Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

A drosophila continua sendo um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas e tem se destacado no avanço do conhecimento em muitas disciplinas por décadas. Uma característica que o faz particularmente se destacar é que ele é especialmente adequado para imagens ao vivo. A capacidade de monitorar processos subcelulares ou o comportamento de células e tecidos em tempo real continua contribuindo para gerar conceitos-chave relevantes para a biologia celular e de desenvolvimento. Muitos protocolos bem sucedidos foram desenvolvidos por diferentes grupos para manter tais amostras de Drosophila vivas e saudáveis para estudar o comportamento do espécime e moléculas fluorescentes vivas. Órgãos e tecidos da mosca, como discos imagináveis^1,2, o cérebro larval^3,4,5,6, ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas^7,8,9, ou o intestino adulto^10, por exemplo, podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo. Um desafio fundamental para a imagem ao vivo é garantir que a amostra seja mantida perto da superfície de imagem para uma resolução ideal e imóvel sem comprometer a integridade da amostra que pode ser sensível a impactos mecânicos. Estudar células-tronco neurais, chamadas neuroblastos ou neurônios no cérebro larval de Drosophila, por exemplo, manter amostras próximas à superfície de imagem pode ser alcançada cobrindo-as com mídia cultural em câmaras de imagem seladas^11,12,13. No entanto, essa abordagem não permite facilmente a troca de mídia, limitando assim o espaço experimental para manobras. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas e colocadas em tampas tratadas para aumentar a adesão das células e permitir microscopia de visitação de vários pontos e imagens estendidas de células vivas em pratos de cultura aberta, que potencialmente permitem a troca de mídia, mas não fornecem meios fáceis para evitar a deriva ou perda de amostras durante a troca de mídia^14,15.

O método de coágulo fibrin originalmente desenvolvido para estudar a meiose em espermatos vivos de mosca-de-guindaste¹⁶ é especificamente adequado para superar esses problemas. O fibrinogênio é dissolvido em meio de cultura relevante, as amostras colocadas e orientadas em uma gota desta solução em uma câmara de imagem adequada de superfície de vidro antes da adição da Trombina, resultando na rápida formação de um coágulo fibrin insolúvel, uma malha fibrosa pegajosa que adere à superfície do vidro e às amostras, garantindo o acesso da amostra ao meio da cultura. O meio pode então ser trocado sem perturbar o coágulo ou a posição da amostra. A troca média de cultura durante a imagem é, por exemplo, desejável quando os inibidores devem ser adicionados como no método original ou para experimentos de lavagem ou perseguição de pulso ou quando corantes fluorescentes devem ser adicionados durante a imagem de células vivas, mantendo células e tecidos no lugar. Coágulos fibrinos são adequados para a imagem de tecidos drosophila, bem como células individuais^13,17. Coágulos fibrinos podem ainda ser usados para ajudar a orientar amostras, que devido à sua forma ou outras propriedades normalmente não seriam orientadas da maneira desejada, modulando a posição da amostra dentro do coágulo fibrina e a forma do próprio coágulo.

Aqui fornecemos uma atualização sobre nossos métodos atuais de imagem baseados em coágulos fibrinas e fornecemos ferramentas para análise de imagem baseada em segmentação e focamos no uso deste método para estudar divisões de neuroblastos no cérebro de mosca em desenvolvimento. Usamos rotineiramente o método de coágulos fibrinas para seguir várias amostras em diferentes coágulos no mesmo prato de cultura. Isso permite i) imagens de eventos subcelulares como comportamento central ou localização mRNA ao vivo^18,19, ii) monitorando o comportamento das amostras após o tratamento farmacológico de diferentes genótipos sob as mesmas configurações de imagem usando micros visitantes multipontos²⁰, iii) estudar os efeitos da inibição aguda das enzimas²¹ e iv) minimizando a deriva para estudar mudanças na orientação da divisão celular das células dentro de seu ambiente fisiológico sobre a ablação a^{laser-alvo 22}. Enquanto efeitos indesejados de Trombina e Fibrinogênio e o coágulo fibrinão precisam ser testados empiricamente para cada amostra, este método é, em princípio, adequado para imobilizar qualquer tipo de amostra que deve ser analisada por imagens de células vivas e em Drosophila tem sido usada com sucesso para estudar múltiplos aspectos da biologia dos neuroblastos^5,19,20, mas também a dinâmica das projeções citosensoras das células-tronco da linha germina feminina²³ e mudanças na polaridade sobre a inibição aguda de células folículos de Drosophila

A imagem fluorescente de lapso de tempo resulta na geração de complexos conjuntos de dados 3D resolvidos pelo tempo que requerem métodos para extrair essas informações quantitativas. Aqui descrevemos nosso desenvolvimento adicional de²⁴ macros baseadas em ImageJ que podem ser usadas para corrigir para deriva em hipersobras e macros ImageJ personalizadas que permitem quantificação semi-automatizada de fluorescência multicanal no córtex celular desenvolvido para quantificar proteínas corticais em neuroblastos de cérebros larvais Drosophila ou de neuroblastos individuais na cultura celular primária.

