Summary
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata per l'allotrapianto generazionale iniziale e continuo di tumori della Drosophila nell'addome di ospiti adulti per lo studio di vari aspetti della neoplasia. Utilizzando un apparato autoiniettore, i ricercatori possono ottenere una migliore efficienza e resa tumorale rispetto a quelli ottenuti con metodi manuali tradizionali.
Abstract
Questo protocollo descrive l'allotrapianto di tumori in Drosophila melanogaster utilizzando un apparato di iniezione auto-nanolitro. Con l'uso di un apparato autoiniettore, gli operatori addestrati possono ottenere risultati di trapianto più efficienti e coerenti rispetto a quelli ottenuti utilizzando un iniettore manuale. Qui, copriamo gli argomenti in modo cronologico: dall'incrocio delle linee di Drosophila , all'induzione e dissezione del tumore primario, al trapianto del tumore primario in un nuovo ospite adulto e al trapianto generazionale continuato del tumore per studi estesi. Come dimostrazione, qui usiamo i tumori ad anello immaginale indotti dalla sovraespressione della ghiandola salivare indotti dal dominio intracellulare di Notch (NICD) per il trapianto generazionale. Questi tumori possono prima essere indotti in modo affidabile in un microambiente della zona di transizione all'interno degli anelli immaginali della ghiandola salivare larvale, quindi allografati e coltivati in vivo per studiare la continua crescita, l'evoluzione e le metastasi del tumore. Questo metodo di allotrapianto può essere utile in potenziali programmi di screening farmacologico, nonché per lo studio delle interazioni tumore-ospite.
Introduction
Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per l'allotrapianto di tumori dell'anello immaginale della ghiandola salivare larvale (SG) di Drosophila negli addominali di ospiti adulti utilizzando un apparato di iniezione di auto-nanoliti (ad esempio, Nanoject). Questo protocollo fornisce anche indicazioni per la successiva ri-allocuzione dei tumori in nuove generazioni di ospiti adulti, che offre opportunità per uno studio longitudinale continuo delle caratteristiche del tumore, come l'evoluzione del tumore e le interazioni tumore-ospite. Il protocollo può anche essere applicato a esperimenti di screening dei farmaci.
Questo metodo è stato sviluppato per migliorare l'efficacia dell'esecuzione dell'allotrapianto tumorale in Drosophila utilizzando iniettori manuali1, che sono spesso incoerenti nelle loro forze di aspirazione e iniezione, portando a risultati non ottimali per l'allotrapianto tumorale. Un apparato autoiniettore fornisce un migliore controllo e può comportare tassi più bassi di mortalità delle mosche dopo l'allotrapianto. Un operatore addestrato potrebbe raggiungere un tasso di sopravvivenza dell'ospite di oltre il 90% con l'autoiniettore, rispetto a circa l'80% quando è stato utilizzato l'iniettore manuale1. Il tasso complessivo di acquisizione del tumore è del 60%-80% al giorno 8-12 post-allotrapianto. Anche il tempo medio di iniezione è stato migliorato da 30-40 s per mosca utilizzando un iniettore manuale a 20-25 s per mosca utilizzando l'autoiniettore.
Questo protocollo è tra i primi protocolli ad utilizzare l'apparato autoiniettore nell'allotrapianto del tumore Drosophila . Un recente studio ha anche utilizzato l'autoiniettore per l'allotrapianto di cellule staminali neurali tumorali2. In precedenza, l'apparato autoiniettore è stato utilizzato in Drosophila per studiare la virulenza batterica3, le infezioni parassitarie e la difesa dell'ospite4, nonché lo screening per la bioattività di diversi composti5. Il nostro protocollo adatta l'apparato autoiniettore per l'uso di iniezione tumorale e cerca di fornire ai ricercatori di Drosophila risultati di qualità superiore e più coerenti, risparmiando loro molto tempo. Questo protocollo può essere utilizzato non solo per l'allotrapianto di tumori, ma può anche essere adattato all'allotrapianto di tessuti wildtype e mutanti di calibro simile6.
