En forbedret analyse og verktøy for måling av mekanisk nociception i Drosophila Larver

Summary

Målet med denne protokollen er å vise hvordan man utfører en forbedret analyse for mekanisk nociception i Drosophila larver. Vi bruker analysen her for å demonstrere at mekanisk overfølsomhet (allodynia og hyperalgesi) eksisterer i Drosophila larver.

Abstract

Publiserte analyser for mekanisk nociception i Drosophila har ført til variable vurderinger av atferd. Her fabrikkerte vi, for bruk med Drosophila larver, tilpassede metall nikkel-titanlegering (nitinol) filamenter. Disse mekaniske sondene ligner på von Frey-filamentene som brukes i virveldyr for å måle mekanisk nociception. Her viser vi hvordan du lager og kalibrerer disse mekaniske sondene og hvordan du genererer en full atferdsdoserespons fra subthreshold (uskyldig eller ikke-skadelig område) for å suprathreshold (lav til høy skadelig rekkevidde) stimuli. For å demonstrere nytten av sondene undersøkte vi vevsskadeindusert overfølsomhet i Drosophila larver. Mekaniske allodynia (overfølsomhet overfor en normalt uskyldig mekanisk stimulans) og hyperalgesi (overdrevet respons på en skadelig mekanisk stimulans) er ennå ikke etablert i Drosophila larver. Ved hjelp av mekaniske sonder som normalt er uskyldige eller sonder som vanligvis fremkaller en aversiv oppførsel, fant vi at Drosophila larver utvikler mekanisk hypersenssibilisering (både allodynia og hyperalgesi) etter vevsskade. Dermed vil de mekaniske sondene og analysene som vi illustrerer her sannsynligvis være viktige verktøy for å dissekere de grunnleggende molekylære / genetiske mekanismene for mekanisk overfølsomhet.

Introduction

Drosophila larver viser en karakteristisk aversiv rullende oppførsel når de utsettes for forskjellige skadelige stimuli: termisk^{1,mekanisk 2}og kjemisk³. Denne virkemåten er tydelig forskjellig fra normal bevegelse. Her beskriver vi en forbedret mekanisk analyse som kan brukes til å vurdere mekanisk nociception og mekanisk sensibilisering.

I en fersk studie fabrikkerte vi von Frey-lignende filamenter ved hjelp av nitinolledninger⁴. Prober som utøver forskjellige krefter og trykk ble gjort ved å variere lengdene og diameteren på nitinolledningene som danner hver sonde. Mekaniske prober ble kalibrert og de målte kraftverdiene (i millinewton, mN) ble konvertert til trykk (kilopascal, kPa), basert på spissen av hver sonde⁴. Tilpasset fabrikasjon av mekaniske sonder tillatt for oss å generere subthreshold (≤200 kPa) til suprathreshold (225 kPa til 5318 kPa) trykk, som i prinsippet kan være gunstig for å studere mekanisk overfølsomhet. Ved hjelp av disse forbedrede mekaniske von Frey-lignende filamenter viste vi at trykk⁴, i motsetning til den tidligere undersøkte kraften^2,5,6 korrelerer mer konsekvent med aversiv atferdsrespons i Drosophila larver. Den forbedrede mekaniske analysen beskrevet her bidro også til å identifisere en bevart vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF)-relatert reseptor tyrosin kinase signaliserer en vei som regulerer mekanisk nociception hos fluer og rotter⁴.

Mekanisk allodynia og hyperalgesi, to modaliteter av overfølsomhet, er relativt understudert i Drosophila larver, sammenlignet med termisk (varme og kulde) og kjemiske sensoriske modaliteter^3,7,8,9,10. Dette skyldes sannsynligvis mangelen på spesifikke mekaniske sonder som spenner fra uskyldige stimuli til det høye skadelige^{området 2,5,6}. En normalt uskyldig stimulans som fremkaller den typiske aversive rullende oppførselen etter Drosophila larver opplever vevsskade^3,7 kalles allodynia. En overdrevet rullende respons på en typisk skadelig stimulans er kjent som hyperalgesi⁷. Skadelige stimuli er definert som de som fremkaller vevsskade og kan aktivere nociceptors¹¹. Skadelige stimuli levert til Drosophila larver skader enten barriereeppidermis, perifere nociceptive sensoriske nevroner^3,4,7eller begge deler.

