Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Resumo

A captura dos processos dinâmicos de replicação e montagem de vírus tem sido dificultada pela falta de tecnologias robustas de hibridização in situ (ISH) que permitam a marcação sensível e simultânea de ácidos nucleicos virais e proteínas. Os métodos convencionais de hibridização in situ por fluorescência de DNA (FISH) muitas vezes não são compatíveis com a imunocoloração. Portanto, desenvolvemos uma abordagem de imagem, MICDDRP (multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA e proteína), que permite a visualização simultânea de uma única célula de DNA, RNA e proteína. Em comparação com o DNA FISH CONVENCIONAL, O MICDDRP utiliza a tecnologia ISH de DNA ramificado (bDNA), que melhora drasticamente a sensibilidade e a detecção da sonda de oligonucleotídeos. Pequenas modificações do MICDDRP permitem a obtenção de imagens de proteínas virais concomitantemente com ácidos nucleicos (RNA ou DNA) de diferentes filamentosidades. Aplicamos esses protocolos para estudar os ciclos de vida de múltiplos patógenos virais, incluindo o vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, o vírus linfotrópico T humano (HTLV)-1, o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV), o vírus Zika (ZKV) e o vírus influenza A (IAV). Demonstramos que podemos rotular eficientemente ácidos nucleicos virais e proteínas em uma gama diversificada de vírus. Esses estudos podem nos fornecer uma melhor compreensão mecanicista de múltiplos sistemas virais e, além disso, servir como um modelo para a aplicação de imagens de fluorescência multiplexada de DNA, RNA e proteína em um amplo espectro de sistemas celulares.

Introdução

Embora milhares de anticorpos comerciais estejam disponíveis para marcar especificamente proteínas por meio de abordagens convencionais de imunocoloração, e enquanto as proteínas de fusão possam ser projetadas com tags fluorescentes foto-otimizadas para rastrear múltiplas proteínas em uma amostra¹, a visualização microscópica da proteína muitas vezes não é compatível com a hibridização in situ convencional por fluorescência de DNA (FISH)² . Limitações técnicas na visualização simultânea de DNA, RNA e proteína usando abordagens baseadas em fluorescência têm dificultado a compreensão aprofundada da replicação do vírus. O rastreamento do ácido nucleico viral e da proteína durante o curso da infecção permite que os virologistas visualizem processos fundamentais que fundamentam a replicação e a montagem do vírus 3,4,5,6.

Desenvolvemos uma abordagem de imagem, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and Protein (MICDDRP)³, que utiliza tecnologia in situ de DNA ramificado (bDNA) para melhorar a sensibilidade da detecção de ácido nucleico 7,8,9 . Além disso, esse método utiliza sondas emparelhadas para maior especificidade. As sondas específicas da sequência bDNA usam DNAs pré-amplificadores e amplificadores ramificados para produzir um sinal intenso e localizado, melhorando os métodos de hibridização anteriores que dependiam da segmentação de regiões repetidas no DNA⁹. As células infectadas em um contexto clínico muitas vezes não contêm material genético viral abundante, fornecendo uma mercadoria para um método sensível para a detecção de ácido nucleico fluorescente em ambientes de diagnóstico. A comercialização da tecnologia bDNA por meio de abordagens como o RNAscope⁷ e o ViewRNA¹⁰ preencheram esse nicho. A sensibilidade da imagem de fluorescência de bDNA também tem importante utilidade na biologia celular, permitindo a detecção de espécies escassas de ácidos nucleicos em modelos de cultura celular. A grande melhoria da sensibilidade torna os métodos de imagem baseados em bDNA adequados para o estudo de vírus. Uma deficiência potencial, no entanto, é que esses métodos se concentram na visualização de RNA ou RNA e proteína. Todas as células replicantes e muitos vírus têm genomas de DNA ou formam DNA durante seu ciclo de replicação, tornando os métodos capazes de visualizar tanto o RNA quanto o DNA, bem como proteínas, altamente desejáveis.