Il tumore Drosophila NICD utilizzato in questo protocollo è stato introdotto per la prima volta da Yang et al.7 nella zona di transizione dell'anello immaginale SG, un "hotspot tumorale" che presenta alti livelli di endogena Janus Kinase / Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT) e c-Jun N-terminal Kinase (JNK) attività. Inoltre, la zona di transizione ha alti livelli di metalloproteinasi-1 della matrice (MMP1)7, il che rende questa regione particolarmente favorevole alla tumorigenesi. L'attivazione della via di Notch attraverso la sola sovraespressione di NICD è sufficiente per avviare costantemente la formazione del tumore. Questi tumori possono essere successivamente allotrapiantati per consentire l'indagine di una vasta gamma di argomenti, tra cui la divisione delle cellule tumorali, l'invasione e le interazioni tumore-ospite.
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Protocol
1. Preparazione del tumore dell'anello immaginale SG
- Incrocia le mosche adulte con genotipi di UAS-NICD (maschio: 10-15 mosche) e Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (femmina vergine: 10-15 mosche) e permetti loro di riprodursi per 1 giorno a 18 °C. Le mosche adulte selezionate dovrebbero avere 5-9 giorni per garantire un'elevata fertilità.
- Lasciare che le mosche adulte depongano le uova nel cibo per mosche contenuto in flaconcini per 24 ore a 18 °C, quindi rimuovere le mosche adulte.
NOTA: il cibo volante viene preparato utilizzando la ricetta standard di farina di mais del Drosophila Stock Center8. Ogni flaconcino deve contenere circa 10 ml di cibo per mosche. - Lasciare incubare le uova per 6 giorni a 18 °C. Durante questo periodo, le larve si schiuderanno.
- Trasferire i flaconcini contenenti larve in un incubatore a 29 °C e incubare per altri 7 giorni.
NOTA: questa fase di incubazione è facoltativa a seconda del progetto sperimentale specifico.
2. Preparazione di Drosophila selvatica adulta per allotrapianto
- Anestetizzare mosche adulte mutanti di tipo selvatico o appropriate con CO2 al 100% e ordinare le mosche in base ai sessi. Sia le mosche maschili che quelle femminili possono essere utilizzate come ospiti tumorali.
- Fissare un pezzo di nastro adesivo lungo 5 cm a un vetrino per microscopio con il lato appiccicoso verso l'alto fissandolo con due pezzi di nastro più piccoli, uno a ciascuna estremità.
- Immobilizza le mosche aderendo le loro ali al nastro. Usa la pinza mentre manovra le mosche.
- Ripeti il passaggio precedente per 60-80 mosche adulte utilizzate come accettori di allotrapianto.
NOTA: è meglio organizzare le mosche in file ordinate, con il loro asse del corpo allineato parallelamente l'uno all'altro per un processo di iniezione più efficiente in termini di tempo in seguito. La Figura 1 mostra le file di mosche host registrate in questo modo.
- Ripeti il passaggio precedente per 60-80 mosche adulte utilizzate come accettori di allotrapianto.
3. Assemblaggio dell'apparato autoiniettore
- Collegare sia l'apparato dell'autoiniettore che il cavo di alimentazione alla scatola del controller.
- Impostare il volume di iniezione a 59,8 nL. Ciò contribuirà a mantenere la quantità appropriata di forze di aspirazione e iniezione durante l'allotrapianto.
- Posizionare la scatola del controller e l'autoiniettore sui lati opposti del microscopio ottico.
NOTA: Per gli operatori destrimani, la scatola di controllo deve essere posizionata sul lato sinistro del microscopio con l'iniettore sul lato destro. Viceversa per gli operatori mancini. - Preparare il capillare di vetro da 3,5 '' per l'uso tagliando l'estremità chiusa con una pinza.
- Elaborare un'estremità del capillare di vetro utilizzando un estrattore di micropipette a quattro fasi e riscaldare su un'estremità stretta e chiusa utilizzando le seguenti specifiche nello strumento: Calore = 650, Forza = 200 e Distanza = 8. Posizionare ordinatamente i capillari nell'apparato estrattore ed eseguire il programma dopo aver inserito le impostazioni di cui sopra.