I denne artikkelen demonstrerer vi hvordan du tilpasser diktering og kalibrerer von Frey-lignende mekaniske sonder som passer for Drosophila larver. Videre viser vi hvordan du bruker disse sondene til å analysere mekaniske nociceptive responser i Drosophila larver. Til slutt demonstrerer vi ytterligere nytten av disse sondene ved å bruke dem til å demonstrere tilstedeværelsen av mekanisk overfølsomhet, både allodynia og hyperalgesi, etter vevsskade i Drosophila larver (se Representative Results).

Protocol

1. Mekanisk sonde konstruksjon

1. Klipp hver nitinolfilament (figur 1B), vinkelrett på den lange aksen, til den angitte lengden (figur 1M–N) ved hjelp av en liten trådkutter (figur 1C). Filamentene kommer i tre forskjellige forhåndsinnsettede diametre (figur 1B).
   MERK: Lengdene som er angitt her er en veiledning for å oppnå det omtrentlige trykket som er angitt, ved hjelp av en lignende protokoll for bygging av braketten. Til syvende og sist, uavhengig av lengden på filamentkuttet, og dybden av hullet i braketten, må filamentene måles/kalibreres på en balanse for å oppnå den nøyaktige kraft-/trykkverdien.
2. Undersøk spissen av filamentet under et stereomikroskop for å sikre at ingen skarpe eller uregelmessige kanter forblir, da disse kan forårsake vevsskade på larvenes hud og forstyrre kalibreringen.
3. Jevn ut de skarpe kantene på den mekaniske proben manuelt ved hjelp av en slipestein til ingen skarpe uregelmessigheter vedvarer (figur 1D).
4. Lag et hull mot enden av en trepopsiclepinne (figur 1E) ved hjelp av en hypodermisk nål (se Materialtabell). Sett nålen minst halvveis gjennom høyden på ispinnen (figur 1E). Dette skaper et kammer for innsetting av nitinolfilamentet.
5. Påfør trelim på en enkelt nitinolfilament (figur 1F) og sett limbelagt filament inn i nålesporet i en trepopsiclepinne (figur 1G). La det tørke i ~5 timer.
6. Kalibrer hver mekaniske sonde ved å trykke den mot en skala til den mekaniske sonden bøyer seg (figur 1H–L). Dette er poenget med maksimal kraft som kan registreres i gram. Avhengig av filamentdiameter (forhåndsinnsett) og lengder (brukerbestemt) kan et komplett spekter av krefter og trykk genereres.
7. Konverter massen som er registrert i trinn 1.6 for å tvinge i millinewton (mN) ved hjelp av formelen f = ma (Kraften er lik massemultert med gravitasjonsakselerasjon). f: kraft; m: masse; a: gravitasjonsakselerasjon (9,8 m/s²) (Figur 1M).
8. Til slutt konverterer du den beregnede kraften til trykk (kraft/areal) i kilopascal (kPa) ved å dele den målte kraften etter overflatearealet på filamentspissen (figur 1M). For å beregne området, konvertere diameteren på de forskjellige nitinol filamenter fra inches (0,04 ", 0,06", og 0,08 ") til centimeter. Deretter bestemmer πr² (hvor, r = nitinolfilamentradiusen) området (se figur 1M). Klargjøring av flere sonder ved hjelp av filamenter med forskjellige diametre og lengder vil generere et komplett sett som strekker seg over det responsive området for Drosophila larver (prøvesett vist i figur 1N).
   MERK: Kontroller hver mekaniske sonde minst hver 3.–4. Når trykket avviker med mer enn ± 3% fra det opprinnelige tiltaket, må en ny mekanisk sonde fremstilles.