No protocolo MICDDRP, realizamos o bDNA FISH para detecção de ácido nucleico viral pelo método RNAscope, com modificações⁷. Uma das principais modificações deste protocolo é a otimização do tratamento com protease após a fixação química. O tratamento com protease facilita a remoção de proteínas ligadas ao ácido nucleico para melhorar a eficiência da hibridização da sonda. O tratamento com protease é seguido de incubação com sonda(s) de oligonucleotídeos ramificados. Após a aplicação da(s) sonda(s) de bDNA, as amostras são lavadas e subsequentemente incubadas com DNAs pré-amplificadores e amplificadores de sinal. A hibridização in situ multiplexada (ISH), marcação de múltiplos alvos gênicos, requer sondas alvo com diferentes canais de cor para diferenciação espectral⁷. A incubação com amplificadores de DNA é seguida por imunofluorescência (FI).

O bDNA ISH proporciona melhorias no sinal-ruído pela amplificação de sinais específicos do alvo, com redução do ruído de fundo a partir de eventos de hibridização não específicos ^7,11. As sondas alvo são projetadas usando programas de software disponíveis publicamente que predizem a probabilidade de eventos de hibridização não específicos, bem como calculam a temperatura de fusão (T_m) do híbrido sonda-alvo ^7,11. As sondas alvo contêm uma região de 18 a 25 bases complementar à sequência de DNA/RNA alvo, uma sequência espaçadora e uma sequência de cauda de 14 bases. Um par de sondas de destino, cada uma com uma sequência de cauda distinta, hibridizam para uma região de destino (abrangendo ~ 50 bases). As duas sequências de cauda formam um local de hibridização para as sondas pré-amplificadoras, que contêm 20 locais de ligação para as sondas amplificadoras, que, além disso, contêm 20 locais de ligação para a sonda de etiqueta. Como exemplo, uma região de uma quilobase (kb) na molécula de ácido nucleico é alvo de 20 pares de sondas, criando um andaime molecular para hibridização sequencial com o pré-amplificador, amplificador e sonda de rótulo. Isso pode, portanto, levar a um rendimento teórico de 8000 rótulos fluorescentes por molécula de ácido nucleico, permitindo a detecção de moléculas individuais e grandes melhorias em relação às abordagens convencionais do FISH⁷ (Veja a Figura 1A para o esquema da amplificação do sinal de bDNA). Para configurar testes para ISH multiplexado, cada teste de destino deve estar em um canal de cor diferente (C1, C2 ou C3). Essas sondas alvo com diferentes canais de cores possuem sequências de cauda distintas de 14 bases. Essas sequências de cauda ligarão amplificadores de sinal distintos com diferentes sondas fluorescentes, permitindo assim uma diferenciação espectral fácil em vários alvos. No Protocolo apresentado, a Tabela 4 da Etapa 9, fornece mais informações sobre as sondas alvo de marcação fluorescente. Além disso, a Figura 2 e a Figura 3 fornecem exemplos de como escolhemos o amplificador 4-FL (A, B ou C) apropriado (sonda fluorescente e a etapa final de hibridização) para alcançar a marcação fluorescente específica de múltiplos alvos de ácidos nucleicos virais após infecções por HIV-1 e HTLV-1.