- Utilizzare una pinza per agganciare il capillare con un angolo di circa 60 ° per creare un'estremità più affilata per un facile ingresso nell'addome della mosca adulta1. Vedere la Figura 2 per un esempio di capillare ben tagliato.
- Svitare leggermente il cappuccio dell'iniettore. Tenere premuto il pulsante Vuoto per far avanzare l'ago dell'iniettore fino a visualizzare il 70%-80% della sua lunghezza totale. Per accelerare l'avanzamento capillare, premere una volta il pulsante Riempi tenendo premuto contemporaneamente il pulsante Vuoto .
- Utilizzare una siringa per riempire il capillare di vetro con olio minerale. Quindi, inserire con attenzione il capillare di vetro sull'ago dell'iniettore fino a quando il primo non è saldamente fissato al tappo di gomma dell'iniettore. Ora avvitare saldamente il cappuccio dell'iniettore.
- Pulire il residuo di olio minerale sulla superficie esterna del coperchio capillare di vetro per evitare di contaminare il mezzo durante l'allotrapianto.
4. Dissezione del tumore dell'anello immaginale SG
- Selezionare una delle larve e trasferirla in una piastra di dissezione riempita con 100 μL di Medium di Schneider per prepararsi alla dissezione del tumore dell'anello immaginale SG.
NOTA: Solo i campioni che ospitano il tumore rimarranno come larve. Questo perché la crescita del tumore ritarda lo sviluppo e la progressione larvale9. Due terzi dei campioni non ospiteranno il tumore e saranno quindi progrediti in pupe / adulti.- Per scopi di dissezione e allotrapianto, utilizzare uno stereomicroscopio con un intervallo di ingrandimento 10x-20x.
- Usando un paio di pinze per tenere la sezione centrale del corpo larvale, pizzicare la testa larvale usando un altro paio di pinze e applicare una forza di allungamento longitudinalmente.
- Individuare il SG a forma di Y delle larve e isolarlo dal resto del tessuto larvale10.
- Sezionare e isolare il tumore dell'anello immaginale SG rimuovendo il tessuto adiacente. Vedere la Figura 3 per una rappresentazione di questo processo di dissezione.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.4 per ulteriori tumori ad anello immaginale da 10 a 20 SG in base alle esigenze di ricerca.
5. Allotrapianto del tumore primario dell'anello immaginale SG
- Immergere il capillare nel mezzo di Schneider contenente i tumori primari dell'anello immaginale SG. Tenere premuto il pulsante Fill per riempire il capillare di vetro con il Medium di Schneider fino al segmento superiore di 0,5 cm. Questo segmento superiore dovrebbe rimanere pieno di olio minerale.
NOTA: accelera questo processo premendo una volta il pulsante Svuota e tenendo contemporaneamente premuto il pulsante Riempi. - Individuare un tumore primario e premere il pulsante Fill fino a quando il tumore viene aspirato nel capillare.
- Assicurarsi che il tumore si trovi sulla punta del capillare o a diversi millimetri di distanza dalla punta del capillare. Questo aiuta ad evitare che il tumore vada alla deriva e si perda nella soluzione contenuta all'interno del capillare. Vedere la Figura 4A per una dimostrazione della posizione appropriata del tumore mentre si trova nel capillare.
- Individuare una mosca adulta immobilizzata al nastro sul vetrino del microscopio. Usando la pinza, tenere delicatamente premuto l'addome inferiore. Quindi, perforare la cuticola laterale inferiore dell'addome con il capillare. Premere il pulsante Vuoto fino a quando il tumore entra nel nuovo addome ospite. Vedere la Figura 4B per una dimostrazione di questa tecnica.
- Usando la pinza, pizzicare delicatamente le ali dell'ospite per rimuoverlo dal nastro. Metti l'ospite in una nuova fiala con cibo fresco. È meglio posizionare il flaconcino lateralmente per le 24 ore iniziali dopo l'iniezione. Ogni flaconcino deve contenere solo fino a un massimo di 20 mosche.