2. Forberedelse av larver

1. Øk kontrollstammen (w¹¹¹⁸) larveavkom eller larver som inneholder transgenene ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (for visualisering av skade på sensoriske nevroner) på standardmat i en 25 °C inkubator. Vanligvis vedlikeholdes bestandene rutinemessig ved 18 °C, men både foreldre og larveavkom er oppdratt ved 25 °C på standard maismelmat for eksperimenter.
   MERK: Voksne fluer (fem menn og ti kvinner, 1:2-forhold) holdes i flyhullene, for å tillate egglegging, i ca 24 timer. Tiden etter egglegging (AEL) begynner fra når de voksne fjernes.
2. Samle den tredje instar larver, etter ca 96 h egg legging, ved forsiktig spruter vann fra springen inn i myk fly mat som inneholder larver. Vandrende larver som har forlatt maten, eller som har everted fremre eller bakre spirakler, er for store / gamle for denne analysen. Andre instar larver (~ mindre enn 4 mm i lengde) er for små.
3. Hell ut innholdet i den myke flymaten i en ren standard størrelse Petriskål (100 mm x 15 mm).
4. Ved hjelp av tang, sorter midt tredjedel instar, mellomstore larver (se figur 2A) fra mindre (andre instar og tidlig tredje instar) eller større (sent eller vandrende tredje instar) larver. Mild manipulasjon med tang for å unngå vevsskade på larver anbefales.
   MERK: Overføringen ved hjelp av tang er hovedsakelig basert på vannspenning og ikke ved å legge press på larver med tangens blader. Et alternativ til bruk av tang for manøvrering av larver er myke pensler. Med begge verktøy, brukeren bør øve på å overføre dyrene, for ikke å forårsake utilsiktet vev skade som kan komplisere atferdsmålinger.
5. Overfør den midterre tredjedelen av instar larver, ved hjelp av tang, til en liten petriskål (30 mm x 15 mm) som inneholder en liten plugg av flymat fuktet med vann ved romtemperatur. Hold larver i den lille petriskålen til forsøkene utføres, men ikke lenger enn 20 min.
   MERK: Vanligvis vil overføring av 20–30 larver til matpluggen gi et tilstrekkelig antall for 20 min atferdsanalyse.

3. Mekanisk nociception analyse

1. Plasser en midt-tredje instar larve (ved hjelp av tang) på en tynn pute av svart eller mørk vinyl under et lyst felt stereomikroskop. Den mørke fargen gir kontrast som forbedrer visualiseringen av larven. Det er å foretrekke å ha et fritt bevegelig stykke mørk vinyl fordi det gjør det mulig for brukeren å justere larven uten å berøre eller skade den.
2. Sett de optiske fiberlysene mellom mikroskopet objektive linser og den svarte eller mørke vinylputen; dette vil tillate tilstrekkelig høy kontrast belysning for å se larven.
3. Kast larver som ikke viser normal bevegelse etter overføring til puten. Disse kan forstyrre den normale nociceptive atferdsresponsen. For normal bevegelse, se Video 1.
4. Tørk av, ved hjelp av et papirhåndkle, overflødig vann rundt larven som kan føre til at larven flyter på vinylputen.
5. Orienter larven ved å flytte den mørke vinylputen. Larvens hode/munn skal peke mot venstre hvis du er høyrehendt og omvendt hvis du er venstrehendt (figur 2A–B).
6. Påfør den valgte mekaniske sonden, vanligvis for 1–2 s, på den bakre dorsale siden av larven ved ca. abdominalsegment A8 (se figur 2B), til sonden bøyer seg og fremkaller den tidligere målte trykkmengden (figur 2C). Det er viktig at sonden presser mot larvens dorsale overflate og komprimerer larvene inn i den underliggende puten ved sondekontakt.
   MERK: Ved kontaktpunktet mellom spissen av nitinolfilamentet og ryggsekkollebåndet-epidermis, sonder lavere enn 2300 kPa, hovedsakelig bøye uten å trenge inn i skjellaget og underliggende vev. Slike sonder påvirker sjelden larvaldødelighet⁴. Ved høyere trykk (> 5000 kPa) bøyer sondene seg både og av og til trenger inn i skjellaget og underliggende vev. Punktering av larver svekker larval overlevelse^4, og hvis de observeres, kastes disse larvene vanligvis fra atferdsanalyse.
7. Registrer atferdsresponsen for hver larve. En positiv nociceptiv respons (Video 2) indikeres hvis larven viser en komplett rull på 360° langs kroppens akse innen 3 s. Andre svar (forsøk på å snu, rask kryping og wiggling) anses negative i forbindelse med denne analysen.
   MERK: Larver stimulert med en subthreshold mekanisk stimulans (200 kPa) fremkaller ikke den typiske nociceptive eller rullende responsen (Video 3). Noen larver viste spole fremover eller lette berøringsresponser som endringer i bevegelsesretningen.
8. Kast larven og klargjør den neste for analyse, gjenta trinn 3.1 til og med 3.7.
9. Gjenta trinn 3.1-3.7 til ønsket antall larver er nådd (tre til seks sett n = 10 larver ble brukt her for hver sonde).
   MERK: Ved bruk av mekaniske prober med lavere trykk (174–462 kPa), vil analysen ta mer tid per larve. Dette skyldes at spissen av lengre filamenter svinger mer, noe som gjør det vanskeligere å stikke larven i midten av A8-segmentet. Praksis er nødvendig med disse sondene.