1. Preparação de reagentes

NOTA: Todas as etapas deste protocolo, a menos que explicadas de outra forma, sejam realizadas à temperatura ambiente.

1. Para preparar uma solução de 1x PBS-BSA (0,1% c/v), dissolva 1 mg de Bovine Serum Albumin (BSA) em 1 mL de PBS. Para preparar uma solução de estoque de Trombina 1.000 unidades·mL^-1,dissolva 1.000 unidades de Thrombin em 1 mL de PBS-BSA (0,1% w/v). Faça alíquotas de 10 μL e armazene a -20 °C por até 4 meses.
2. Para preparar o meio de cultura para cérebros de Drosophila, dissolva 1 g de glicose em 1 L do meio de Schneider em condições estéreis. Filtrar e armazenar a 4 °C por até 3 meses.
3. Para preparar a solução Fibrinogen, dissolva 10 mg de Fibrinogen em 1 mL de meio de cultura por 20 min a temperatura ambiente ou 5 min a 37 °C.
   NOTA: Se um meio de cultura diferente do preparado na etapa 1.2 for usado e os coágulos fibrin já se formarem nesta etapa, o meio de cultura provavelmente contém Trombina ativa, que precisa ser inativada antecipadamente. Uma fonte provável de Trombina é o Soro Bovino Fetal, que pode ser inativado aquecendo o soro a 56 °C por 30 min.
4. Para preparar uma solução de revestimento de PBS-BSA (5% c/v), dissolva 50 mg de Bovine Serum Albumin (BSA) em 1 mL de 1x PBS.
5. Para o exemplo reagente usado na etapa 4, prepare uma solução de estoque de 10 mM NAPP1 dissolvendo 1 mg NAPP1 em 315 μL Dimethyl sulfoxida.

2. Dissecção de cérebros larvais de Drosophila

NOTA: Realize esta etapa sob um binóculo de dissecação.

1. Use um pincel para transferir larvas L3 para um prato de vidro borossilicato de 9 poços contendo PBS. Mexa para desprender a maior parte dos alimentos de mosca das larvas e transfira para outro poço que contenha meio de cultura.
2. Use fórceps (por exemplo, Dumont #55) para agarrar uma larva em todo o seu diâmetro, no meio do comprimento do corpo (ver Figura 1A,B). Enquanto segura a larva, transfira-a para outro poço da placa borossilicadora contendo 200 μL de meio de cultura fresca.
3. Não solte a larva. Para cortar a larva ao meio em todo o seu diâmetro(Figura 1B),moer a área agarrada com movimento lateral das pontas dos fórceps(Figura 1A, painel superior) ou deslizar uma ponta de outro par de fórceps entre as duas pontas do fórceps que seguram a larva(Figura 1A, painel inferior). Não corte a larva ao meio puxando uma de suas extremidades, pois pode danificar o cérebro puxando-a através dos nervos que cruzam o comprimento do corpo (linhas vermelhas na Figura 1B).
4. Use fórceps para segurar a larva por sua cutícula e outro par de fórceps para descascar a cutícula sem puxar o cérebro(Figura 1C). Repita até que os nervos originários do cérebro sejam visíveis e os órgãos que ligam o cérebro às partes da boca possam ser acessados como mostrado na Figura 1D.
5. Use fórceps para segurar os nervos originários do cérebro. Com o outro par de fórceps, use qualquer uma das técnicas mostradas na Figura 1A para cortar a conexão entre o cérebro e as partes da boca, separando o cérebro do resto da cutícula(Figura 1D).
6. Use fórceps para segurar o cérebro pelos axônios que saem do fio nervoso ventral. Arrancar os órgãos retratados em cinza na Figura 1E, afastando-os suavemente do cérebro.
   NOTA: Não puxe os discos imagináveis olho/antena (amarelo escuro) para desligá-los do cérebro. A conexão entre esses tecidos é muito robusta para ser quebrada puxando sem danificar o cérebro.
7. Enquanto ainda agarra os nervos para segurar e orientar o cérebro, segure a conexão entre os discos imagináveis olho/antena (amarelo escuro) e o cérebro com o outro par de fórceps(Figura 1F). Use qualquer uma das técnicas mostradas na Figura 1A para cortar essa conexão sem puxar o cérebro. Verifique se o cérebro está devidamente limpo de outros tecidos(Figura 1G) e não danificado(Figura 1H). Descarte o cérebro se ele mostrar sinais de dano.
8. Pipete a solução de revestimento com um P20 dentro e fora para revestir a ponta da pipeta. Pipeta o cérebro com a ponta revestida junto com 3 μL de meio (Figura 2A, esquerda) e pipeta-lo em outro poço contendo 200 μL de meio de cultura limpa.
9. Repetir passos 2.2-2.8 até que cérebros suficientes sejam dissecados, ocasionalmente substituindo o meio de cultura do poço em que as dissecções são realizadas.

