Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Summary

Apresentado aqui é um procedimento para expressar e purificar a minodã 5a seguida de uma discussão de sua caracterização, usando ensaios baseados em microscopia de fluorescência in vitro, e como esses métodos podem ser modificados para a caracterização da minosina não-musculo 2b.

Abstract

As proteínas da miosina se ligam e interagem com a actina filamentosa (F-actin) e são encontradas em organismos através da árvore filogenética. Sua estrutura e propriedades enzimáticas são adaptadas para a função particular que executam em células. Myosin 5a anda processivamente em F-actin para transportar melanomas e vesículas em células. Por outro lado, a miose não-sem-músculo 2b opera como um filamento bipolar contendo aproximadamente 30 moléculas. Move F-actin de polaridade oposta em direção ao centro do filamento, onde as moléculas de minosina trabalham assincronamente para ligar actina, transmitir um golpe de força e dissociar antes de repetir o ciclo. A minosina não-muscle 2b, juntamente com suas outras isoformas de miose não-cancerosa 2, tem papéis que incluem aderência celular, citocinese e manutenção de tensão. A mecanoquímica das miosinas pode ser estudada realizando ensaios de motilidade in vitro usando proteínas purificadas. No ensaio de filamento de actina deslizante, as miosinas são vinculadas a uma superfície de deslizamento de microscópio e translocam fluorescentemente rotulada F-actin, que pode ser rastreada. No ensaio de motilidade de molécula/conjunto único, no entanto, f-actin é vinculado a um deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas de minocina fluorescentemente rotuladas na F-actina é observado. Neste relatório, descreve-se a purificação da miose recombinante 5a de células Sf9 utilizando cromatografia de afinidade. Depois disso, descrevemos dois ensaios baseados em microscopia de fluorescência: o ensaio de filamento de actina deslizante e o ensaio de motilidade invertido. A partir desses ensaios, parâmetros como velocidades de translocação de actina e comprimentos de execução de molécula única e velocidades podem ser extraídos usando o software de análise de imagem. Essas técnicas também podem ser aplicadas para estudar o movimento de filamentos únicos das isoformas de miosina não-musada 2, aqui discutidas no contexto da miose não-musada 2b. Este fluxo de trabalho representa um protocolo e um conjunto de ferramentas quantitativas que podem ser usadas para estudar a dinâmica única de moléculas e conjuntos de miosinas não-omuscle.

Introduction

Miosinas são proteínas motoras que exercem força em filamentos de actina usando a energia derivada da hidrolise da adenosina triphosfato (ATP)¹. Myosins contêm um domínio de cabeça, pescoço e cauda. O domínio principal contém a região de ligação de actina, bem como o local de vinculação ATP e hidrólise. Os domínios do pescoço são compostos por motivos de QI, que se ligam a correntes de luz, calmodulin, ou proteínas semelhantes à calmodulina^2,3. A região da cauda possui várias funções específicas para cada classe de miosinas, incluindo, mas não se limitando à dimerização de duas cadeias ....

Protocol

1. Purificação de proteínas

1. Lise celular e extração de proteínas
   1. Prepare um buffer de extração de 1,5x com base na Tabela 1. Filtrar e armazenar a 4 °C.
   2. Comece a descongelar as pelotas de célula no gelo. Enquanto as pelotas estão descongelando, suplemente 100 mL de Tampão de Extração com dithiothiothreitol de 1,2 mM (DTT), 5 μg/mL leupepína, 0,5 μM de flúor de fenilmetilasulfonyl (PMSF) e dois comprimidos inibidores de protease. Mantenha-se no gelo.
   3. Uma vez que a pelota tenha descongelado, adicione 1 mL do buffer de extração suplementado por 10 mL de cultura celular. Por exemplo, se as pelotas celulares foram fo....

Results

A purificação da minosina pode ser avaliada pela realização da redução do sulfato-poliacrilamida do de sódio (SDS-PAGE) gel-eletroforese como mostrado na Figura 2. Embora este número represente a miosina final, pós-dialisada, o SDS-PAGE pode ser realizado em alíquotas das várias etapas do procedimento de purificação para identificar quaisquer produtos perdidos para o supernante. Myosin 5a HMM tem uma banda na faixa de 120-130 kDa e a mísampara não-hísmo 2b tem uma banda na faixa de 200-230 k.......