4. Konfokal mikroskopi for å vurdere nevronal morfologi

1. Plasser en larve (av genotype ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP for å merke sensoriske nevroner) som tidligere ble stimulert med nitinolfilament i et eteriseringskammer inne i en Coplin-krukke som inneholder et 10 ml beger som bærer en bomullsdott gjennomvåt med ~ 1 ml dietyleter. La larven sitte i kammeret i ~ 5 min.
   MERK: En detaljert protokoll for eterisering er gitt i en tidligere studie publisert av vår gruppe^12.
2. Skyll larven forsiktig fra eteriseringskammeret i en liten petriskål.
3. Ha klar ett mikroskop lysbilde, to små dekklips (22 x 22 mm), og en lang dekkslips (22 x 54 mm) (se Materialtabell).
4. Tilsett små dråper eter:oljeoppløsning (1:5-forholdet mellom etyleter og halokarbonoljeløsning, se Materialtabell) i begge ender av lysbildet, og plasser deretter de små dekkslipper på toppen av de små dråpene. Denne ordningen skaper et lite mellomrom der larven kan passe.
   MERK: Trykk de små dekkglassene mot mikroskopet til det er vanskelig å skli.
5. Tilsett noen dråper eter:oljeoppløsning på midten av mikroskopet glir og plasser deretter larven ved hjelp av tang, på midten av mikroskopet lysbilde (mellom de små dekkglass). Kontroller at larvens anteroposterior-aksen er parallell med kortsiden av lysbildet, og at den proporsjonale siden vender opp.
6. Dekk larver med den lange dekkslip plassert på toppen av larven og de to mindre dekkslips.
   MERK: Trykk sjenerøst på den lange dekkslippen til larven er nesten flat.
7. Bildesegment A8 av larven ved hjelp av et konfokalt mikroskop (se Materials tabell) ved hjelp av laserbølgelengde 488 (GFP).
   MERK: Bilde larven umiddelbart fordi bedøvelse via eter vil falme raskt (~ 5-10 min) og larven vil våkne opp og bevege seg, noe som vil komplisere ytterligere bildebehandling.
8. Ta Z-stack bilder med en oppløsning på 1024 x 1024 piksler ved hjelp av en 20x numerisk blenderåpning (NA) 0,7 tørr objektiv objektiv ved 1x zoom, trinnstørrelse på 1,5 μm.

5. Mengde vevsskade

1. Samle og konvertere Z-serien stabel bilder, fra seksjon 4.8, til en enkelt Z projeksjon (en utflating av flere bilder tatt på forskjellige fokal fly til et enkelt sammensatt bilde). Dette kan utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare (f.eks Olympus Fluoview) eller en tilsvarende åpen kildekode-plattform, for eksempel Fiji/Image J. Lagre enkelt Z-projeksjon i TIFF-format.
2. Åpne bildeanalyseprogrammet Fiji/ImageJ.
3. Klikk på Fil, fra menylinjen, og velg Åpne fra vinduet som vises.
4. Velg den lagrede enkeltbildeprojeksjonen, som er lagret i TIFF-formatet, som skal analyseres.
5. Klikk på Rediger, fra menylinjen, og velg Inverter-alternativet fra vinduet som vises.
6. Klikk på bilde ,fra menylinjen, og velg deretter Juster, fra vinduet som vises, og velg til slutt lysstyrke / kontrast alternativet.
7. Velg alternativet Frihåndsfigur fra verktøylinjen for å måle området for gapet (hvis noen).
8. Klikk på Analyser, fra menylinjen, og velg Mål alternativet. Dette vil vise arealet av gapet eller såret.

Representative Results

Vi utviklet tilpassede mekaniske sonder, ved hjelp av nitinolfilamenter (figur 1A, N), for å fremkalle mekanisk fremkalt atferd og genererte en full atferdsdoseresponskurve ved hjelp av både uskyldige og skadelige mekaniske sonder av varierende intensitet ( figur2D) som viser at disse sondene kan brukes til å studere baseline (i fravær av skade) mekanisk nociception.