Figura 1: Dissecção de cérebros larvais D. melanogaster.  (A) Técnica de corte sem puxar usando fórceps. A amostra (verde pálido) pode ser cortada por ser moída entre as pontas dos fórceps (painel superior) ou executando uma ponta de um par de fórceps ao longo das pontas de um par de fórceps segurando a amostra (painel inferior). (B–F) Passos para isolar o cérebro larval sem danificá-lo (ver texto). Cérebro vermelho. Amarelo escuro: discos de olho/antena. Texto azul: ações a serem desempenhadas com os fórceps correspondentes. (G) Aparecimento de um cérebro isolado sem danos visíveis. D é o lado dorsal e V é o lado ventral na visão lateral. (H) Danos comuns causados por puxar excessivamente o cérebro durante a dissecção. Painel superior: desprendimento do fio nervoso ventral. Painel inferior: deformação de um lobo. Posterior é à esquerda e anterior é direito em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Imobilização no deslizamento de tampas com coágulos fibrinas

NOTA: Realize esta etapa sob um binóculo de dissecação.

1. Use uma pipeta P20 com uma ponta revestida como na etapa 2.8 para transferir os cérebros dissecados para outro poço da placa borossilicada contendo 200 μL de cultura média + Fibrinogen(Figura 2A).
2. Pipeta em um cérebro junto com 9 μL de cultura média + Fibrinogen. Com a ponta quase tocando o fundo de vidro da tampa de um prato de cultura celular de 35 mm, pipeta para fora o conteúdo (o meio de cultura e o cérebro) fazendo com que o meio de cultura toque o deslizamento logo após sair da ponta da pipeta para que o cérebro e o meio não deslizem para as laterais da ponta, potencialmente danificando o cérebro(Figura 2A).
3. Use uma ponta de um par de fórceps ou um par fechado de fórceps para empurrar suavemente e posicionar o cérebro dentro do meio de cultura + queda de fibrinogênio.
   NOTA: Tocar a gota com um par aberto de fórceps pode resultar na captura do meio de cultura pela capilaridade entre as pontas dos fórceps(Figura 2B).
4. Se a parte ventral do cérebro tiver que ser imageada, induza a coagulação fibrinogênio da seguinte forma para orientar adequadamente o cérebro dentro do coágulo(Figura 2C).
   1. Empurre o cérebro para um lado da queda. Com uma pipeta P1 equipada com uma ponta P1, pipeta 1 μL de solução Thrombin, toque na borda da gota no lado oposto do cérebro com a ponta da pipeta, e pipeta para fora da Trombina (Figura 2C, primeiro desenho).
   2. Aguarde de 1 a 2 min para que o Fibrinogênio comece a polimerizar, resultando na formação de um precipitado nublado em um lado da queda(Figura 2C, segundo desenho). Empurre suavemente e "coloque" o cérebro no coágulo Fibrin, certificando-se de que a parte da imagem (por exemplo, o lado ventral) esteja o mais perto possível do deslizamento sem deformar o cérebro(Figura 2C,terceiro desenho).
   3. Pipeta fora 1 μL de solução trombina perto do lado do cérebro não enfiado no coágulo Fibrin. (Figura 2C, quarto desenho).
   4. Aguarde 2-3 min para o segundo coágulo fibrina definir (Figura 2C, quinto desenho). Pressione as bordas do coágulo para fazê-lo aderir mais fortemente ao deslizamento de cobertura, tomando cuidado para não deformar o cérebro (Figura 2C, sexto e sétimo desenhos). Se o cérebro parece estar muito longe da mancha, aproxime-o pressionando o coágulo Fibrin perto do cérebro.
5. Se a parte dorsal do cérebro deve ser imageda, induza a coagulação de Fibrina da seguinte forma(Figura 2D).
   1. Posicione o cérebro no centro da queda, parte dorsal de frente para a mancha. Com uma pipeta P10 equipada com uma ponta fina, pipeta 1 μL de solução Thrombin, toque na borda da gota no lado oposto do cérebro com a ponta pipeta, e pipeta para fora da Trombina (Figura 2D, primeiro desenho).
   2. Aguarde 2-3 min para que o Fibrinogênio comece a polimerizar, resultando na formação de um precipitado nublado e fibroso(Figura 2D, segundo desenho). Pressione as bordas do coágulo para fazê-lo aderir mais fortemente ao deslizamento de cobertura, tomando cuidado para não deformar o cérebro (Figura 2D, terceiro e quarto desenhos).
6. Repita as etapas 3.1-3.5 se várias amostras de coágulos tiverem que ser imobilizadas na tampa.
7. Com a ponta posicionada cerca de 0,5 cm acima do coágulo(s), pipeta suavemente 390 μL de meio de cultura sem Fibrinogen dropwise em cima do coágulo(Figura 2B, placa de Petri direita). Não adicione o meio de cultura nas laterais do coágulo, pois ele pode desprender-o da tampa.
8. Para lavar o trombina restante, use uma pipeta para remover 300 μl do meio de cultura e adicione 300 μl de meio de cultura limpa, certificando-se de que os coágulos permaneçam totalmente imersos. Repita duas vezes para lavar o excesso de trombina.