Temos demonstrado diversas aplicações de visualização simultânea por fluorescência de RNA, DNA e proteínas, observando estágios críticos de replicação do vírus com alta resolução espaço-temporal ^3,4,5. Por exemplo, a visualização simultânea de uma única célula do RNA viral, do DNA citoplasmático e nuclear e da proteína nos permitiu visualizar os principais eventos durante a infecção pelo HIV-1, incluindo o acompanhamento de núcleos contendo RNA no citoplasma antes da entrada nuclear e da integração do DNA proviral³. Além disso, aplicamos a MICDDRP para caracterizar os efeitos dos fatores do hospedeiro e do tratamento medicamentoso na infecção e replicação viral ^4,5. Em Ukah et al., rastreamos a reativação da transcrição do HIV-1 em modelos de células de latência tratados com diferentes agentes de reversão de latência para visualizar a transcrição e a reversão de latência do HIV⁴. Além disso, o MICDDRP pode nos permitir visualizar alterações fenotípicas associadas à inibição antiviral atribuída ao tratamento de pequenas moléculas ou à restrição do fator hospedeiro. Como prova de conceito da robustez e ampla aplicabilidade de nossa abordagem, demonstramos que podemos usar modificações de nosso protocolo para rotular eficientemente o ácido nucleico viral para acompanhar a infecção não apenas no vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, mas também no vírus linfotrópico T humano (HTLV)-1, vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), Zika vírus (ZIKV) e vírus influenza A (IAV). Como o ciclo de vida do HIV-1 consiste em espécies de DNA viral e RNA, realizamos a maior parte de nossa otimização do MICDDRP após a cinética de replicação do HIV-1. No entanto, além disso, demonstramos que podemos rastrear a síntese de diferentes transcritos de RNA viral de uma ou ambas as cadeias de sentido (+) e antisense (-) em vírus como ZIKV, IAV, HBV e HCV para monitorar a transcrição e replicação viral 3,4,5,6. Os estudos visam melhorar a compreensão mecanicista de vários processos virais e servir como uma diretriz para implementar essa tecnologia de imagem de fluorescência para uma ampla gama de modelos celulares.

Protocolo

1. Células de sementes (Suspensão vs. Células Aderentes) em lâminas de cobertura ou de câmara (protocolo apresentado utiliza lâminas de cobertura).

1. Semeadura de células de suspensão
   1. Prepare as coberturas revestidas com poli-D-lisina (PDL) (facilita a aderência das células de suspensão à tampa) incubando primeiro as folhas de cobertura em etanol (EtOH) por 5 minutos (esteriliza as folhas de cobertura e remove qualquer resíduo). Em seguida, lave 2x em solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de incubar as coberturas em PDL (20 μg/mL) por 30 minutos (min) à temperatura ambiente (RT).
   2. Remova o PDL e lave 2x em PBS. Células de pellets (previamente infectadas/tratadas com base nas condições de imagem desejadas) e ressuspender 10⁶células em 50 μL de PBS. Spot 50 μL de células em vidro (revestido de PDL) e incubar em RT por 30 min.
2. Semeadura de células aderentes
   1. Células de cultura em coverslip estéril colocadas em prato de 6 poços e infectam células com partículas virais ou tratam com composto de interesse. Permita que as células atinjam 50-70% de confluência antes da preparação da amostra para experimentos de imagem.

2. Fixação celular: Preservar a morfologia celular para estudos de imagem de fluorescência

NOTA: Mantenha 4% de PFA e PBS no RT por pelo menos 30 minutos antes da fixação celular.

1. Aspirar o meio celular, lavar as células em folhas de cobertura 3x em PBS e fixar as células em paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 min. Aspirar PFA e células de lavagem em PBS 2x.
   NOTA: As células agora podem ser desidratadas e armazenadas, se o experimentador desejar retomar o experimento em outra data. As células fixas podem ser desidratadas em EtOH antes do armazenamento.
   1. Remova o PBS após a lavagem após a fixação celular e substitua por 500 μL de 50% de EtOH (v/v em água). Incubar no RT por 5 min.
   2. Remova 50% de EtOH e substitua por 500 μL de 70% de EtOH. Incubar no RT por 5 min.
   3. Remova 70% de EtOH e substitua por 500 μL de 100% de EtOH. Incubar no RT por 5 min.
   4. Retire 100% EtOH e substitua por 100% EtOH fresco.
      NOTA: As células desidratadas podem ser armazenadas a -20 °C durante 6 meses. Sele as placas com fita adesiva ou parafilme antes do armazenamento para evitar a evaporação do EtOH.
   5. Reidratar as células para passar para a marcação de fluorescência multiplexada de células/vírus.
   6. Remova 100% de EtOH e substitua por 500 μL de 70% de EtOH. Incubar em RT por 2 min.
      NOTA: Não deixe as células secarem a qualquer momento. Sempre use solução suficiente para submergir todas as células.
   7. Remova 70% de EtOH e substitua por 500 μL de 50% de EtOH. Incubar em RT por 2 min.
   8. Remova 50% de EtOH e substitua por 1x PBS.
      NOTA: Prepare a diluição da protease, as sondas de hibridização e o tampão de lavagem antes do tratamento da protease (Etapa 4) e da aplicação da sonda alvo (Etapa 5). Instruções específicas sobre a preparação de reagentes são apresentadas no início de cada etapa respectiva.