Våre atferdsanalyseresultater fastslo at sonder som utøver trykk under 200 kPa (~ 1,57 mN) (figur 1M), når de brukes på Drosophila larver, ikke provoserer en aversiv rullende respons (figur 2D og Video 3). Som forventet, disse subthreshold eller ikke-skadelige mekaniske sonder (175 kPa eller 200 kPa) ikke fremkalle synlig neuronal vev skade (Figur 2E). Fordi de ikke induserer skade, kan slike sonder være nyttige for å vurdere mekaniske allodynia (overfølsomhet overfor en normalt ikke-skadelig mekanisk stimuli). Derimot fremkalte suprathreshold eller skadelige sonder (fra 462 kPa til 5116 kPa), en utvidet atferdsrespons (figur 2D) på en doseavhengig måte – med høyere trykk som fremkalte sterkere atferdsresponser. Som forventet, suprathreshold mekanisk trykk også indusert doseavhengig vev skade på perifere sensoriske nevroner selv (Figur 2E). Det målte området av vevsskade (i μm² ± standardavvik) tatt fra fire larver for hver gruppe var: 2,051.03 ± 703.81 (462 kPa), 5.102. 29 ± 1 004,67 (2 283 kPa) og 12 238,83 ± 3 724,11 (5 116 kPa). Dermed kan trykk som er større enn eller lik 462 kPa (~ 63 mN), som fremkaller en aversiv rullende respons (i 25% eller mer av larver) og forårsake synlig nevronal vevsskade (figur 2E), være hensiktsmessig å studere mekanisk overalgesi (overfølsomhet overfor normalt skadelige mekaniske stimuli). Nociceptive mekaniske prober (≥462 kPa) alltid indusere vevsskade (n = 10, evaluert kvalitativt), men ikke alltid provosere en aversiv rullende respons.

For å evaluere mekanisk overfølsomhet (allodynia og hyperalgesi), brukte vi en veletablert Drosophila larval modell av nociceptive sensibilisering som bruker ultrafiolett lys (UV) bestråling for å indusere vevsskade^7,12. Denne analysen har bidratt til å dissekere de genetiske og cellulære mekanismene for termisk nociceptiv^{overfølsomhet 8,9,10,13,14,15}. For å finne ut om UV-behandling forårsaker mekanisk allodynia, ble mid third-instar control(w¹¹¹⁸) larver mock-bestrålt eller UV-bestrålt (15-20 mJ/ cm²) (figur 3A). Deretter ble larvene testet atferdsmessig ved 2 t, 4 timer, 8 timer, 16 h og 24 h etterbehandling med en normalt subthreshold mekanisk sonde (200 kPa, 1,57 mN). Omtrent 20 % av larver svarte så tidlig som 2 timer etter UV-behandling, mens 50 % responderte ved 4 timer, sammenlignet med henholdsvis 6,6 % og 8,3 % mock UV-bestrålte dyr (figur 3B). Dette indikerer at UV-indusert vevsskade forårsaker mekanisk allodynia ved 4 t post-bestråling. Senere tidspunkter (8 timer, 16 h og 24 h) var den atferdsmessige responsen til uv-behandlede larver i området 16 %–20 % respondere (gjennomsnittlig gjennomsnitt på n = 3–6 sett med 10 larver hver), noe økt (men ikke statistisk signifikant) sammenlignet med den mock-bestrålte kontrollgruppen (i området 3%–6 % av responderne, gjennomsnittlig gjennomsnitt på n = 3–6 sett med 10 larver hver) (figur 3B).

For å undersøke mekanisk hyperalgesi, et suprathreshold trykk (462 kPa, 3,63 mN), som normalt induserer en aversiv rullende respons i ~ 20% av larver (Figur 2D) og forårsaker nevronal vevskade (figur 2E), ble brukt. Vi brukte 462 kPa-sonden på den dorsale siden av larver med eller uten UV-indusert vevsskade (figur 3A). Vi fant at larver probed på 4 h, 8 h og 16 h etter UV-behandling viste en betydelig økning i aversive rullende respons, med 4 h som toppen av atferdsoverfølsomheten (~ 60% responsiv); mock UV-bestrålte dyr viste en ~ 27% av aversiv respons (Figur 3C). I likhet med mekaniske allodynier, atferdsresponsen ved 8 timer, 16 timer og 24 timer UV-behandlede dyr (i området 36%-42%) var statistisk umulig å skille fra de ikke-behandlede larver (i området 20%-26%). Larver på slutten av tredje instar stadium viste en liten reduksjon av baseline atferdsrespons sammenlignet med den midterste tredjedelen instar scenen. Vi hypoteser om at dette kan være enten ved økt størrelse på larver (figur 2A) eller den økte tykkelsen på skjellaget som dekker kroppen. Dette faktum kan forklare hvorfor på et senere utviklingsstadium induserer UV-behandlingen ikke større mekanisk sensibilisering, som observert 4 timer etter UV-behandling.

