Artigo de método

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

DOI:

10.3791/62062

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2 de fevereiro de 2021

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1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Resumo

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A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é um método-chave na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson. Atualmente, a contagem esqueológica imparcial é o padrão para quantificação dessas células, mas continua sendo um processo trabalhoso e demorado, que pode não ser viável para todos os projetos. Aqui, descrevemos o uso de uma plataforma de análise de imagens, que pode estimar com precisão a quantidade de células rotuladas em uma região de interesse pré-definida. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para este método de análise no cérebro de rato e demonstramos que ele pode identificar uma redução significativa nos neurônios positivos da hidroxilase de tyrosina devido à expressão de α-sinucleína mutante na substantia nigra. Validamos essa metodologia comparando-se com os resultados obtidos pela estereologia imparcial. Em conjunto, este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e, portanto, é adequado para uma determinação eficiente do efeito das intervenções na sobrevivência celular.

Introdução

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A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)1. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções....

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Protocolo

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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Rede de Saúde universitária e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

1. Injeção estereotática

  1. Ratos adultos de casa par-house Sprague-Dawley (250-280 g) em gaiolas com roupa de cama de madeira e acesso a anúncios lib a alimentos e água. Mantenha a colônia animal em um ciclo regular de 12h de luz/escuridão (luzes em 06:30) com temperatura e umidade constantes.
  2. Realize a injeção estereotática unilateral de AAV diretamente ao SNpc no lado direito do cérebro (lado direito....

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Resultados

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Aplicando os métodos acima ao tecido cerebral coletados 6 semanas após as injeções de AAV, demonstramos que a injeção estereotática de AAV expressando o mutante A53T α-syn (AAV-A53T) no SNpc do cérebro de rato resulta em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos em comparação com a injeção de AAV (AAV-EV) vetorial vazio como controle (Figura 5A,B). O número médio de neurônios TH-positivo/mm2 no SNpc de ratos injetados com AAV-EV foi de 276.......

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Discussão

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A avaliação confiável da integridade do sistema dopaminérgico em modelos pré-clínicos de DP é fundamental para determinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Por isso, é importante controlar e minimizar potenciais confusões que possam reduzir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados histopatológicos. Resultados quantitativos cuidadosos podem fornecer mais informações do que descrições qualitativas ou semi-quantitativas. Ao mesmo tempo, devemos reconhecer que as restrições no tempo e no.......

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Divulgações

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Os autores não relatam interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a todos os funcionários do Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) da University Health Network pelo tempo e assistência no desenvolvimento desse protocolo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo A-SynThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 anticorpo secundárioThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 anticorpo secundárioThermoFisher ScientificA-28180
Alcalina fosfatase conjugada anti-coelho igGJackson Immuno111-055-144
Biotinilated anti-mouse IgGVector LabsBA-9200
Albumina deSigmaA2153
Meio de montagem fluorescente DAKOAgilentS3023
HALO™Indica Labs
Histo-Clear IIDiamedHS202
ImmPACT DAB VectorLabsSK-4105
LSM880 Microscópio ConfocalZeiss
NeuN AnticorpoMilliporeMAB377
de VetorSoro de Cabra NormalS-1000-20
OCTTecla-Tek
ParaformaldeídoBioShopPAR070.1
Micrótomo deslizanteLeicaSM2010 R
Stereo InvestigatorMBF Bioscience
SucroseBioShopSUC700
TH AnticorpoThermoFisher ScientificP21962
VectaMount meio de montagemVector LabsH-5000
Substrato de fosfatase alcalina azulVector LabsSK-5300
Zen Black SoftwareZeiss
Zen BlueZeiss
soro bovino Substrato de peroxidase Laboratório de

Referências

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  1. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  2. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fra....

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Etiquetas

Dopaminergic Neuron DensitySubstantia NigraAutomated Image AnalysisParkinson s DiseaseTyrosine Hydroxylase StainingConfocal MicroscopyUnbiased StereologyCell DetectionRodent BrainAlpha Synuclein

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