Figura 2: Imobilização de um cérebro larval drosophila usando coágulos fibrinas. (A) Utilizando uma ponta pipeta revestida de BSA, os cérebros são transferidos do meio de cultura (amarelo) para um meio de cultura + solução fibrinogen (laranja), em seguida, pipetou para o deslizamento de tampa (azul claro) de um prato de cultura juntamente com 3,5 μL de cultura média + Fibrinogen. A coagulação fibrinogênio é induzida pela adição de Trombina para imobilizar cérebros na posição dorsal ou ventral (ver D e E). Os cérebros protegidos nos coágulos são posteriormente cobertos em meio de cultura sem Fibrinogênio e o excesso de trombina é removido adicionando e removendo o meio da cultura três vezes. (B) A posição do cérebro dentro da gota de cultura média + Fibrinogen (laranja) no deslizamento de tampas só deve ser ajustada empurrando-o suavemente com a ponta de um par fechado de fórceps, ou apenas uma ponta fórceps. Tocar a gota com par aberto de fórceps pode resultar no meio de cultura sendo puxado pela capilaridade entre as pontas dos fórceps. (C) Etapas para o posicionamento do cérebro larval para a imagem do lado ventral (ver texto). (D) Etapas para o posicionamento do cérebro larval para a imagem do lado dorsal (ver texto). In (D) e(E),verde: Trombina. Laranja escura: coágulo fibrin. Azul pálido: deslizamento de cobertura. Setas azuis: bordas do coágulo a serem empurradas contra a tampa para estabilizar o coágulo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Adição de reagentes durante a imagem ao vivo

1. Para evitar mudanças de temperatura causando mudanças de foco, mantenha a solução com os reagentes a serem adicionados ao prato de cultura na mesma temperatura que o prato de cultura em si para trazê-lo à mesma temperatura antes de adicioná-lo. Se uma câmara ambiental estiver sendo usada, deixe a solução dentro da câmara.
2. Remova a tampa do prato de cultura sem deslocar o prato de cultura em si. Para facilitar a remoção, coloque a tampa do prato de 35 mm de cabeça para baixo em cima do prato antes da imagem.
3. Com uma pipeta P1000, posicione a ponta de pipeta perto da superfície do meio de cultura dentro do prato de cultura e solte suavemente o volume adequado de solução de reagente sobre ele para alcançar a concentração de reagente desejada (por exemplo, 400 μL de uma solução de 20 μM NAPP1 em 400 μL de meio de cultura para uma concentração final de 10 μM NAPP1) , sem gerar fluxos fortes que poderiam desacopar os coágulos.
4. Para homogeneizar a solução dentro do prato de cultura, use uma pipeta P200 para in pipeta lentamente uma pequena quantidade da solução dentro e fora cinco vezes (por exemplo, 150 μL para um volume de 800 μL dentro do prato).
5. Substitua a tampa em cima do prato de cultura sem deslocar o prato de cultura em si e retomar a imagem.

5. Lavagem de reagentes durante a imagem ao vivo

1. Antes da lavagem, mantenha a solução de lavagem na mesma temperatura que o prato de cultura.
2. Remova a tampa do prato de cultura sem deslocar o prato de cultura em si.
3. Com uma pipeta P200 ou P1000, remova lentamente algum meio de cultura do prato de cultura sem expor a parte superior do coágulo (por exemplo, remova 600 μL de 800 μL de cultura média dentro do prato).
4. Para diluir o reagente, com uma pipeta P1000, posicione a ponta da pipeta perto da superfície do meio de cultura dentro do prato de cultura e solte lentamente a solução de lavagem (por exemplo, adicione 1 mL de solução de lavagem aos 200 μL de cultura média deixado dentro do prato para um fator de diluição de 6).
5. Repetir as etapas 5.3 e 5.4 até que o reagente seja diluído conforme necessário (por exemplo, outras três rodadas semelhantes resultarão em um fator de diluição de 1296, reduzindo a concentração inicial de 10 μM NAPP1 para 7,7 nM).
6. Substitua a tampa em cima do prato de cultura sem deslocar o prato de cultura em si e retomar a imagem.