Samlet indikerer våre resultater at Drosophila larver utvikler både mekanisk allodynia og mekanisk hyperalgesi etter UV-indusert vevsskade. Den høyeste tiden for mekanisk allodynia og hyperalgesi er den samme, 4 timer etter UV-behandling; Imidlertid har mekanisk hyperalgesi en mer uttalt temporal hale som den går tilbake til baseline saktere sammenlignet med mekaniske allodynia.

Figur 1: Utvikling av et Von Frey-lignende verktøy for å evaluere mekanisk nociception i Drosophila larver. (A)Bilde av en mekanisk sonde som brukes til å studere mekanisk nociception i Drosophila larver. (B) Nitinol filamenter og deres relative diametre er vist til relativ skala. (C) Bilde av den diagonale trådkutteren som brukes til å kutte nitinolfilamentene. (D)Utjevning av de skarpe kantene på den kuttede nitinolfilamentet med en slipestein. (E) Hypodermisk nål som brukes til å lage et hull i trepopsicle håndtaket på sonden. Spissen av nålen må nå minst halvparten av høyden på håndtakspinnen for sikker filamentinnsetting. (F–G) Vedlegg av nitinolfilamentet ved å lime inn i et trepopsicle pinnehåndtak med innsettingshull. (H–L) Kalibrering av mekaniske prober ved å trykke dem mot en skala. (M) Kraftverdier (i mN) og trykk (i kPa) generert av forskjellige mekaniske prober. Lengden på hver nitinolfilament som brukes til å konstruere sondene (P1–P10; P: probe) er beskrevet i centimeter (cm). (N) Et bilde av et komplett sett med mekaniske prober, fra 174 kPa til 5116 kPa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Mekanisk nociception analyse: Von Frey-lignende filamenter genererer en doseresponskurve av aversiv rullende atferd og forårsaker vevsskade på sensoriske nevroner. (A) Bilder av de forskjellige stadiene (andre og tredje instar) av Drosophila larver. Vekt bar: 2 mm. (B) Tegneserie av dorsal visning av den tredje instar Drosophila larver. Den røde prikken indikerer buksegmentet der den mekaniske sonden påføres. T: thorax segment; A: abdominal segment. Andre anatomiske landemerker er merket. (C) Tegneserien av analysen: En mekanisk sonde påføres dorsalsiden av larven til den bøyer seg mot overflaten nedenfor og holdes deretter i 2 s. Hvis trykket er tilstrekkelig høyt, fremkaller dette en aversiv rullende respons ved frigjøring. (D)Atferdsdoserespons; hver blå prikk representerer prosentandelen av larver som reagerte, med aversive rullende, til mekanisk stimulering i et sett med 10 dyr. Fiolin plott av prosent av aversive rullende atferd indusert av ulike mekaniske sonder. kPa: kilopascals. Boksplott representerer median (grønn), whiskers (rød) representerer 10th og 90th persentiler. (E) Vevsskade: Tredje instar larver (av genotype ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP for å merke nociceptive sensoriske nevroner) ble undersøkt ved dorsal segment A8 med indikert trykk. Fluorescerende merkede parede ddaC klasse IV sensoriske nevroner (over dorsal midline) ble deretter undersøkt (se pkt. 4 og 5). Hvite områder (røde stjerner) representerer hull eller vevsskade. Vektstangen: 100 μm. I panel B vises larven i dorsalvisningen, mens i C er det sidevisningen. Mekaniske sonder presset mot den dorsale cuticle-epidermis siden av larven produserer en depresjon like-lomme på kontaktpunktet av spissen av sonden og de omkringliggende områdene. Den solide sorte linjen buet mot ventral side er toppen av lommen, mens den stiplede grå sidelinjen representerer sidesiden og bunnen av lommen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Mekanisk overfølsomhet etter UV-skade. (A)Skjematisk av eksperimentell design for å teste sensibilisering. Mid tredje instar ble mock behandlet (ikke-UV) eller UV bestrålt. Den mekaniske nociception analysen ble deretter utført på forskjellige tidspunkter (2 h, 4 h, 8 h, 16 h og 24 h) etter mock behandling eller bestråling. (B) Mekanisk allodynia: Prosentandelen larver som viser aversive rullende etter sondering med normalt subthreshold eller ikke-skadelig mekanisk stimulans (200 kPa, 1,57 mN) på de angitte tidspunktene etter mock-behandling eller UV-bestråling. (C) Mekanisk hyperalgesi: Prosentandelen larver som viser aversive rullende etter sondering med en normalt suprathreshold eller skadelig mekanisk stimulans (462 kPa, 3,63 mN) på de angitte tidspunktene etter mock-behandling eller UV bestråling. Feilfelt indikerer gjennomsnittlig +/- SEM. Tosidig unpaired t-test ble brukt til statistisk analyse: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: ikke signifikant. Hver rød prikk, i panel B og C, representerer gjennomsnittlig andel av 10 larver, n = 3-6 sett per timepoint / tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Normal bevegelse av Drosophila larver. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Skadelig mekanisk stimulering av Drosophila larver. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Subthreshold mekanisk stimulering av Drosophila larver. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Vi endret en etablert mekanisk analyse^{1,2,16 ved} hjelp av tilpassede mekaniske sonder fabrikkert fra nitinol filamenter. Denne metalllegeringen tillater oss å bruke filamenter med mindre diameter som passer til størrelsen på Drosophila larver. Fiskesnørebaserte monofilamenter har dominert feltet av flue mekanisk nociception^{til dags dato 2,5,6,16}. Våre nitinolfilamenter opprettholder sin form og målte trykk i ca ~ 3-5 måneder (etter vår erfaring). Ved å variere lengden og diameteren på nitinolfilamenter, kan brukeren generere et bredt spekter av trykk som strekker seg fra subthreshold til en nesten fullstendig rullende respons. Spesielt er det enklere å lage subthreshold-sonder med nitinolfilamenter med mindre diameter. Ved hjelp av disse sondene fant vi at trykket, i stedet for å tvinge, fremkaller mer konsekvente nocifensive atferdsresponser⁴. Vi demonstrerer her, ved hjelp av en veletablert UV-indusert nociceptive sensibiliseringsmodell^7,10,13, at disse filamentene også er et nyttig verktøy for å studere mekanisk overfølsomhet - allodynia og hyperalgesi.