Reagentes	Outras Notas
Solução de protease	Preparar em 1X PBS
Sonda(s) de oligonucletodie alvo	Diluir em tampão de hibridização
Protetor de lavagem	Lavagens seguindo as etapas de hibridização de destino
Buffer de hibridização	Receita apresentada na Tabela 3

Tabela 1: Principais reagentes no protocolo MICDDRP.

3. Permeabilização celular: Aumenta o acesso às organelas celulares e celulares para a entrada de moléculas grandes (anticorpos, sondas de hibridização de ácido nucleico)

1. Remova 1x PBS após fixação ou reidratação celular e substitua por 500 μL de 0,1% (v/v) de Tween-20 em 1x PBS. Incubar no RT por 10 min. Substitua um por um. Lave uma vez com 500 μL de 1x PBS e adicione 1x PBS fresco.

4. Imobilização de deslizamento de cobertura em lâmina de vidro e tratamento com protease para remover proteínas de ligação ao ácido nucleico do ácido nucleico viral fixo / celular para melhorar a eficiência da hibridização

NOTA: Preparar a solução diluída de Protease III (ver especificidades do reagente na Tabela de Materiais) durante a permeabilização celular. Deixe a protease atingir o TR por 10 min antes da permeabilização.

1. Coloque uma pequena gota de esmalte em uma lâmina de vidro esterilizada. Seque as costas (lado sem camada celular) e coloque a borda da tampa na gota de esmalte, com o lado com as células aderidas voltadas para cima. Adicione algumas gotas de PBS na tampa imobilizada para evitar a secagem.
   1. Desenhe um círculo (a cerca de 3 mm de distância da tampa) em torno do perímetro da tampa agora aderida à lâmina usando caneta de barreira hidrofóbica (caneta repelente de água que mantém os reagentes localizados nas células).
2. Protease III diluída em 1x PBS (100 μL/deslizamento de cobertura).
   NOTA: A concentração de protease pode precisar ser ajustada dependendo das diferenças nos tipos de células, sondas ou ácido(s) nucleico(s) alvo(s) por meio de otimização empírica (Ver Discussão). Para a marcação de RNA/DNA mais eficiente em diferentes sistemas virais, tivemos sucesso com as seguintes diluições apresentadas na Tabela 2 abaixo, com diluições variando de (1 a 2 )-(1 a 15) (protease a 1x PBS).

Alvos da sonda	Diluição de Protease em PBS 1X (Protease III a 1X PBS)
HIV-1 DNA/RNA	1 a 5
HTLV-1 DNA/RNA	1 a 5
PgRNA do VHB e ARN total do VHB	1 a 15 anos
IAV RNA	1 a 15 anos
ZIKV RNA	1 a 2

Tabela 2: Diluições de protease III em PBS para hibridização de ácidos nucleicos virais.