6. Correção do xiz à deriva em lapsos de tempo tridimensionais e/ou multicanais

1. preparação
   1. Baixe e instale ImageJ²⁴. Baixe os plugins TurboReg²⁵ e MultiStackReg²⁶ e coloque-os dentro da pasta de plugins do ImageJ.
   2. Baixe as macros MultiHyperStackReg (arquivo de codificação suplementar 1) e AutoHyperStackReg ImageJ(arquivo de codificação suplementar 2). Para instalar uma macro, coloque o arquivo .ijm dentro da pasta plugins do ImageJ ou adicione o conteúdo do arquivo .ijm ao arquivo ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
   3. No ImageJ, abra um filme de lapso de tempo, incluindo várias fatias e/ou vários canais (a partir de agora referido como "hyperstack", Figura 3A,4A). Se o lapso de tempo incluir apenas uma fatia e um canal, o alinhamento pode ser realizado diretamente usando o MultiStackReg.
2. Correção de deriva lateral usando MultiHyperStackReg
   1. Decida qual canal e/ou fatia do hipersaco deve ser usado como referência para alinhamento. Para gerar uma pilha de referência de um canal e uma fatia (a partir de agora referida como "pilha de referência"), clique em Imagem | Duplicar..., marcar a caixa de seleção de hipersedor duplicado, digitar o número de canal relevante em Canais (c): (por exemplo, substituir 1-2 por 1) e/ou o número de canal relevante em Fatias (z): (por exemplo, substituir 1-15 por 8), e garantir que os quadros: (t) incluam todos os quadros (por exemplo, 1-50) antes de clicar em OK (Figura 3).
   2. Alternativamente para o passo 6.2.1, se uma projeção de várias fatias for preferida para a pilha de referência de um canal, uma fatia, clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z..., selecione a primeira e última fatias e o tipo de projeção, certifique-se de que todos os períodos de tempo estejam marcados e clique em OK. Se o lapso de tempo tiver vários canais, exclua os canais irrelevantes(Imagem | Pilhas | Excluir slice) da projeção resultante ou duplicar o canal de referência escolhido (Imagem | Duplicata) (Figura 3B).
   3. Opcionalmente, corte a pilha de referência para usar apenas uma parte como referência, selecionando a ferramenta retângulo na barra de ferramentas, traçando um retângulo sobre a região de interesse e clicando em Imagem | Crop.
   4. Para iniciar o MultiStackReg, clique em Plugins | | de inscrição MultiStackReg. No menu pop-up Stack 1:, selecione o nome da pilha de uma fatia gerada nas etapas anteriores. No menu pop-up Transformação:, selecione Tradução; marcar a caixa de seleção Save Transformation File e ignorar todos os outros campos.
      NOTA: Outros tipos de Transformação (ver²⁵).
   5. Clique em OK. Selecione um local e nome para salvar o arquivo de alinhamento e clique em Salvar. Na janela da pilha de referência, aguarde que os quadros parem de se mover automaticamente, indicando que o registro acabou(Figura 3B).
   6. Verifique a pilha de referência para ver se o alinhamento é satisfatório. Caso contrário, repita as etapas 6.2.1-6.2.5 com uma fatia de referência diferente, canal e/ou corte. Feche a pilha de referência.
   7. Selecione a janela hyperstack e execute a macro MultiHyperStackReg. Selecione o arquivo de transformação criado na etapa 6.2.5 e clique em Abrir. Aguarde que o alinhamento seja aplicado a cada canal e/ou fatia do hipersedor, momento em que uma nova janela com o sufixo "_aligned" será aberta(Figura 3C).
3. Correção do drift de foco usando MultiHyperStackReg
   1. Clique em Imagem | Propriedades..., copie o valor exibido na Largura do Pixel. Para ressaciar ortogonicamente o hiperseto de um canal com um espaçamento de um pixel, clique em Imagem | Pilhas | Reslice [/]..., cole o valor da largura do pixel no espaçamento de saída: campo numérico; selecionar Top in the Start At: menu popup, tick Avoid Interpolation e click on OK.
      NOTA: Caso a memória tenha que ser liberada no ImageJ, o hiperseso pode ser fechado após a reslice.
   2. Selecione a nova janela gerada pela reslice (a partir de agora referida como "hipersedor relíquia", Figura 4B). Se o hiperstack relíquia tiver vários canais, selecione um canal de referência para executar o alinhamento e exclua os outros canais selecionando-os na barra de rolagem do canal; clique em Imagem | Pilhas | Delete Slice, selecione Canal no menu pop-up Excluir corrente e clique em OK.
   3. Gerar uma hiperseilha relíquia de uma fatia única (a partir de agora referida como "pilha de referência relíquia"), seja duplicando uma única fatia do hipersedor relíquia (ver passo 6.2.1) ou projetando várias fatias do hipersequeto relíquia (ver passo 6.2.2)(Figura 4C).
   4. Opcionalmente, corte a pilha de referência relíquia para usar apenas uma parte como referência da imagem (ver passo 6.2.3).
   5. Realize o registro de imagem na pilha de referência relíquias com MutiStackReg (ver etapas 6.2.4-6.2.6) (Figura 4C).
   6. Selecione a janela hyperstack relíquia e execute a macro MultiHyperStackReg. Selecione o arquivo de transformação criado na etapa 6.3.5, clique em Abrir e aguarde que o alinhamento seja aplicado em cada canal e/ou fatia do hipersebro, momento em que uma nova janela com o sufixo "_aligned" será aberta (a partir de agora referida como "pilha de referência relíquia", Figura 4D). Feche o hipersée relíquia original.
   7. Para converter o hiperseilha alinhado relíquia à visão xiy do hiperseco original, clique em Stacks | Reslice [/]..., selecione Top in the Start At: menu popup, tick Avoid Interpolation e click on OK. Uma vez que uma nova janela com o hipersaco alinhado ao foco final se abra(Figura 4E),feche o hipersedor alinhado resliced.
4. Para corrigir automaticamente a deriva lateral e a deriva de foco, execute a macro AutoHyperStackReg. Selecione o canal de referência, se aplicável, e se corrigir a deriva lateral e/ou de foco. Clique em OK.

