Artigo de método

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

DOI:

10.3791/62062

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2 de fevereiro de 2021

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1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Resumo

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A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é um método-chave na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson. Atualmente, a contagem esqueológica imparcial é o padrão para quantificação dessas células, mas continua sendo um processo trabalhoso e demorado, que pode não ser viável para todos os projetos. Aqui, descrevemos o uso de uma plataforma de análise de imagens, que pode estimar com precisão a quantidade de células rotuladas em uma região de interesse pré-definida. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para este método de análise no cérebro de rato e demonstramos que ele pode identificar uma redução significativa nos neurônios positivos da hidroxilase de tyrosina devido à expressão de α-sinucleína mutante na substantia nigra. Validamos essa metodologia comparando-se com os resultados obtidos pela estereologia imparcial. Em conjunto, este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e, portanto, é adequado para uma determinação eficiente do efeito das intervenções na sobrevivência celular.

Introdução

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A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)1. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções transversais bidimensionais (2D) do tecido para estimar características volutivas nas estruturas tridimensionais (3D)2,3,4. Os métodos eserológicos modernos baseados em design empregam procedimentos abrangentes de amostragem aleatória e aplicam protocolos de contagem (conhecidos como sondas) para evitar artefatos potenciais e erros sistemáticos, permitindo uma detecção confiável de diferenças apenas um pouco maior do que a variação inter-animal5. Embora a estereologia forneça uma poderosa ferramenta analítica para estudos histológicos in vivo, é tempo intensivo, assume a preparação uniforme de espécimes, e requer validação em várias etapas, o que pode impactar a eficiência cada vez mais necessária para a investigação translacional pré-clínica.

Os recentes avanços tecnológicos na ciência digital possibilitam a adoção de novas aplicações para avaliações mais eficientes da patologia sem um estereótipo, enquanto preenchem uma necessidade como substituto da estereologia imparcial. Esses métodos aumentam a velocidade, reduzem o erro humano e melhoram a reprodutibilidade das técnicas esteológicas6,7. HALO é uma dessas plataformas de análise de imagem para análise quantitativa de tecidos em patologia digital. Ele compreende uma variedade de diferentes módulos e relata dados de expressão morfológica e multiplexado em uma base celular por célula em seções inteiras de tecido usando algoritmos de reconhecimento de padrões. O módulo FL citonuclear mede a positividade imunofluorescente de marcadores fluorescentes no núcleo ou citoplasma. Isso permite relatar o número de células positivas para cada marcador, e o escore de intensidade para cada célula. O módulo pode ser adaptado para fornecer tamanhos celulares individuais e medidas de intensidade, embora este recurso não seja necessário para quantificação de neurônios dopaminérgicos.

O objetivo deste estudo é verificar este método com um modelo de rato α-syn baseado em vetor viral previamente validado de neurodegeneraçãonigral 8,9,10. Neste modelo, o mutante humano A53T α-syn é expresso no SNpc por injeção estereotática do sorotipo híbrido de vírus associado ao adeno 1/2 (AAV1/2), resultando em neurodegeneração significativa durante um período de 6 semanas. O SNpc não injetado contralateral pode, em alguns estudos, servir como um controle interno para o lado injetado. Mais comumente, a injeção de Vetor AAV-Empty (AAV-EV) em uma coorte de controle de animais é usada como um controle negativo. Apresentamos um guia passo-a-passo para estimar a densidade de neurônios dopaminérgicos remanescentes no SNpc injetado após 6 semanas usando um software automatizado de análise de imagem(Figura 1).

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Protocolo

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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Rede de Saúde universitária e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

1. Injeção estereotática

  1. Ratos adultos de casa par-house Sprague-Dawley (250-280 g) em gaiolas com roupa de cama de madeira e acesso a anúncios lib a alimentos e água. Mantenha a colônia animal em um ciclo regular de 12h de luz/escuridão (luzes em 06:30) com temperatura e umidade constantes.
  2. Realize a injeção estereotática unilateral de AAV diretamente ao SNpc no lado direito do cérebro (lado direito ou esquerdo, de acordo com as preferências de cada laboratório) como descrito anteriormente8,10. Injete 2 μL de AAV1/2 em um título final de 3,4 x 1012 partículas genômicas/mL.

