emulsão viscosa e uniformemente distribuída.
   4. Arejar a solução peptídica e CFA usando uma pipeta de 1000 μL (ajustada para 700 μL para evitar mais perdas) e pipeta para gerar uma consistência espessa cremosa. Esta técnica envolve o uso da pipeta para aspirar repetidamente para cima e para baixo até atingir a espessura desejada. Para obter os melhores resultados, certifique-se de que a solução antigénica e o adjuvante estão bem misturados antes da injeção.
2. Injeção intraperitoneal de toxina pertussis
   1. Suspender 1,5 μg de toxina Bordetella pertussis em 100 μL de meio RPMI 1640 suplementado com soro de rato a 1%¹¹.
   2. Realize a injeção i.p. com uma seringa estéril e agulha 23G.
      NOTA: A fim de evitar perturbações no local da injeção, a toxina pertussis deve ser administrada antes de injetar o antígeno.
   3. Transfira temporariamente cada rato para uma gaiola separada para receber uma única injeção i.p. de 100 μL de toxina Bordetella pertussis .
3. Injeção subcutânea de emulsão de IRBP
   1. Em seguida, injete a emulsão IRBP por via subcutânea. Este processo requer dois manipuladores de animais adequadamente vestidos com proteção de acordo com os regulamentos de saúde e segurança.
   2. Peça a uma pessoa treinada que contenha levemente o rato em cima da gaiola em uma posição semelhante a uma desgrenhada, com o estômago voltado para baixo, enquanto a outra pessoa treinada aperta a pele para formar uma estrutura semelhante a uma tenda na parte de trás do pescoço, onde a agulha pode ser inserida para encaixar entre o dedo e o polegar.
      CUIDADO: Existe o perigo de lesão por picada de agulha.
   3. Uma vez posicionada a agulha, injete 200 μL da emulsão IRBP. Ao remover a agulha, gire a cabeça da agulha para fechar a pele antes de puxar para fora e aplique pressão depois no local da injeção para evitar o refluxo da emulsão.
      CUIDADO: A emulsão não deve fazer contato com a pele ou pelo do rato, pois isso pode causar irritação e, em casos mais graves, uma lesão a se desenvolver. Se isso ocorrer, a área deve ser limpa imediatamente e completamente usando etanol a 70% e depois seca.
      NOTA: Se os gânglios linfáticos drenantes forem necessários para exame no final do estudo, o local de injeção será diferente. Neste caso, injete 100 μL em ambos os lados do flanco por via subcutânea. Isso gerará uma resposta mais forte nos gânglios linfáticos inguinais drenantes, que podem ser excisados no momento da colheita. No entanto, se o resultado pretendido for apenas desenvolver EAU, uma única injeção de 200 μL na parte de trás do pescoço é preferível para evitar o desconforto de vários locais de injeção.

3. Avaliação Clínica - Exame de Fundo de Camundongo

NOTA: A doença clínica deve ser pontuada usando o exame de fundo de olho, através de imagens ao vivo de campo brilhante usando um fundoscópio e o software Discover usado para visualização.

1. No início da doença (dia 12-14), ratos sedados sob anestesia geral usando uma combinação de cetamina (50 mg / mL) e Domitor (Medetomidina; 1 mg / mL). Diluir 1 parte Domitor; 1,5 partes de cetamina e 2,5 partes de água injetável estéril, em seguida, injetar 100 μL por 30 g por via intraperitoneal. Use seringas estéreis de 1 mL e agulhas 23G para a combinação de anestesia acima.
2. Depois disso, monitore o mouse para garantir que todos os reflexos sejam perdidos e que ele não responda aos estímulos.
3. Imediatamente após receber a injeção i.p. e enquanto o rato ainda estiver preso num scruff, aplique 1% de tropicamida e 2,5% de fenilefrina topicamente em cada olho para dilatação da pupila. Procure cobrir completamente a córnea com ambas as soluções dilatadoras. Pode levar alguns minutos até que a pupila esteja totalmente dilatada.
4. Depois, aplique generosamente no olho pomada viscolárfica e mantenha durante todo o processo de imagem, a fim de manter o olho totalmente lubrificado e hidratado.
5. Enquanto isso, abra o software (por exemplo, Discover) e defina o fundoscópio (por exemplo, Micron) para capturar imagens em campo brilhante. Aloque a cada mouse uma pasta individual e rotule as imagens com R ou L de acordo com cada olho fotografado.
6. Monte o mouse em um palco construído especificamente para visualização ao vivo e posicione o microscópio para acesso total à retina.
7. Para obter uma representação precisa da doença, tire imagens de toda a área da retina, cobrindo todos os cantos da periferia, além do disco óptico. Para conseguir isso, ajuste a ocular por toda parte. É crucial que o olho permaneça totalmente lubrificado em todos os momentos durante todo o processo de imagem; Certifique-se disso, completando a pomada ocular a uma taxa constante.
8. Consulte a secção 4 (abaixo) nesta fase para realizar angiografia com fluoresceína.
9. Uma vez que todas as imagens estejam completas, dilua o antissedação de reversão anestésica (5 mg/mL de Antissedã) em água injetável e administre a 0,1 mg/kg i.p. Devolva o rato a uma gaiola e coloque num tapete pré-aquecido com acesso a uma dieta molhada até à recuperação. A recuperação completa é caracterizada pelo movimento de todo o corpo e pela caminhada ao redor da gaiola com marcha constante, normalmente levando algumas horas.
10. No desfecho experimental designado (por exemplo, dia 21-23), repita as etapas 4.1-4.5 e tire fotografias de toda a área da retina novamente, cobrindo o disco óptico e todos os cantos da periferia para capturar uma representação precisa da doença.

