Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

Este protocolo é significativo porque permite ao usuário construir uma ferramenta que pode ser usada para medir com precisão as respostas mecânicas de nocicepção em larvas de Drosophila geneticamente tratáveis. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa materiais simples para construir ferramentas personalizadas que podem ser usadas para medir a nocicepção mecânica desde o sublimiar até a faixa totalmente responsiva. Essas ferramentas e métodos podem ser usados para medir a nocicepção mecânica basal e a sensibilização nociceptiva após lesão ou doença.

Sondar larvas com filamentos personalizados requer prática. Os usuários devem ser capazes de gerar curvas dose-resposta com larvas de controle antes de tentar um experimento. Para construir uma sonda mecânica, use um pequeno alicate para cortar cada filamento de nitinol no comprimento especificado perpendicular ao seu eixo longo.

Os filamentos vêm em três diâmetros predefinidos diferentes. Examine a ponta dos filamentos sob um microscópio estéreo para garantir que não haja bordas afiadas ou irregulares que possam causar danos aos tecidos da pele da larva e interferir na calibração. Em seguida, use uma pedra de amolar para alisar manualmente as bordas da sonda até que nenhuma irregularidade aguda persista.

Em seguida, use uma agulha hipodérmica para fazer um buraco perto da ponta de um palito de picolé de madeira. Aplique cola de madeira em um único filamento de nitinol e insira o filamento revestido de cola na ranhura da agulha. Quando a cola secar, pressione a sonda contra a escala até que a sonda dobre para determinar a força máxima que pode ser registrada em gramas.

Use a fórmula para converter a massa registrada em força em milinewtons. Em seguida, divida a força medida pela área da superfície da ponta do filamento para converter a força calculada em quilopascais de pressão. A preparação de várias sondas usando filamentos de diferentes diâmetros e comprimentos gerará um conjunto completo, abrangendo a faixa de resposta para larvas de Drosophila.

Para preparar larvas de Drosophila para um experimento, crie a progênie larval em alimentos padrão em uma incubadora de 25 graus Celsius por cerca de 96 horas. Quando as larvas atingirem o estágio de terceiro ínstar, prepare um tampão de comida para moscas em uma pequena placa de Petri para que as larvas sejam testadas e use uma pinça para separar suavemente as larvas de tamanho médio do segundo e terceiro ínstar menores e das larvas maiores do terceiro ínstar tardio ou errante. Em seguida, use o fórceps para transferir 20 a 30 larvas de ínstar médio para uma pequena placa de Petri contendo um pequeno tampão de comida para moscas umedecido com água em temperatura ambiente.

Para realizar um ensaio de nocicepção mecânica, use uma pinça para colocar uma larva de ínstar médio em uma almofada de vinil fina escura sob um microscópio estéreo Brightfield e organize as luzes de fibra óptica entre as lentes objetivas do microscópio e a almofada. Use uma toalha de papel para limpar o excesso de água ao redor da larva e mova a almofada para orientar a cabeça e a boca da larva em direção à mão não dominante do pesquisador. Selecione uma sonda mecânica e aplique a sonda no lado dorsal posterior da larva aproximadamente no segmento abdominal A8 por um a dois segundos, comprimindo cuidadosamente a larva na almofada subjacente no ponto de contato da sonda até que a sonda se dobre e elimine a quantidade de pressão medida anteriormente.

Uma resposta nociceptiva positiva é indicada se a larva mostrar um rolo completo de saca-rolhas de 360 graus ao longo do eixo de seu corpo em três segundos. Registre a resposta comportamental de cada larva. Em seguida, descarte a larva testada e prepare a próxima larva para o ensaio.

Essas sondas mecânicas personalizadas com filamentos de nitinol podem ser usadas para provocar comportamentos evocados mecanicamente e gerar uma curva de dose-resposta comportamental completa usando sondas mecânicas inócuas e nocivas de intensidade variável. Como esses resultados de ensaios comportamentais demonstram, sondas que exercem pressão de 200 quilopascais ou menos não provocam uma resposta de rolamento aversiva em larvas de Drosophila. Como esperado, essas sondas mecânicas subliminares ou não nocivas não provocam danos visíveis ao tecido neuronal.

Por outro lado, as sondas superlimiar ou nocivas provocam uma resposta comportamental aumentada, bem como danos teciduais aos próprios neurônios sensoriais periféricos de maneira dose-dependente. Essas sondas também podem ser usadas para medir a hipersensibilidade mecânica após a lesão. Aproximadamente 20% das larvas respondem com rolamento aversivo duas horas após o tratamento com UV, enquanto 50% responderam quatro horas em comparação com animais irradiados com UV simulados.

Como a sonda usada para esta análise era normalmente abaixo do limiar de 200 quilopascal, essa resposta foi considerada alodinia mecânica. Em momentos posteriores, a resposta comportamental das larvas tratadas com UV é ligeiramente aumentada, mas não estatisticamente diferente da do grupo de controle irradiado simulado. As larvas sondadas com uma sonda de 462 quilopascal em quatro, oito e 16 horas após o tratamento UV exibem um aumento significativo na resposta de rolamento aversiva, com quatro horas sendo o pico da hipersensibilidade comportamental, pois o estímulo era inicialmente nocivo.

A resposta foi considerada hiperalgesia mecânica. A preparação da sonda e a seleção e compressão da larva são essenciais para o sucesso do processo. O uso dessas sondas trouxe a nocicepção basal e a hipersensibilidade nociceptiva mecânica pode ser medida após a lesão.

Usando essas ferramentas e ensaios, as bases moleculares e genéticas da nocicepção mecânica e da hipersensibilidade nociceptiva podem ser medidas no modelo de Drosophila geneticamente tratável.