Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Resumo

Apresentado é um método de inflação do ar com fixação vascular de perfusão dos pulmões que preserva a localização de células dentro das vias aéreas, alvéolos e interstícios para análises estrutura-função. A pressão constante das vias aéreas é mantida com uma câmara de inflação do ar, enquanto fixação é perfundida através do ventrículo direito. Pulmões são processados para estudos histológicos.

Resumo

A histologia pulmonar é frequentemente usada para investigar as contribuições fornecidas pelas células do espaço aéreo durante a homeostase pulmonar e a patogênese da doença. No entanto, métodos de fixação comumente usados baseados em instillação podem deslocar células do espaço aéreo e muco para vias aéreas terminais e podem alterar a morfologia tecidual. Em comparação, as técnicas vasculares de fixação da perfusão são superiores na preservação da localização e morfologia das células dentro dos espaços aéreos e do revestimento mucosal. No entanto, se a pressão positiva das vias aéreas não for aplicada simultaneamente, regiões dos pulmões podem entrar em colapso e capilares podem se aprofundar nos espaços alveolares, levando à distorção da anatomia pulmonar. Aqui, descrevemos um método barato para a inflação do ar durante a fixação da perfusão vascular para preservar a morfologia e localização das vias aéreas e células alveolares e interstício em pulmões murinos para estudos histológicos a jusante. A pressão de ar constante é entregue aos pulmões através da traqueia de uma câmara selada e cheia de ar que mantém a pressão através de uma coluna líquida ajustável enquanto fixação é perfundida através do ventrículo direito.

Introdução

A histologia pulmonar representa o padrão ouro para avaliar a arquitetura pulmonar durante a saúde e a doença e é uma das ferramentas mais utilizadas pelos pesquisadores pulmonares¹. Um dos aspectos mais críticos dessa técnica é o isolamento e preservação adequados do tecido pulmonar, uma vez que a variabilidade nesta etapa pode levar à má qualidade do tecido e resultados errôneos^1,2,3. Em animais vivos, o volume pulmonar é determinado pelo equilíbrio entre o recuo elástico interno do pulmão e as forças externas transmitidas da parede torácica e do dia....

Protocolo

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Saúde Nacional Judaica.

NOTA: O protocolo é organizado em três componentes. O primeiro componente detalha a construção da inflação do ar com equipamento de perfusão/fixação. Uma segunda seção descreve como configurar o equipamento para um experimento. A seção final descreve como preparar o animal e realizar o experimento.

1. Construção do aparelho da coluna de água (Figura 1B)

1. Remova o êmbolo de uma seringa de ponta de deslizamento de 60 mL.

Resultados

Em um tórax intacto, os pulmões são mantidos abertos por forças externas aplicadas pela parede do peito através do espaço pleural^6,14. Quando o diafragma é introduzido durante a dissecção, a integridade do espaço pleural é abolida e os pulmões devem entrar em colapso(Figura 2A, 2B). Para rees expander os pulmões, a inflação do ar é realizada. Como primeiro passo, 25 cm de pressão da água são aplicados para garantir o.......

Discussão

Embora comumente usados, métodos de fixação baseados em intratraqueal deslocam leucócitos das vias aéreas e podem alterar a arquitetura pulmonar normal. O método de inflação do ar com fixação vascular de perfusão que é fornecido neste protocolo supera essas armadilhas e preserva com mais precisão a anatomia pulmonar. As chaves para obter tecido de alta qualidade a partir do método de fixação vascular da perfusão incluem o monitoramento cuidadoso das pressões da inflação do ar, evitar vazamentos de ar e garantir a perfusã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
00117XF-Torneira 1 via 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Torneira
BD Seringa de 60 mL, ponta deslizante	BD	309654	Seringa usada para construir a coluna
de água BD Agulha PrecisionGlide 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Agulha para perfusão/fixação vascular
Estilo Luer Fêmea Montagem em Painel 1/4-28 UNF para Macho Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Fêmea Luer
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína	Sigma-Aldrich	H3393	Solução de heparina.
Adaptador Luer-Stub BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Adaptador Luer-Stub
Macho Luer (2) para Fêmea Luer Estilo Rosca Tee	Nordson Medical	LT787-9	Macho Luer
Nalgene 180 Tubo de PVC de Plástico Transparente	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Solução
Aquosa de Paraformaldeído - 32%	Microscopia Eletrônica Sciences	15714-S	Solução fixadora. Diluído a 4% com solução salina tamponada com fosfato
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker para vedação hermética de câmaras
salina tamponada com fosfato, 1x sem cálcio e magnésio	Garrafa Corning	21-040-CV	usada para construir a câmara de inflação de ar e tampão usado para heparina e soluções
fixadorasSterilite Ultra Seal 16.0 copo retângulo recipiente de armazenamento de alimentos	Sterilite	0342	Recipiente de processamento animal

Solução