NOTA: Alcune mosche ospiti avranno ali mancanti e altre ferite sui loro corpi dopo l'iniezione e potrebbero attaccarsi al cibo per mosche se la fiala è posizionata in posizione verticale. - Ripetere i passaggi da 5.2 a 5.4 per trapiantare i tumori primari rimanenti nei loro nuoviospiti adulti.
- Gettare i capillari nel contenitore dei taglienti e pulire il residuo di olio minerale dall'esterno dell'autoiniettore prima di sostituire l'apparecchio nella sua scatola.
- Conservare il flaconcino di ospiti a temperatura ambiente per 1 giorno, quindi trasferire il flaconcino in una camera di incubazione a 29 °C. Trasferisci gli host di volo su nuove fiale ogni 2-3 giorni.
- Monitora quotidianamente gli ospiti della mosca e calcola i tassi di sopravvivenza. Dopo una settimana, i tumori dovrebbero essere visibili sotto uno stereomicroscopio con adattatore di fluorescenza e possono essere continuamente monitorati per le loro dimensioni e progressione.
6. Re-allotrapianto di tumori trapiantati
- Circa 10-14 giorni dopo l'allotrapianto, screening per i tumori che sono cresciuti negli addominali ospiti utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Anestetizzare un ospite con CO2 e metterlo in una piastra di dissezione riempita con 100 μL Schneider's Medium. Sezionare il tumore allografato cresciuto dall'ospite usando due paia di pinze.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere premuto l'addome e l'altra coppia per incidere aprire la cuticola addominale, esponendo il tumore allografato1.
- Isolare accuratamente il tumore dai tessuti ospiti attaccati il più possibile utilizzando marcatori di fluorescenza come guida.
- Ripetere il passaggio 6.2 per prepararsi a due o tre ulteriori tumori allografati.
- Trasferire la piastra di dissezione contenente i tumori raccolti sullo stadio di un microscopio ottico.
- Utilizzare aghi sterili e sezionare i tumori in pezzi più piccoli che sono appropriati per le dimensioni del capillare.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per preparare la nuova generazione di ospiti adulti e ripetere i passaggi 5.1-5.7 per completare l'allotrapianto dei tumori.
NOTA: I tassi di successo sono generalmente più alti per i tumori non primari rispetto a quelli dei tumori primari. - Ripetere i passaggi 6.1-6.6 per ogni successiva generazione di mosche utilizzate nello studio.
NOTA: Scegliere le linee host di Drosophila appropriate per le esigenze sperimentali.
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Representative Results
Qui, abbiamo effettuato l'allotrapianto generazionale di tumori dell'anello immaginale SG utilizzando l'apparato autoiniettore di iniezione di nanoliti e condotto il successivo imaging dal vivo del tumore con un microscopio a scansione laser confocale, che ha permesso un'immersione più approfondita in argomenti di crescita tumorale, migrazione delle cellule tumorali e interazioni tumore-ospite. Quando si montano le mosche, incollarle a un vetrino per microscopio e trattenerle tramite un blocco11 di polidimetilsilossano (PDMS).
La Figura 5A presenta una cattura di imaging dal vivo di un tumore dell'anello immaginale SG di1a generazione (G1) che cresce in un addome ospite adulto il giorno 10 dopo l'allotrapianto. Questo livello di imaging può essere utilizzato per tracciare il processo di divisione del tumore. La Figura 5B raffigura un tumore dell'anello immaginale SG di6a generazione (G6) che occupa una grande porzione dell'addome ospite il giorno 10 dopo l'allotrapianto. L'imaging in questa fase può aiutare a rivelare i modelli di crescita del tumore, così come i suoi comportamenti di migrazione e invasione. È importante notare che anche se questa immagine è stata catturata utilizzando un microscopio a scansione laser confocale, uno stereomicroscopio con un adattatore di fluorescenza GFP potrebbe anche essere utilizzato con ingrandimento da 2x a 5x, a seconda delle dimensioni del tumore.