2. Secção cerebral e imunohistoquímica (IHC)

  1. Anestesiar o rato com 5% de isoflurane colocando em uma câmara de anestesia por 3 minutos. Outros métodos aprovados podem ser utilizados para esta etapa após a revisão institucional adequada.
  2. Uma vez que o rato tenha alcançado um plano cirúrgico de anestesia profunda, transfira-o para um cone de nariz firmemente afixado para uma tabela de necropsia. Fixar as patas dianteiras do rato usando fita adesiva e use o método de resposta ao dedo do dedo do dedo do dedo para determinar a profundidade da anestesia. O animal deve não responder antes de continuar.
  3. Faça uma incisão lateral abaixo do esterno e corte através do diafragma ao longo de toda a extensão da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Levante e aperte o esterno com um hemosta e coloque acima da cabeça.
  4. Aperte o coração usando fórceps e insira uma agulha de borboleta conectada a uma bomba de perfusão na extremidade posterior do ventrículo esquerdo. Perfuse rato transcardialmente com 150 mL de soro fisiológico heparinizado, ou até que os olhos e a pele estejam claros. A perfusão com 4% de paraformaldeído (PFA), em vez de soro fisiológico, pode ser preferida para facilitar a imunossão com certos anticorpos ou seção cerebral mais fina.
  5. Uma vez que a perfusão esteja completa, decapite com uma guilhotina e extraia o cérebro para uma matriz cerebral, superfície ventral voltada para cima.
  6. Usando uma lâmina de barbear fresca, faça um corte no plano coronal 2 mm rostral para o quiasmo óptico. Deslize a lâmina de um lado para o outro para evitar deformar o cérebro durante o corte.
  7. Mergulhe a porção posterior do cérebro em um frasco pré-rotulado contendo aproximadamente 20 mL de 4% de PFA para 48h de pós-fixação à temperatura ambiente. A porção anterior do cérebro pode ser congelada em 2-metilbutano refrigerado a -42 °C antes de armazenamento a -80 °C.
  8. Após 48 h, transfira os cérebros fixos para um frasco rotulado contendo 30% de sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e armazene a 4 °C até afundar (48-72 h).
  9. Prepare um microtoma colocando gelo seco no cocho da etapa da amostra, seguido de 100% de etanol. Uma vez que o estágio tenha esfriado, esprema o composto de temperatura de corte ideal (OCT) no palco até formar um círculo de 2 cm de diâmetro e 0,5 cm de espessura. Uma vez parcialmente congelado, abaixe cuidadosamente o cérebro sobre o monte de OCT, garantindo que a superfície de corte estriatal permaneça paralela com o estágio.
  10. Adicione mais gelo seco ao palco para ajudar o cérebro a congelar. Uma vez que o cérebro tenha virado uma cor creme, limpe o estágio de gelo seco.
  11. Faça um buraco no lado direito do cérebro com uma agulha 25G para distinguir os hemisférios direito e esquerdo. Tome cuidado para não passar a agulha através de estruturas anatômicas de interesse.
  12. Corte em série seções de 40 μm no plano coronal começando em bregma -3.8 e terminando em bregma -6.8.
  13. Armazene seis séries em tubos rotulados com solução anticongelante (40% PBS, 30% 2-ethoxyetanol, 30% glicerol). Cada série deve conter 12 seções cerebrais.
  14. Selecione um conjunto de seções para coloração imunohistoquímica e lave a solução anticongelante com lavagens de 3 x 10 min em 0,2% PBS-T.
  15. Bloqueie por 1 h em RT com porca suave na solução de bloqueio (soro de cabra 10% normal (NGS), 2% de albumina de soro bovino (BSA) em 0,2% PBS-T). Siga isso com incubação com anticorpo anti-tyrosina de coelho (TH) (1:500) e anticorpo anti-α-syn do rato (1:500) em 2% de NGS em 0,2% PBS-T durante a noite à temperatura ambiente.
  16. Lave o anticorpo primário com lavagens secundárias de 3 x 5 minutos em 0,2% PBS-T, seguido de incubação de 1 h com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (1:500) e anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 555 em 2% de NGS em 0,2% PBS-T. Certifique-se de que as seções estão protegidas da luz e da porca suavemente.
  17. Lave o anticorpo secundário com lavagens de 3 x 5 minutos em PBS-T de 0,2% e monte o conjunto completo de seções em lâminas protegidas de luz e poeira usando um pincel estreito. Tampar com fluorescência montagem média e vedação com verniz de unha claro.