Tidligere studier ved hjelp av mekaniske sonder fabrikkert fra fiskesnøre har ført til en viss variasjon i atferdsrespons^2,6,16,17. Flere faktorer kan ta høyde for dette. For det første, fordi trykket er den viktige variabelen, er polering av filamentspissen slik at den avrundes og ikke har noen skarpe kanter kritisk. For det andre er rapportering av trykkverdier i stedet for bare kraft viktig for reproduserbarheten av eksperimentene, fordi forskjellige mekaniske sonder som genererer lignende krefter, kan fremkalle ulike trykk⁴. For det tredje er det viktig å bruke bare en mekanisk^stimulering per larve ved hjelp av skadelige sonder, fordi slike sonder produserer en doseavhengig vevsskade på epidermal 4 og sensoriske nevronale nivåer (figur 2E). En annen eller påfølgende skadelig mekanisk stimulans, etter at vevsskade er indusert, kan tenkes å svekke funksjonen til de berørte perifere sensoriske nevroner og fremkalle en endret atferdsrespons. I en annen studie stimulert larver to ganger med skadelige mekaniske sonder, viste for det meste en forbedret atferdsrespons⁵, noe som tyder på utvikling av en akutt mekanisk sensibilisering (hyperalgesi), som kan skyldes vevsskaden provosert av den første skadelige mekaniske stimulansen. Omvendt rapporterte andre forfattere^{6 en} blandet (økt eller redusert) atferdsrespons, noe som indikerer at den endrede atferdsresponsen kan skyldes skade/dysfunksjon av det nevronale vevet. Stimulere hver larve bare en gang eliminerer mulig varians i atferdsresponser som følge av sensibilisering eller vevsskade. For det fjerde stimulerte vi mekanisk segmentet A8, som er mer bakre enn tidligere studier (foretrukne områder A3–A4)^2,5,16. Prober mellom ~ 3900 kPa og 5300 kPa brukt på enten segment A2 eller A8 viste ingen atferdsforskjeller⁴. I tillegg er A8, sammenlignet med A2–A4, lettere å stimulere med mekaniske prober som genererer lavere trykk (< 300 kPa) fordi larven er tynnere i denne regionen og dermed lettere komprimert. Andre studier viste at skadelig mekanisk stimulering av den bakre enden av larven (levert av en stiv insektpinne, holdt med tang) for det meste fremkalt frem bevegelse, snarere enn en aversiv eller rullende respons¹⁸. Denne forskjellige atferdsresponsen kan skyldes forskjeller i egenskapene til de brukte materialene (bøyelig nitinolfilament vs ukomprimerbar insektpinne) eller til forskjellige trykk levert til larver (trykkverdien av insektpinnen ble ikke rapportert).