Discussion

Apresentado aqui é um fluxo de trabalho para a purificação e caracterização in vitro de minosina 5a e minosina não-musal 2b. Este conjunto de experimentos é útil para quantificar as propriedades mecanoquímicas de construções purificadas de miose de forma rápida e reprodutível. Embora as duas minodas aqui mostradas sejam apenas dois exemplos específicos das muitas possibilidades, as condições e técnicas podem ser aplicadas, com alguma alfaiataria, à maioria das miosinas e a muitas outras proteínas motoras.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Seringa	BD	309628
2 M CaCl2 Solução	VWR	10128-558
2 M MgCl2 Solução	VWR	10128-298
27 Agulha de calibre	Becton Dickinson	309623
Solução de NaCl 5 M	KD Medical	RGE-3270
Ácido Acético	ThermoFisher Scientific	984303
Acetato de amila	Ladd Research Industries	10825
Gel de afinidade anti-FLAG M2	Millipore Sigma	A2220
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATP	Millipore Sigma	A7699
Biotinilated G-Actin	Cytoskeleton, Inc.	AB07
Albumina de soro bovino	Millipore Sigma	5470
bPEG-silano	Laysan Bio, Inc	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Catalase	Millipore Sigma	C40
Linha Celular (Sf9) em SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Papel de Filtro Circular - Ensaio Deslizante	Papel
Millipore - Ensaio invertido	Millipore Sigma	WHA1001090
cComprimidos inibidores de protease completos e sem EDTA	Millipore Sigma	5056489001	Deve ser armazenado a 4 °C. Os comprimidos podem ser usados diretamente ou podem ser reconstituídos como uma solução estoque 25x, dissolvendo 1 comprimido em 2 mL de água destilada. A solução resultante pode ser armazenada a 4 & C por 1-2 semanas ou pelo menos 12 semanas a -20 °C.
Tubos de concentração (100.000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	O MWCO do tubo não é necessariamente "tamanho único", desde que o MWCO seja menor que o peso molecular total da proteína que está sendo purificada. O NM2b aqui foi concentrado com um tubo de 100.000 MWCO e o M5a foi concentrado com um tubo de 30.000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Coverslip Rack	Millipore Sigma	Z688568-1EA
strong>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay	VWR International	48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay	Tubo
da Azer Scientific (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	O diâmetro do tubo de diálise pode variar, mas o MWCO deve ser o mesmo. O NM2b aqui utilizado foi dialisado em um tubo de diálise de 18 mm. Os tubos podem ser armazenados em solução de álcool a 20% a 4 °C.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
DYKDDDDK Peptide	GenScript	RP10586	Isso pode ser dissolvido em um tampão contendo 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 e 10 mM MOPS (pH 7,2) até uma concentração final de 50 mg/mL. Isso pode ser armazenado a -20 &graus; C como 300 µ L alíquotas.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Elution Column	Bio-Rad	761-1550	Estes podem ser reutilizados. Para limpar, enxágue a coluna com 2-3 volumes de PBS e água destilada. Resfrie a coluna a 4° C antes de usar.
Etanol	Fischer Scientific	A4094
G-actina		PMID: 4254541	estoque de G-actina pode ser armazenado a 200 μ M em líquido N2.
Glicose	Millipore Sigma	G8270
Glicose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Solução Tampão Glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-295018
HaloTag	Promega	G100A
HCl	Millipore Sigma	320331
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Pontas de Pipeta de Orifício Grande	Fischer Scientific	02-707-134
Inibidor de Protease de Leupeptina	ThermoFisher Scientific	78435
Mark12 Escada Padrão Não Manchada	ThermoFisher Scientific	LC5677
Methanol	Millipore Sigma	MX0482
Methylcellulose	Millipore Sigma	M0512
Lâminas de Microscópio	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silano	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
Miosina Light Chain Kinase		PMID: 23148220	MLCK marcado com FLAG pode ser purificado da mesma forma que a miosina marcada com FLAG foi purificada aqui.
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
Nitrocelulose	Ladd Research Industries	10800
NuPAGE Gel de Proteína Mini Bis-Tris de 4 a 12%, 15-well	ThermoFisher Tampão
NuPAGE (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	O PMSF pode ser feito como uma solução estoque de 0,1 M em isopropanol e armazenado em 4 °C. A adição de isopropanol resulta em precipitação de cristais, que pode ser dissolvida agitando à temperatura ambiente. Imediatamente antes do uso, o PMSF pode ser adicionado gota a gota a uma solução de agitação rápida até uma concentração final de 0,1 mM.
Razor Blades	Office Depot	397492
Rhodamine-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	R415	Stock pode ser diluído em 100% de metanol até uma concentração final de 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientific	12658-027	Isso deve ser armazenado a 4° C. Seu prazo de validade é de 18 meses a partir da data de fabricação.
Placa Cultura de Tecidos - Ensaio Deslizante	Corning	353025	Cada placa de cultura de tecidos pode conter aproximadamente nove lamínulas.
Placa de cultura de tecidos - Ensaio invertido	Corning	353003	Cada placa de cultura de tecidos pode conter aproximadamente quatro lamínulas.
Lado liso 200 µ L Ponteiras de pipeta	Thomas Scientific	1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Microscope	Nikon	Modelo: Eclipse Ti com sistema H-TIRF com objetiva TIRF 100x (N.A. 1.49)
Câmera de microscópio	Andor	Modelo: iXon DU888 EMCCD camera (formato de sensor 1024 x 1024)
Microscope Environmental Control Box	Tokai HIT	Custom Thermobox
Microscope Laser Unit	Nikon	LU-n4 quatro unidades de laser com lasers de estado sólido para 405nm, 488nm, 561nm e 640nm
Mid Bench Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Modelo: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Plasma-Cleaner	Diener electronic GmbH + Co. KG	System Tipo: Sonda Zepto
Sonicator (3,2 mm)	Qsonica	4418
Incubadora padrão	Binder	Modelo: 56
Waverly Tube Mixer	Waverly	TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Versão 1.01)	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements	FAST está disponível para sistemas baseados em Mac OSX e Linux.
Plug-in do estabilizador de imagem	https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate	https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software	NIS Elements (pacote AR)
	http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
	https://github.com/turalaksel/FASTrack
	https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md