3. Decantar o PBS 1x na folha de cobertura após a imobilização e aplicar a Protease III diluída.
4. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 15 min.
5. Solução de protease decantante e lâminas submersas em 1x PBS. Agite com um prato de balanço por 2 min no RT. Repita a lavagem com 1x PBS novo.
   1. Para apenas detecção de DNA, lave as amostras três vezes com água livre de nuclease por 2 min cada, seguida de incubação com 5 mg/mL de RNase A diluída em PBS por 30 min a 37 °C.
   2. Decant RNase A solução, e lavar 3x por 2 min com água ultrapura. Continue com o ISH da(s) sonda(s) de destino.
      NOTA: O tampão de hibridização melhora a detecção de vDNA sem afetar a eficiência da coloração de vRNA para os resultados apresentados (Resultados Representativos). Sondas diluídas de DNA Channel 1 (C1) 1:1 com sonda de hibridização. Sondas de RNA C2 e C3 diluídas em tampão de hibridização. As sondas C2 e C3 utilizadas em nossos estudos de imagem estão em soluções 50X (1:50; sonda alvo para tampão de hibridização).
6. Prepare o tampão de hibridização em água livre de nuclease seguindo o procedimento passo-a-passo abaixo:
   1. Em um tubo de 15 mL, adicione 700 μL de água livre de nuclease, 300 μL de sulfato de dextrano a 50% [peso/volume (p/v)], 300 μL de NaCl 5 M, 125 μL de citrato de sódio 200 mM (pH 6,2) e 375 mg (pó) de carbonato de etileno.
   2. Misture bem usando um vórtice para dissolver o carbonato de etileno (certifique-se de que todo o pó esteja dissolvido e a solução clara).
   3. Adicionar 25 μL de 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 e água isenta de nuclease suficiente para completar 2,5 mL (solução 2x).
      NOTA: A receita para o buffer de hibridização apresentado pode ser encontrada na Tabela 3 abaixo. A solução é estável por uma semana. Assegure a mistura suficiente de detergente Tween-20, tendo o cuidado de evitar o borbulhamento da solução.

Reagente	Concentração de Estoque	Notas adicionais
Água isenta de nuclease	NA
Sulfato de dextrano	50% (p/v)	Muito viscoso
Cloreto de sódio	5 milh
Citrato de sódio (pH 6,2)	200 mM	Conservar a 4 °C
Carbonato de etileno	NA	Pó
Interpolação-20	10% (v/v)

Tabela 3: Lista tampão de hibridização de reagentes.

5. Incubação com sondas de hibridização alvo de DNA/RNA: As sondas de oligonucleotídeos alvo se ligam a(s) região(ões) de interesse, criando um andaime molecular para pré-amplificadores, amplificadores e sondas fluorescentes se ligarem.

NOTA: Sondas quentes de DNA/RNA a 40 °C por 10 min (durante a permeabilização celular) e esfriam até RT por pelo menos 10 min, se nenhum tratamento com RNase estiver incluído. Se o tratamento com RNase ou tratamento adicional com amostras for necessário antes da hibridização da sonda alvo, aqueça as sondas de acordo. Gire as sondas C2 e C3 após o aquecimento e dilua em tampão de hibridização. Após a diluição, as sondas C2 e C3 podem ser brevemente aquecidas. Aquecer o tampão de lavagem de 50x (ver Tabela de Materiais para mais detalhes) a 40 °C durante 10-20 min e diluir a 1x em água de grau de biologia molecular.

1. Incubar 200 μL do tampão de hibridização a 67 °C durante 10 min antes da adição da(s) sonda(s) de hibridização. Sonda diluída em tampão de hibridização (receita listada na Tabela 2). Adicionar 50 μL/tampa.
2. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 2 horas (h). Sondas decantadas e lâminas submergem em buffer de lavagem 1x. Agite agitando o prato por 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.

6. Hibridização do amplificador (Amp) 1-FL: Adição de pré-amplificador que é complementar à sequência de cauda das sondas de DNA/RNA alvo (Passo 5)

NOTA: Os amplificadores devem estar em RT antes do uso. Retire cada amplificador individual da geladeira 30 min antes do uso e deixe no banco no RT.

1. Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
2. Adicione 1 gota de Amp 1-FL na folha de cobertura. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 30 min.
3. Decantar Amp 1-FL e submergir em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.

7. Hibridização Amp 2-FL: Incubação com amplificador de sinal com sequência de reconhecimento cognato para pré-amplificadores (Amp 1-FL)

1. Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
2. Adicione 1 gota de Amp 2-FL na tampa. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 15 min.
3. Decantar Amp 2-FL e submergir em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.