3. Microscopia confocal e aquisição de imagens

  1. Capture imagens IHC usando software acoplado a um microscópio confocal a 10x de ampliação. Abra o orifício para 1,5 UA para capturar um plano largo totalizando ~1,5 μm e definir o foco no lado injetado do cérebro.
  2. Na guia Aquisição, verifique a opção de imagem Tile Scan e defina as dimensões para 10 x 4.
  3. No painel Modo aquisição, defina o Zoom para 1.1. Isso ajuda a evitar marcas óbvias de costura entre as imagens de varredura de ladrilhos.
  4. Defina o Tamanho do Quadro para 1024 x 1024 pixels e a Média para 2 para garantir a aquisição de imagem de alta qualidade.
  5. No painel Canais, defina a faixa 1 para alexa488 e faixa 2 até Alexa555.
  6. Carregue o slide no palco e escolha uma seção com forte coloração th. Clique em Live no painel Aquisição.
  7. No painel Canais, defina a força e o ganho do laser em níveis que maximizam o sinal e limitam o ruído a partir do plano de fundo. Use o indicador de intervalo para garantir que os sinais não sejam superexpostos (como indicado por uma sobreposição vermelha escura).
  8. Repita o passo acima com vários slides para garantir que a coloração seja consistente entre slides, pois a força/ganho do laser não pode ser ajustada entre slides.
  9. Na guia Aquisição, verifique a caixa Posições.
  10. Neste momento, você está pronto para começar a imagem. Usando a ocular, escolha a primeira seção mostrando coloração TH positiva, defina o foco no ponto de interesse (ou seja, SNpc) e, em seguida, mova o palco para a linha média da seção. Isso salva a posição nos eixos x, y e z e irá visualizar uma varredura de ladrilho capturando toda a seção.
  11. Repita o passo acima para todas as seções ao longo do SNpc dando um conjunto completo de imagens do SNpc. Se for necessária uma análise detalhada do lado não injetado, as etapas 3.10 a 3.11 devem ser repetidas definindo o foco no lado não injetado.

4. Análise e quantitação de imagens

  1. Arquivos de imagem separados usando software apropriado e importar arquivos de imagem para software automatizado de análise de imagem.
  2. Defina uma região de interesse selecionando a ferramenta de anotação caneta para desenhar uma anotação em torno do SNpc.
    NOTA: Em seções que têm uma grande quantidade de perda de neurônio dopaminérgico, aumentar temporariamente a emiteção/absorção pode ajudar a definir claramente o SNpc (Figura 2).
  3. Mova-se para a guia Análise e a partir do menu 'Analisar' suspenso, selecione Sintonia em Tempo Real. Isso abre uma janela separada na imagem da seção permitindo a modificação em tempo real dos parâmetros de análise(Figura 3).
  4. Na seção Desnificação de análise, selecione o zoom de imagem apropriado.
  5. Na seção Detecção celular, selecione o corante nuclear como o corante usado para coloração TH (Alexa Fluor 488).
  6. Ajuste o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nucleare as configurações de tamanho nuclear enquanto observa cuidadosamente a janela de sintonia em tempo real.
    NOTA: A representação precisa de cada célula individual como uma única célula na janela de sintonia em tempo real é vital para a precisão. Essas configurações estão em escala arbitrária dependendo do software utilizado, mas o ajuste correto é necessário para permitir que o software diferencie com precisão entre células individuais e entre células e o fundo(Figura 3).
  7. Repita este processo com um mínimo de 10 amostras separadas para garantir uma concordância uniforme do que constitui uma célula em diferentes seções.
    NOTA: Marcadores celulares adicionais (como α-syn ou NeuN) podem ser identificados dentro da mesma plataforma de análise usando as seções Marcador 1 ou Marcador 2 na guia de análise.
  8. Uma vez que um número apropriado de imagens tenha sido amostrado e o ajuste em tempo real tenha sido ajustado de acordo, salve as configurações de análise no menu suspenso Configurações Actions.
  9. Selecione todas as imagens a serem analisadas e clique em Analisar.
  10. Escolha a configuração de análise que acabou de salvar e na janela Região de Análise, verifique a caixa (s) camada de anotação. Em seguida, verifique a Camada 1 e clique em Analisar.
    NOTA: Para um único cérebro, a análise normalmente leva cerca de 5 minutos. O resultado completo mostrará claramente cada item que foi contado como uma célula (Figura 4).
  11. Uma vez concluída, exporte os dados de análise de resumo para todas as seções. Há uma opção para exportar dados de análise de objetos,que darão dados detalhados, incluindo o tamanho celular de cada célula individual detectada. Este conjunto de dados poderia ser usado para examinar alterações no tamanho da célula em resposta a uma toxina/terapêutica.
  12. Adicione as Células Totais de cada seção analisada por animal e a Área Total Analisada (mm2). Divida o número total de células pela área total analisada para calcular o número de células/mm2 no SNpc para cada rato

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Resultados

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Aplicando os métodos acima ao tecido cerebral coletados 6 semanas após as injeções de AAV, demonstramos que a injeção estereotática de AAV expressando o mutante A53T α-syn (AAV-A53T) no SNpc do cérebro de rato resulta em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos em comparação com a injeção de AAV (AAV-EV) vetorial vazio como controle (Figura 5A,B). O número médio de neurônios TH-positivo/mm2 no SNpc de ratos injetados com AAV-EV foi de 276...

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Discussão

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A avaliação confiável da integridade do sistema dopaminérgico em modelos pré-clínicos de DP é fundamental para determinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Por isso, é importante controlar e minimizar potenciais confusões que possam reduzir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados histopatológicos. Resultados quantitativos cuidadosos podem fornecer mais informações do que descrições qualitativas ou semi-quantitativas. Ao mesmo tempo, devemos reconhecer que as restrições no tempo e no...

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Divulgações

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Os autores não relatam interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a todos os funcionários do Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) da University Health Network pelo tempo e assistência no desenvolvimento desse protocolo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo A-SynThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 anticorpo secundárioThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 anticorpo secundárioThermoFisher ScientificA-28180
Alcalina fosfatase conjugada anti-coelho igGJackson Immuno111-055-144
Biotinilated anti-mouse IgGVector LabsBA-9200
Albumina deSigmaA2153
Meio de montagem fluorescente DAKOAgilentS3023
HALO™Indica Labs
Histo-Clear IIDiamedHS202
ImmPACT DAB VectorLabsSK-4105
LSM880 Microscópio ConfocalZeiss
NeuN AnticorpoMilliporeMAB377
de VetorSoro de Cabra NormalS-1000-20
OCTTecla-Tek
ParaformaldeídoBioShopPAR070.1
Micrótomo deslizanteLeicaSM2010 R
Stereo InvestigatorMBF Bioscience
SucroseBioShopSUC700
TH AnticorpoThermoFisher ScientificP21962
VectaMount meio de montagemVector LabsH-5000
Substrato de fosfatase alcalina azulVector LabsSK-5300
Zen Black SoftwareZeiss
Zen BlueZeiss
soro bovino Substrato de peroxidase Laboratório de

Referências

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