4. Angiografia fluoresceína

1. Para medir o vazamento de vasos nesses animais, enquanto sob anestesia, dê a cada camundongo uma injeção de fluoresceína a 2% por via subcutânea na parte de trás do pescoço e posicione-a de modo que a retina seja centralizada no meio da imagem viva.
2. Ajuste o fundoscópio para um filtro de excitação de luz azul a 465-490 nm. A luz capturada da fluoresceína excitada está entre 520-530 nm.
3. Após 1,5 min após a injeção de fluoresceína, tire uma fotografia de cada retina e repita novamente aos 7 minutos.
   NOTA: O tempo é crítico para esses eventos, se não for possível capturar ambos, basta visualizar um olho.

5. Pontuação da Doença Clínica

1. Baseie a avaliação clínica na gravidade dos seguintes critérios: inflamação do disco óptico, manguito dos vasos da retina, infiltrado tecidual da retina e danos estruturais.
2. Atribua a cada um desses parâmetros uma pontuação em uma escala de 0 a 5 e o total coletivo é representativo da doença clínica para todo o olho, com uma pontuação máxima de 20 obteníveis por olho. A Tabela 1 pode ser utilizada como guia para os critérios de pontuação.

6. Histologia e Escore Histológico

1. Depois de eutanasiar os ratos por luxação cervical, enuclear os olhos valorizando as pálpebras separadas para facilitar o acesso a todo o olho.
2. Em seguida, coloque pinças curvas atrás do globo com a intenção de agarrar o tecido conjuntivo orbital e o nervo óptico. Tome cuidado para evitar espremer o globo.
3. Para fixação, coloque o olho em glutaraldeído a 4% por um mínimo de 15 minutos para minimizar o descolamento de retina e, em seguida, transfira para 10% de formaldeído por pelo menos 24 h. 1-2 mL de fixador daria volume suficiente para cobrir dois olhos.
4. Realize a incorporação em parafina, seccionando em um micrótomo e corando de acordo com os protocolos padrão. A espessura da seção de 3-4 μm é recomendada para qualquer tipo de coloração.
5. Realizar exame histológico dos olhos utilizando protocolos padrão para coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E).
6. Atribuir escores em uma escala de 0-4, de acordo com os critérios para pontuação EAU, com base na extensão da infiltração de células imunes dentro da retina e coroide, a ruptura das camadas da retina, o grau de formação de granuloma e a extensão do descolamento de retina, indicando danos na retina, conforme descrito anteriormente (Agarwal 2013) e resumido na Tabela 2¹¹.

Resultados

Neste protocolo, descrevemos um método passo-a-passo para induzir um modelo de uveíte autoimune experimental (EAU) imunizando camundongos com um peptídeo uveitogênico da retina derivado do IRBP. A avaliação da doença empregando abordagens amplamente utilizadas e prontamente acessíveis é abordada, embora estas não sejam exclusivas e possam ser adicionadas ou parcialmente substituídas por outras técnicas de imagem. Os primeiros sinais de EAU em camundongos C57BL/6J podem ser detectados duas semanas após a imunização e o pi...

Discussão

Modelos animais experimentais são ferramentas necessárias para o estudo da patogênese da doença e testes pré-clínicos de novos paradigmas terapêuticos. No protocolo atual, discutimos uma metodologia para induzir, monitorar e pontuar EAU, um modelo experimental de uveíte inflamatória intraocular. Esse modelo de EAU tem mais de 95% de incidência da doença quando todos os procedimentos são realizados de acordo com o protocolo aqui descrito, e resulta no desenvolvimento de EAU crônica e monofásica. Para atingir esse nível de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-sedan	ZOETIS, EUA		por acordar
Freund completo ' s Adjuvante; CFA	Sigma, UK	F5881	para imunização
Domitor	Orion Pharma, Finlândia		para anestesia
Fluoresceína	Sigma, Reino Unido	F2456	para angiografia
IRBP1-20	peptídeo de Chamberidge,		; antígeno
Cetamina	Orion Pharma, Finlândia		para anestesia
Micron III	Phoenix Research, EUA		para fundoscopia
Soro	de camundongo Sigma, Reino Unido	M5905	para imunização
Mycobacterium terberculosis	Sigma, Reino Unido	344289	para imunização
Toxina Sigma para Coqueluche	, UK	P2980	para imunização
cloridrato de fenilefrina 2,5%	Bausch & Lomb Reino Unido	PHEN25	para dilatação
Tropicamida 1%	SANDOZ		para dilatação
Farmácia Viscotears	WELDRICKS, Reino Unido	2082642	para lubrificação ocular