8. Hibridização Amp 3-FL: Incubação com segundo amplificador de sinal

1. Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
2. Adicione 1 gota de Amp 3-FL na folha de cobertura. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 30 min.
3. Decantar Amp 3-FL e submergir em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x.

9. Hibridização Amp 4-FL: Etiqueta fluorescente e etapa final de hibridização

NOTA: Primeiro, consulte a Tabela 4 para escolher o Amp 4 (A, B ou C) - FL adequado com base nos canais da(s) sonda(s) de destino. Avalie qual Amp 4-FL é necessário para rotular o DNA/RNA de interesse. Um exemplo é fornecido pela tabela abaixo:

	Um	B	C
DNA Canal 1 (C1)	488	550	550
DNA/RNA Canal 2 (C2)	550	488	647
RNA Canal 3 (C3)	647	647	488

Tabela 4: Seleção da sonda fluorescente Amp 4 (A, B ou C)-FL para ISH multiplexada.

NOTA: Para FISH multiplexado (vários alvos), escolher o Amp 4 (A, B ou C) FL correto é fundamental para rotular adequadamente o(s) seu(s) alvo(s) de interesse(s). As sondas de destino (Etapa 5) têm diferentes canais de cores (C1, C2 ou C3), que ditam sua respectiva etiqueta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 ou Alexa 647), com base no Amp 4-FL escolhido. Exemplos de escolha de combinações de fluoróforos para imagens multiplexadas são fornecidos nas legendas da Figura 2 e da Figura 3. Como exemplo adicional, a seleção de Amp 4B-FL rotulará seletivamente sondas de DNA C1 com Atto 550 e sondas de RNA C3 com Alexa 647.

1. Remova as lâminas do tampão de lavagem 1x e toque/absorva para remover o excesso de líquido.
2. Adicione 1 gota de Amp 4-FL na folha de cobertura. Incubar em estufa humidificada a 40 °C durante 15 min.
   NOTA: Seguindo a etapa 9.2, mantenha as amostras cobertas, protegidas da luz.
3. Decante o amplificador 4-FL e submerja em 1x tampão de lavagem. Agite agitando o prato por 2 min no RT. Repita a lavagem com o novo tampão de lavagem 1x. Lave com 1x PBS (2 min) e guarde em PBS.

10. Imunocoloração de proteínas: Para rotular proteína(s) de interesse

1. Decantar PBS e adicionar 200 μL de tampão de bloqueio (1% p/v BSA, 10% v/v FBS em PBS com 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) à folha de cobertura. Incubar 1 h no RT.
2. Buffer bloqueador decantante e aplicar 200 μL de anticorpo primário diluído em PBST + 1% p/v BSA. Incubar 1 h no RT.
3. Lave a lâmina duas vezes com PBST por 10 min no RT com agitação.
4. Aplicar anticorpo secundário de escolha por 1 h no TR em PBST + 1% p/v ASC.
5. Lave a lâmina com PBST por 10 min no RT com agitação.

11. Coloração nuclear: Núcleos de contra-coloração após imunocoloração

1. Decant PBST e aplicar DAPI ou mancha nuclear de escolha por 1 min no RT.
2. Lave a lâmina duas vezes com PBS por 10 min no RT com agitação.

12. Montagem

1. Coloque 1 gota de solução antifade (por exemplo, Prolong Gold) em uma nova lâmina de vidro estéril (Primeiro, limpe a lâmina com EtOH e deixe secar para garantir que nenhum resíduo esteja no vidro). Com a mesma ponta, espalhe a gota da solução antifade para cobrir uma área aproximadamente do tamanho da tampa.
   NOTA: A solução antifade é muito viscosa e pode ser difícil de pipetar. Cortar a ponta de uma ponta de 200 μL antes da pipetagem pode mitigar esses problemas.
2. Remova a folha de cobertura com a amostra de célula da lâmina e submerja no PBS para remover o esmalte residual na parte de trás usando a pinça e o PBS. Pinça seca e parte de trás da tampa usando um Kimwipe.
3. Suavemente embutir coverslip na gota de solução antifade, colocando o lado da amostra (lado com camada celular) de coverslip na gota).
4. Deixe as amostras secarem durante a noite.