Figura 3: Pipeline para a correção de deriva lateral com MultiHyperstackReg. (A) Derivas laterais e de foco podem ser observadas em uma hiperséque contendo várias fatias e pontos de tempo. (B) Uma única fatia, pilha de referência de canal único é gerada a partir do hipersedor, seja por duplicação ou projeção Z. A pilha de referência está alinhada pelo plugin MultiStackReg, gerando um arquivo de alinhamento. (C) A macro MultiHyperstackReg é usada para aplicar o arquivo de alinhamento ao hipersedor, resultando em um hipersedor alinhado para o qual a deriva lateral é corrigida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Pipeline para a correção do foco drift com MultiHyperstackReg. (A) As derivas de foco podem ser observadas em um hipersedor contendo várias fatias e pontos de tempo. (B) O hiperseto é ortogonalmente reslicado a partir do topo, ao longo de cada linha de pixels ao longo do eixo Y, sem interpolação. Isso resulta em um hiperseto relíquia contendo as mesmas informações que o hyperstack, com suas coordenadas y e z trocadas. A deriva de foco (em z) do hipersoco da história original ocorre como uma deriva em y no hiperseto relíquia. (C) Uma única fatia, uma única pilha de referência relíquia de canal único é gerada a partir do hipersequesliced, seja por duplicação ou projeção Z. A pilha de referência relíquias é alinhada pelo plugin MultiStackReg, gerando um arquivo de alinhamento. (D) A macro MultiHyperstackReg é usada para aplicar o arquivo de alinhamento ao hipersedor relíquia, resultando em um hipersedor reslicado alinhado para o qual o foco deriva (em y) é corrigido. (E) Uma segunda reslice ortogonal restaura as coordenadas originais do hipersepilo, que agora não apresenta mais uma deriva de foco (em z). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Medição de sinal cortical com linhas rotativas