Utviklingen av en mekanisk nociception analyse for Drosophila larver har gjort det mulig for feltet å oppdage at ulike mekaniske sensoriske iionkanaler og nevrale kretser medierer mekanisk nociception^5,6,16,17. Studien av den mekaniske overfølsomheten (allodynia og hyperalgesi) har imidlertid ligget, sammenlignet med sensibilisering av de andre sensoriske modalitetene – varme^{7,8,10,13,14,}kald⁹og kjemisk³. Dette etterslepet kan delvis skyldes fraværet av egnede mekaniske sonder som kan generere et komplett responsområde som strekker seg over understrekk for å suprathreshold press. Av særlig betydning, spesielt for å vurdere mekaniske allodynia, er subthreshold sonder som ikke fremkaller en aversiv rullende respons fra uskadede larver. Betydningen av våre forbedrede mekaniske sonder er at de kan fremstilles for å strekke seg over uskyldige stimuli (subthreshold ~ 174 kPa-200 kPa) eller det lave til høye skadelige området (suprathreshold ~ 225 kPa til ~ 5116 kPa). Her demonstrerer vi ved hjelp av nitinol von Frey-lignende filamenter at Drosophila larver utvikler både mekanisk allodynia og mekanisk hyperalgesi etter UV-bestråling. Den mekaniske sensibiliseringen viser noen forskjeller sammenlignet med termisk sensibilisering. Både utbruddet og toppen av mekanisk sensibilisering er tidligere (~ 4 h) sammenlignet med termisk (varme) sensibilisering (~ 8 h for hyperalgesi og ~ 24 h for allodynia)⁷. I tillegg er den mekaniske allodynia og hyperalgesi samtidig (begge topper på ~ 4 timer). Videre, mens varmesensibilisering (allodynia og hyperalgesi) løser seg helt på senere tidspunkt⁷, viste mekanisk overfølsomhet en lang hale som forble litt over baseline. Kald sensibilisering i Drosophila innebærer en bryter i kald-fremkalt^{atferd 9} og fremveksten av ny kald-fremkalt atferd-et fenomen som ikke observeres med mekanisk stimulering. Disse forskjellene i utbruddet, varigheten og observert atferd tyder på at hver sensorisk modalitet kan kontrolleres av forskjellige signalveier. Kombinere sensibilisering analyse beskrevet her med de kraftige genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila bør tillate en presis genetisk disseksjon av mekanisk overfølsomhet (allodynia og hyperalgesi) observert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker	Fisher Scientific	02-540C	Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.
Black (Arkansas) bench stone	Dan’s Whetstone	SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C	Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Confocal microscope	Olympus	FV1000	Any equivalent confocal microscope will do
Coplin Jar	Fisher Scientific	08-816	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Diethyl ether	Fisher Scientific	E138-500	For anesthetizing larvae.
Etherization chamber			This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.
Fiber Optic Light Guide	Schott AG	A08575	Schott Dual Gooseneck 23 inch
Forceps	Fine Science Tool	FS-1670	For transferring larvae
Glue	Aleene's	N/A	Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Graspable holder	Loew Cornell	N/A	Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100ML
Hypodermic needle 30G 1/2"L	Fisher Scientific	NC1471286	BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires
Large Petridish	Falcon	351007	60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Microscope (Zeiss) Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do
Microscope Cover Glass 22x22	Fisher	12-545-B
Microscope Cover Glass 22x40	Corning	2980-224	Tickness 1 1/2
Microscope Slides	Globe Scientific Inc.	1358Y
Mini Diagonal Cutter	Fisher Scientific	S43981	For cutting nitinol filaments
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008”	Mailin Co	N/A	Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/
Piece of black vinyl	Office Depot	N/A	We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva
Small Petridish	Falcon	351008	35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Spatula	Fisher Scientific	21-401-10	Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish
Wipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.
W1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605	Control strain for behavioral assays
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP	Bloomington Drosophila Stock Center	8749	Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons