Summary
Kronisk pankreatitt (CP) er en sykdom preget av betennelse og fibrose i bukspyttkjertelen, ofte forbundet med intractable magesmerter. Denne artikkelen fokuserer på å raffinere teknikken for å generere en musemodell av CP via gallekanalinfusjon med 2,4,6 -trinitrobenzensulfonsyre (TNBS).
Abstract
Kronisk pankreatitt (CP) er en kompleks sykdom som involverer bukspyttkjertelbetennelse og fibrose, kjertelatrofi, magesmerter og andre symptomer. Flere gnagermodeller er utviklet for å studere CP, hvorav gallekanalen 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) infusjonsmodell replikerer egenskapene til nevropatisk smerte sett i CP. Imidlertid er gallekanalinfusjon hos mus teknisk utfordrende. Denne protokollen demonstrerer prosedyren for gallekanal TNBS-infusjon for generering av en CP-musemodell. TNBS ble infundert i bukspyttkjertelen gjennom ampulla av Vater i tolvfingertarmen. Denne protokollen optimalisert narkotika volum, kirurgiske teknikker, og narkotika håndtering under prosedyren. TNBS-behandlede mus viste egenskaper ved CP som reflektert av kroppsvekt og vektreduksjoner i bukspyttkjertelen, endringer i smerterelatert atferd og unormal morfologi i bukspyttkjertelen. Med disse forbedringene var dødeligheten forbundet med TNBS-injeksjon minimal. Denne prosedyren er ikke bare kritisk for å generere kreft i bukspyttkjertelen sykdom modeller, men er også nyttig i lokal bukspyttkjertel narkotika levering.
Introduction
Kronisk pankreatitt (CP) er en kronisk inflammatorisk sykdom preget av atrofi i bukspyttkjertelen, fibrose, magesmerter og eventuelt tap av både eksokrine og endokrine funksjoner1. Nåværende medisinske og kirurgiske behandlinger er ikke kurative, men utføres for å lindre symptomer som er konsekvensen av sykdommen: ildfaste magesmerter, endokrine og eksokrine dysfunksjon. Derfor er det nødvendig med mer effektive behandlinger2. Dyremodeller gir et viktig verktøy for å utvikle en bedre forståelse av sykdommen og undersøke potensielle terapeutiskestoffer 3. Flere musemodeller for CP er utviklet, hvorav cerulein- og /eller alkoholmodeller ofte brukes. Cerulein, en oligopeptid stimulerende bukspyttkjertel sekresjon, har vist seg å reprodusere en CP-modell med pankreas atrofi, fibrose, blant andre4. En annen vanlig modell bruker serielle injeksjoner av L-arginin, som produserer eksokrininsuffisiens lik den som observeres hos humane pasienter5. CP kan også induseres ved fullstendig eller delvis ligasjon i bukspyttkjertelen, i tillegg til hypertensjon i bukspyttkjertelen6,7. Til tross for mangfoldet av dyremodeller som er tilgjengelige for CP, reproduserer ingen av disse modellene effektivt magesmerter som oppleves av CP-pasienter8.
Tidligere studier viste at lokal pankreas injeksjon av 2,4,6 -trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS) gjenskaper vedvarende smerte opplevd av CP pasienter9,10,11. TNBS-behandlede mus viste abdominal overfølsomhet og økt smerterelatert atferd samt en "generalisert overfølsomhet" for smertefulle stimuli, et fenomen som har blitt observert hos CP-pasienter10. I tillegg til nøyaktig etterligning av CP-smerte, replikerer TNBS-modellen også andre patologiske egenskaper ved den menneskelige tilstanden som fibrose, mononukleær celleinfiltrasjon og erstatning av acinarceller med fettvev10,12. TNBS-infusjon via gallekanal er imidlertid en teknisk utfordrende prosedyre hos mus som kan forårsake død. Så vidt vi vet er det ingen visuell protokoll for å vise hvordan gallekanalinfusjon utføres. I denne artikkelen demonstrerer vi prosedyren for galleduksjonsinfusjonen av TNBS for å generere en CP-musemodell. Denne prosedyren vil bidra til å generere verdifulle dyremodeller for studiet av CP og andre bukspyttkjertelsykdommer og kan brukes til å tilføre andre materialer (f.eks. virus, celler) i bukspyttkjertelen13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committees ved Medical University of South Carolina og Ralph H. Johnson Medical Center. C57BL/6J hannmus mellom 8-10 uker ble brukt i denne studien. Mus ble plassert under en standard 12 lys / 12 mørk syklus med ad libitumaccess til mat og vann.
1. Fremstilling av TNBS injeksjonsvæske, oppløsning
- Forbered 10% etanol i 0,9% saltvann. Løs opp lager TNBS (se Materialtabell) i 10 % etanol til en endelig konsentrasjon på 7,5 mM ved å tilsette 7,5 μL TNBS i 1 ml 10 % etanol.
FORSIKTIG: TNBS utgjør en kjemisk fare. Forbered løsningen inne i en avtrekkshette og bruk personlig verneutstyr som hansker, vernebriller og en labfrakk for å unngå direkte kontakt med TNBS. - Last 50 μL 0,75% TNBS-oppløsning i en insulinsprøyte med en 31-gauge nål. Legg 50 μL 10% etanol i saltvann i en sprøyte av samme størrelse som kjøretøykontroll. Plasser sprøytene på isen og beskytt dem mot lys til det er nødvendig.
2. Mus forberedelse og kirurgi
- Barber håret fra det abdominale kirurgiske området.
- Injiser en forkjøpsdose av smertestillende midler (f.eks. buprenorfin 0,1 mg/kg i.p.) før operasjonen.
- Induser og vedlikehold musen under generell anestesi med 1,5-2% isofluran og 1 l / min oksygen. Bekreft bedøvelsen ved å klemme tærne og observere dyret for mangel på refleks.
- Plasser musen på en oppvarmet kirurgisk pute under operasjonen. Påfør veterinær salve på hvert øye når musen er under anestesi.
- Desinfiser operasjonsstedet ved å tørke av det kirurgiske området 3x med 2% jod, etterfulgt av 70% alkohol (Materialfortegnelse).
- Utfør en laparotomi med mikrosaks for å generere et 0,5-1 cm snitt.
- Utsett duodenumet forsiktig og finn den vanlige gallekanalen ved hjelp av bomullspinne (Materialbord).
- Plasser en rett mikro hemoklips (Materialliste) over den proksimale vanlige kanalen for å forhindre flyt av TNBS eller kjøretøyløsninger i leveren og galleblæren (Figur 1A, B).
- Utsett forsiktig tolvfingertarmen og sett nålen inn i bukspyttkjertelen gjennom papillen til Vater.
- Når kanylen er inne i kanalen, plasserer du en buet mikro hemoklips (Materialbord) over tolvfingertarmen rundt nålen (figur 1A) for å feste kanylen på plass og forhindre at den injiserte oppløsningen kommer inn i tolvfingertarmen.
- Tilsett gradvis oppløsningen (TNBS eller kjøretøy) i bukspyttkjertelen i løpet av ett minutt.
MERK: TNBS må infunderes sakte over en minutt, og det er lett å kontrollere infusjonshastigheten når bukspyttkjertelen er perfundert med en insulinsprøyte med en 5/16 tommers og 31G nål. Hold hånden så stabil som mulig for å unngå å stikke gallekanalen. Hvis TNBS injiseres, kan gul farge være synlig inne i bukspyttkjertelen. - Etter infusjon, fjern mikroklemmen forsiktig nær leveren, og fjern deretter mikroklemmen som holder nålen og tolvfingertarmen.
- Returner duodenumet forsiktig til sin opprinnelige posisjon.
- La 0,5 ml varm steril saltvann (36-37 °C) ligge i bukhulen før lukking, for å hjelpe tolvfingertarmen tilbake til sin opprinnelige posisjon og assistere med gjenvinning av peristaltikk.
- Lukk snittet i muskellaget ved hjelp av kontinuerlig sutur med en 5-0 sting. Lukk huden med avbrutt sutur med en 4-0 sting.
- Plasser buret som inneholder mus på en varmepute for å tillate utvinning fra anestesi.
- Bekreft at musene er varme og i stand til spontan bevegelse før du returnerer dem til oppbevaringsrommet.
- Fortsett å gi smertestillende midler (f.eks. buprenorfin 0,1 mg/kg i.p.) hver 12.
3. Overvåke museatferd
- Fjern suturer på dag 7 etter operasjonen.
- Overvåk musens helse og oppførsel daglig i løpet av den første uken etter operasjonen. Se etter tegn på nød, for eksempel vokalisering, hengt tilbake holdning eller redusert bevegelse. Mål kroppsvekten annenhver dag.
- Bruk Von Frey monofilaments (VFFs) for å måle abdominal mekanisk overfølsomhet før, og 2, 3 uker etter operasjonen som beskrevet9,14.
- Påfør VFFer av forskjellige påførte krefter i stigende rekkefølge til øvre bukområde 10x hver 1-2 s. Vurder heving, tilbaketrekking eller slikking av magen (abstinensrespons) som en positiv respons.
- Påfør en sterkere stimulus hvis en positiv respons ikke observeres, og en svakere stimulans hvis en positiv respons observeres. Uttaksterskelen er kraften der musen svarer 50% av tiden.
4. Innsamling og histologisk analyse av bukspyttkjertelvev
- Ofre musene under anestesi ved cervical dislokasjon, og forsiktig disseker bukspyttkjertelen fra tarmen og andre organer.
- Fest bukspyttkjertelen i 10% paraformaldehyd i 24 timer, legg inn i paraffin, kutt vevsseksjoner på 5 μm tykkelse, og legg dem på glasssklier for farging.
- Utfør hematoksylin-eosin, og Massons trichrome farging ved hjelp av standardmetoder som tidligere rapportert4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gallekanalen infusjonsprosedyrene ble optimalisert for å redusere musedødelighet forbundet med denne prosedyren10. TNBS ble først gitt i et totalt volum på 35 μL eller 50 μL. Injeksjon av TNBS i et volum på 50 μL kan nå hele bukspyttkjertelen og indusere en mer homogen sykdom fenotype (Figur 1B). I tillegg kan injeksjon av TNBS ved hjelp av insulinsprøyte med 31G-nål bedre kontrollere infusjonshastigheten i forhold til vanlige sprøyter og nålestørrelser. Nylaget TNBS lagret på is og brukt innen en time etter legemiddelforberedelse ga også bedre resultat sammenlignet med TNBS forberedt lenger enn en time. Med disse forbedringene ble dødeligheten av mottakerne kontrollert og forble under 10%.
Kroppsvekttap er en av egenskapene til CP. Mus i kontrollgruppen mistet rundt 6% av sin opprinnelige kroppsvekt i løpet av de første 3 dagene etter operasjonen, og deretter gradvis gjenopprettet (104,6% av opprinnelig kroppsvekt på dag 21) (Figur 1C). Mus som fikk TNBS mistet derimot i gjennomsnitt omtrent 15% av sin opprinnelige kroppsvekt i løpet av de første 5 dagene og gjenvunnet vekt etterpå (99,8% av den opprinnelige kroppsvekten på dag 21) (Figur 1C). I tillegg, sammenlignet med kontroller, viste TNBS-mus økt abdominal mekanisk overfølsomhet ved 2 og 3 uker etter TNBS-injeksjon (Figur 1D), som sannsynligvis var forbundet med økt magesmerter10.
For å bekrefte at gallekanalen TNBS infusjon effektivt induserte bukspyttkjertelendringer som etterligner menneskelig CP, samlet vi bukspyttkjertelvev fra TNBS eller kjøretøybehandlede kontrollmus ved 3 uker etter operasjonen. Både størrelse og vekt per kroppsvekt i bukspyttkjertelen ble betydelig redusert hos TNBS-mus sammenlignet med kontroller (Figur 2A,B), noe som tyder på markert pankreasakkrofi i samsvar med funnene hos mennesker med alvorlig og langsiktig CP. I tillegg virket bukspyttkjertelen fra kontrollmusene normal uten åpenbare morfologiske endringer, mens TNBS-mus viste vakuolisering med massivt tap av acinarceller erstattet av fettcelleinfiltrasjon og fibrose (Figur 2C). Disse funnene var i samsvar med rapporter fra andre studier9,10.
Figur 1: TNBS gallekanalinfusjon for CP-musgenerering. (A) Illustrasjon av gallekanalinjeksjon. (B) Galle kanal etter injeksjon av 50 μL blekk. (C) Gjennomsnitt av kroppsvektsendring hos mus som mottar TNBS eller kjøretøy. (D) Abdominal respons terskel i TNBS og kontrollmus på 3 uker etter infusjon. Data ble analysert ved hjelp av tilgjengelig analyseprogramvare (f.eks. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Forskjeller mellom grupper ble analysert ved hjelp av Studentens t-test, ** p < 0,01 ble ansett som statistisk signifikante. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Karakterisering av CP hos TNBS-behandlede mus. (A) Mikrografer av bukspyttkjertelen fra kontroll (CTR) og TNBS mus. (B) Gjennomsnittlig vekt i bukspyttkjertelen delt på musens kroppsvekt hos CTR- og TNBS-mus. (C) Hematoksylin og eosinfarging av bukspyttkjerteldeler av CTR- og TNBS-mus. Skalalinje =100 μm. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. **, p < 0,01 ved Students t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gallekanalinfusjon av TNBS for å indusere kronisk pankreatitt er teknisk utfordrende hos mus, da opptil 22,5% av musene kan dø innen 3-4 dager etter legemiddelinfusjon10. Her raffinerte denne rapporten prosedyren basert på tidligere studier og reduserte tidlig musedødelighet til <10%. For eksempel kan det økte legemiddelvolumet (fra 35 μL til 50μL) sikre at stoffene når hele bukspyttkjertelen. Bruk av en insulinsprøyte og en mindre nålstørrelse (31G) reduserer potensiell skade på bukspyttkjertelkanalen og lekkasje av galle i galleblæren eller magen, noe som mest sannsynlig vil føre til musedød i løpet av de første dagene etter operasjonen. Klemming av begge ender av gallekanalen kan forhindre at TNBS lekker til galleblæren og tarmen, noe som kan forårsake dødelighet. Hemoklemmene begrenser TNBS i den injiserte bukspyttkjertelen, forbedrer effekten samtidig som den reduserer skader på andre vev. I tillegg er TNBS ikke stabil ved temperaturer over 0 °C. Derfor, ved å bruke nylagde TNBS, oppnådde CP-induksjon stabile resultater.
Denne protokollen induserer effektivt CP hos mannlige C57BL/6J-mus ved 8-12 ukers alder og genererer en modell som etterligner store symptomer på kronisk pankreatitt, inkludert kroppsvekttap, pankreasatrofi, fibrose og sannsynlig magesmerter. Sammenlignet med andre CP-musemodeller, er TNBS-modellen mye brukt til å evaluere smertestillende effekter i tillegg til betennelse10,15,16. Den andre fordelen med TNBS-modellen er at stoffet injiseres direkte i bukspyttkjertelen, noe som reduserer skade på andre organer som kan forstyrre studien17. Denne TNBS CP-musemodellen kan brukes til å studere patogenese samt behandlingsalternativer sammen med andre kroniske pankreatittmodeller.
En begrensning i denne studien er at bare mus mellom 8-10 uker ble brukt. Siden mus i forskjellige aldre kan ha forskjeller i bukspyttkjertelstørrelser, noe som følgelig påvirker TNBS-CP-utviklingen. Derfor, om mus i forskjellige aldre / størrelser skal gis en annen dose TNBS må testes. Likevel demonstrerer denne studien prosedyrene for vellykket utføre pankreaskanalinfusjon som kan hjelpe med studier fokusert på bukspyttkjertelsykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536), og National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394 og DK118529 til HW. Vi takker Dr. Hongju Wu for å dele teknisk erfaring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