1. Baixe a macro Rotating Linescans ImageJ(arquivo de codificação suplementar 3).
2. Abra um lapso de tempo no ImageJ. Posicione a barra de rolagem dos quadros até o primeiro quadro e, caso o lapso de tempo contenha várias fatias, posicione a barra de rolagem das fatias até a fatia na qual o sinal será medido.
3. Modo de rastreamento
   1. Selecione a ferramenta em linha reta na barra de ferramentas. Rastreie uma linha através da zona cortical a ser medida(Figura 5A),certificando-se de que a linha é aproximadamente perpendicular ao córtex e que a linha é longa o suficiente para cruzar o córtex em cada ponto da próxima vez(Figura 5B, primeiro e segundo painel).
   2. Clique duas vezes no ícone da ferramenta de linha na barra de ferramentas para abrir a janela Largura de linha. Aumente a largura da linha tanto quanto necessário, mantendo a intersecção entre a linha e o córtex uma linha reta(Figura 5B, terceiro painel).
   3. Inicie a macro Linhas Rotativas. Definir a faixa de rotação(Figura 5E) para um valor baixo (cerca de 10°) se a orientação da zona cortical a ser medida não mudar muito de um ponto de tempo para o próximo. Defina a medida em torno do valor para 0 pixels para medir apenas o sinal na linha onde a intensidade máxima do sinal é detectada, ou para valores mais altos para também medir o sinal ao redor desta linha.
      NOTA: A medida em torno do valor só afetará a medição do sinal após a detecção do córtex e não afetará a detecção em si.
   4. No Find Cortex no Canal: menu pop-up, selecione o canal no qual a detecção será realizada. Para visualizar onde o córtex foi detectado em cada ponto de tempo, mantenha a Posição de exibição... caixa de seleção marcada (recomendada). Mantenha o Recentr e reoriente... caixa de seleção marcada. Clique em OK.
   5. Uma vez que o status Feito, resultados copiados para área de transferência é exibido no status da janela ImageJ, role o lapso de tempo para verificar se as posições do córtex detectado (sobreposição amarela) e a área medida (sobreposição de ciano) estão satisfatórias. Caso contrário, repita as etapas 7.3.1-7.3.4 com uma posição de linha diferente, comprimento ou largura e configurações diferentes na janela de opções Rotating Linescans.
   6. Cole as medidas em um software de planilha.
      NOTA: As colunas correspondem aos canais na ordem de sua aparição no lapso de tempo e as linhas correspondem aos quadros.
4. Modo de não rastreamento
   1. Selecione a ferramenta em linha reta na barra de ferramentas. Rastreie uma linha (indicada em ciano, Figura 5A) através da zona cortical a ser medida, certificando-se de que a linha é aproximadamente perpendicular ao córtex e que a linha é longa o suficiente para cruzar o córtex em cada ponto de tempo(Figura 5C, primeiro e segundo painel).
   2. Clique duas vezes no ícone da ferramenta de linha na barra de ferramentas para abrir a janela Largura de linha. Aumente a largura da linha tanto quanto necessário, mantendo a intersecção entre a linha e o córtex uma linha reta(Figura 5C, terceiro painel).
   3. Inicie a macro Linhas Rotativas. Defina a faixa de rotação(Figura 5E) de acordo com as alterações de orientação da zona cortical a serem medidas durante todo o lapso de tempo. Defina a medida em torno do valor para 0 pixels para medir apenas o sinal na linha onde a intensidade máxima do sinal é detectada, ou para valores mais altos para também medir o sinal ao redor desta linha.
      NOTA: A medida em torno do valor só afetará a medição do sinal após a detecção do córtex e não afetará a detecção em si.
   4. No Find Cortex no Canal: menu pop-up, selecione o canal no qual a detecção será realizada. Para visualizar onde o córtex foi detectado em cada ponto de tempo, mantenha as posições de exibição... caixa de seleção marcada (recomendada). Desescar o Recentr e Reorient... caixa de seleção. Clique em OK.
5. Uma vez feito, os resultados copiados para a área de transferência são exibidos no status da janela ImageJ, role o lapso de tempo para verificar se as posições do córtex detectado (sobreposição amarela) e a área medida (sobreposição de ciano) estão satisfatórias. Se não, repita as etapas anteriores com uma posição de linha diferente, comprimento ou largura e configurações diferentes na janela de opções De linhas rotativas.
6. Cole as medidas em um software de planilha.
   NOTA: As colunas correspondem aos canais na ordem de sua aparição no lapso de tempo e as linhas correspondem aos quadros.

Figura 5: Medição do sinal cortical com linhas rotativas. (A) Uma linha (ciano) é rastreada perpendicularmente até o córtex (preto) onde o sinal será medido. Diferentes tons de cinza mostram a posição da célula mudando ao longo de três pontos de tempo (t1, t2, t3). (B) Esquerda: posicionamento correto da linha no modo de rastreamento. Meio: posicionamento incorreto da linha no modo de rastreamento, pois não há sobreposição com o córtex no próximo ponto de tempo. Direita: linha excessivamente larga resultando na intersecção (linha laranja) entre o córtex e a linha não sendo reta. (C) Esquerda: posicionamento correto da linha no modo de não rastreamento. Meio: posicionamento incorreto da linha no modo de não rastreamento, pois não há sobreposição com o córtex em cada ponto de tempo. Direita: linha excessivamente larga resultando na intersecção (linha laranja) entre o córtex e a linha não sendo reta. (D) Comprimento e largura da linha de varredura. (E) As linhas são realizadas dentro de uma gama de orientações em torno da orientação original mostrada em (D) definida pelo parâmetro "faixa de rotação", em um intervalo definido pelo parâmetro "passo de rotação". (F) Orientação não ideal da linha de varredura em relação ao córtex, resultando em um sinal baixo medido ao longo da linha. (G) A orientação ideal da linha é definida como a que resulta no pico mais alto de intensidade de sinal medido ao longo da linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imobilização de tecidos de Drosophila com coágulos fibrinas e média de cultura de troca durante a imagem ao vivo.
Após ser dissecado após o procedimento apresentado na etapa 2 (Figura 1) e imobilizado em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de cobertura após o procedimento apresentado na etapa 3 (Figura 2),cérebros larvais expressando Bazooka marcada por GFP (Baz::GFP), o ortolog de mosca da proteína polaridade Par-3, foram imageados por 30 minutos em imagens multi-posicionais de lapso de tempo. Baz::GFP é combinado com apkcas4, um alelo que permite a inibição aguda da proteína atípica quinase C (aPKC) através da adição do pequeno ATP analógico 1-NAPP120. 1-NAPP1 foi, portanto, adicionado ao meio cultural após o procedimento apresentado na etapa 4 e a imagem viva foi retomada por 2,5 h. Cérebros de controle que carregam uma versão selvagem do aPKC quinase não reagiram ao análogo ATP, enquanto cérebros portadores adicionalmente de uma mutação sensível a analógica de aPKC (apkcas4) exibiram uma contração do neuroepithelium e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua prole ( Figura6, Vídeo 1). Os neuroblastos continuam se dividindo ao longo do lapso de tempo, indicando que o tecido permanece saudável, e os cérebros mostram pouca deriva apesar da mudança média cultural, indicando que eles estão bem imobilizados. Da mesma forma, após serem dissecadas após o procedimento apresentado em27,os ovários expressando Baz::GFP foram imobilizados em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de tampas e imageados por 8 min, após o qual a aplicação de 1-NAPP1 induziu a contração de células foliculares mutantes apkcas4, mas não de controles(Figura 7, Vídeo 2).

Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperstackReg.
Um hipersoante exibindo deriva lateral e de foco(Vídeo 3, painel esquerdo) foi primeiro corrigido para deriva lateral (passo 6.2, Figura 3, Vídeo 3, painel médio), depois o drift de foco (passo 6.3, Figura 4, Vídeo 3, painel direito) usando o plugin MultiStRegack e a macro MultiHyperstackReg, resultando em uma redução substancial dos movimentos observados no hiperstack original.

Medição de sinal cortical usando linhas rotativas
Um neuroblasto expressando Baz::GFP (verde) e a proteína transmembrana CD4 marcada com uma proteína fluorescente infravermelha (CD4::mIFP, vermelho) foi imageado durante uma mitose. O sinal CD4::mIFP foi usado como referência para detectar o córtex em várias partes do neuroblasto com tubos de linha (etapa 7, Figura 5, Figura 8A-C) e o sinal Baz::GFP foi medido nas posições detectadas Figura 8D). Durante sua divisão, os neuroblastos se polarizaram transitoriamente estabelecendo domínios corticais distintos e opostos: o polo apical e o polo basal. Baz define o polo apical e, consistentemente, o sinal baz::GFP aumentou no polo apical do neuroblasto e diminuiu no polo basal durante a divisão (Figura 8C,D). A posição do córtex foi rastreada satisfatoriamente ao longo do lapso de tempo (Figura 8C, Vídeo 4). As linhas e genótipos de Drosophila são referenciados na Tabela Suplementar 1-2.

Figura 6: Aplicação de um análogo ATP em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo. (A) Imagem ao vivo de dois cérebros larvais expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. Os cérebros de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto os cérebros portadores de uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do neuroepithelium (pontas de flecha) e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua descendência. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliação do neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Aplicação de um análogo ATP em câmaras de ovos imobilizadas durante a imagem ao vivo. Imagem ao vivo de dois ovários expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. As câmaras de ovos de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto as câmaras de ovos que carregam uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do epitélio (pontas de flecha) eventualmente levando à aparente quebra das junções de aderentes. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 27 μM. Barra de escala: 20 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Medição do sinal cortical utilizando linhas rotativas. (A) Neuroblasto de D. melanogaster ao vivo expressando Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (vermelho). Linhas de ciano: linhas de varredura iniciais traçadas perpendicularmente para várias zonas corticais para medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificação do córtex (linha azul escuro) utilizando linhas corticais e CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Linha ciano: área definida pelo parâmetro "Medir ao redor" (aqui, 2 pixels), onde o sinal é medido após a detecção do córtex. Barra de escala: 2 μm. (C) Cyan: áreas corticais identificadas durante uma divisão de neuroblasto pelo método de linha rotativa das linhas de varredura iniciais exibidas em (A), usando CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Barra de escala: 5 μM. Seta: polo apical. Ponta de flecha: polo basal. (D) Medição da intensidade do sinal Baz::GFP ao longo do tempo nas duas zonas correspondentes identificadas por linhas rotativas exibidas em(C). Durante a mitose, Baz::GFP é transitoriamente enriquecido no polo apical do neuroblasto e é esgotado do polo basal oposto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Aplicação de troca de mídia em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 6, barra de escala: 20 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Aplicação de troca de mídia em câmaras de óvulos imobilizadas durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 7, barra de escala: 20 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperStackReg. Imagem ao vivo de um neuroblasto expressando a sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Esquerda: antes da correção da deriva. Meio: após a correção da deriva lateral. Direito: após a correção lateral e o drift de foco, barra de escala: 10 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Detecção do córtex usando linhas rotativas, apresentadas na Figura 8, barra de escala: 5 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Tabela Suplementar 1: Genótipos de tecidos Drosophila imaged. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar 2: Origem dos transgenes usados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo de codificação suplementar 1: Origem dos transgenes usados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: Origem dos transgenes usados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 3: Origem dos transgenes usados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.