13. Imagens

1. Imagem com microscópio epifluorescente.

Resultados

Um esquema de MICDDRP é representado na Figura 1. A marcação do DNA e do RNA é seguida por imunocoloração. O uso de amplificadores ramificados aumenta o sinal, permitindo a detecção de moléculas únicas de ácido nucleico.

Figura 1: Esquema do MICDDRP e fluxo de trabalho passo a passo. (A) O sinal de bDNA é amplificado at...

Discussão

A visualização simultânea de RNA, DNA e proteína geralmente requer otimização extensiva. Dois métodos comumente usados são a marcação de 5-etil-2-desoxiuridina (EdU) e DNA FISH. A marcação EdU tem sido aplicada para visualizar o DNA viral e a proteína simultaneamente, já que a EdU é incorporada no DNA nascente e, posteriormente, marcada com corantes fluorescentes contendo azida por meio da química click. A marcação EdU pode, portanto, ser usada para monitorar a cinética de replicação de vírus nativos de vírus de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% PFA
50% sulfato de dextrano	Amreso	198	Para tampão de hibridização de DNA
50X tampão de lavagem	ACD Bio	320058
placas de 6 poços
Amplificador 1-FL	ACD Bio
Amplificador 2-FL	ACD Bio
Amplificador 3-FL	ACD
Amplificador 4-FL	ACD Bio		Consulte a tabela Amp-4 no protocolo
Anti-HCV NS5a anticorpo	Abcam	ab13833	Monoclonal de camundongo; funciona com genótipos 1a, 1b, 3 e 4 do HCV
Anti-HIV-1 p24 anticorpo monoclonal	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 anticorpo	Abcam	ab80613	Coelho policlonal
Anticorpo anti-PB1	GeneTex	GTX125923	Anticorpo contra a proteína da gripe
Albumina			Reagente de bloqueio para imunocoloração
Meios celulares com suplementos			Meios apropriados
			Lamínulas
DAPI	ACD Bio		Coloração nuclear (kit RNAscope da ACD Bio)
Dulbecco's phosphate tampoed salina (1X PBS)	Gibco	14190250	Sem cálcio e magnésio
Carbonato de etileno	Sigma	E26258
Soro fetal bovino (FBS)			Use FBS específico com base no que o anticorpo secundário de soro foi criado (por exemplo, FBS de cabra)
Colorfrost da marca FisherLâminas de microscópio	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Pré-limpo
Sonda HCV-GT2a-sense-C2	ACD Bio	441371	HCV(+) sonda de RNA de detecção
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	sonda de cDNA HIV-1
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	Sonda de RNA HIV-1 Forno
hibridização HybEZ	ACD Bio	321710/321720
Caneta de barreira hidrofóbica ImmEdge	Vector Laboratories	H-4000
Esmalte			Para immobolizar lamínula para deslizar antes do tratamento com protease
Água livre de nuclease	Ambion	AM9937
Poli-d-lisina (PDL)			Revestimento de lamínulas em 20 µ g/mL de PDL por 30 minutos
Diluente de sonda	ACD Bio	300041	Para diluir sondas de RNA C2 ou C3
Prolongar o antifade de ouro	Invitrogen	P36930
Protease III	ACD Bio	322337
RNAscope®   Sonda- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
Anticorpos
secundários Lâminas
Cloreto			Para tampão de hibridização de DNA
Citrato de sódio, pH 6,2			Para tampão de hibridização de DNA
Tween-20			Para tampão de hibridização de DNA e PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	Sonda de pgRNA HBV
Sonda V-HCV-GT2a	ACD Bio	441361	HCV(-) sonda de RNA
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sonda de RNA de detecção direcionada HBZ
Sonda de DN V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 Sonda de DNA
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sonda de RNA de detecção
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	Sonda de RNA IAV
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Sonda de RNA de detecção de Zika(+)
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	RNA de detecção de Zika(-) sondar