Figura 1: Mosche ospiti registrate e protette per l'allotrapianto. Le mosche ospiti sono fissate dalle loro ali e orientate ordinatamente per prepararsi alla successiva procedura di trapianto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Un capillare di iniezione ben tagliato. La freccia rossa indica un bordo tagliente necessario per perforare efficacemente la cuticola addominale degli ospiti adulti di Drosophila . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dissezione del tumore ImR della ghiandola salivare primaria. Il processo di dissezione e isolamento di due tumori primari della ghiandola salivare ImR è dimostrato cronologicamente dal pannello (A) al pannello (B), utilizzando due incisioni separate. Il pannello (A) mostra la ghiandola salivare prima della dissezione del tumore. Le punte di freccia rosse indicano i primi punti di incisione. Le punte di freccia blu indicano i secondi punti di incisione. Il tumore si trova tra le punte di freccia rosse e blu. Il pannello (B) mostra il tumore ImR isolato dopo che le due incisioni sono state fatte per separarlo dal normale tessuto delle ghiandole salivari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Posizione appropriata del tumore all'interno del capillare e iniezione del tumore nell'addome ospite di Drosophila . Il pannello (A) mostra la posizione tumorale più appropriata all'interno del capillare. Il tumore esprime eGFP (488 nm). Il pannello (B) mostra il processo di iniezione. La freccia rossa indica il sito di iniezione del tumore. La freccia blu mostra il posizionamento della pinza per aiutare a tenere premuta la terminalia della mosca per un'iniezione più facile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Un tumore ImR G1 e G6 osservato nell'addome ospite di Drosophila WT il giorno 10 dopo l'allotrapianto. Queste sono viste ventrali dell'addome della mosca con i tumori trapiantati in verde. Il pannello (A) mostra un tumore G1 al giorno 10 post-allotrapianto che esprime eGFP (488 nm). Il pannello (A) viene catturato utilizzando un microscopio confocale utilizzando un obiettivo 20x con 0,8 NA e zoom 3x. Il pannello (B) mostra un tumore G6 al giorno 10 dopo l'allotrapianto che esprime eGFP (488 nm). Il pannello (B) viene catturato utilizzando un microscopio confocale utilizzando un obiettivo 5x con 0,25 NA e uno zoom di scansione 1x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'allotrapianto tumorale può aiutare i ricercatori ad affrontare alcuni problemi che sorgono durante la crescita e la progressione del tumore Drosophila. Una di queste sfide è l'elusione delle morti premature di larve o adulti portatori di tumore durante la coltura tumorale primaria12. In questo contesto, l'allotrapianto tumorale continuo consente ai tumori di crescere indefinitamente, il che facilita gli studi longitudinali sulla crescita, le metastasi e l'evoluzione del tumore. L'allotrapianto tumorale è utile anche per valutare vari aspetti delle interazioni ospite-tumore 7,13. I genotipi dell'ospite possono essere manipolati prima dell'allotrapianto tumorale per consentire la valutazione dell'effetto dell'ospite sulla crescita e la migrazione del tumore e sulla cachessia indotta dal tumore14,15. Gli ospiti volanti con genotipi diversi possono presentare manifestazioni distinte di deperimento simile alla cachessia in risposta allo stesso tumore. Dopo l'allotrapianto, gli ospiti tumorali possono essere montati in preparazione per l'imaging in vivo utilizzando un protocollo adattato da Koyama et al. e Ji et al.11,16.
L'applicazione dell'apparato autoiniettore verso l'allotrapianto del tumore Drosophila fornisce un protocollo conveniente e diretto che possiede una maggiore efficienza. Rispetto all'iniettore manuale1, questo metodo consente allotrapianti riproducibili e su larga scala, che possono accelerare e standardizzare gli studi sul comportamento tumorale e le procedure di screening farmacologico. Questo metodo migliorato produce impressionanti tassi di sopravvivenza dell'ospite e di resa tumorale. Un ricercatore addestrato può raggiungere tassi di sopravvivenza dell'ospite post-allotrapianto del >90%. I tassi di resa tumorale possono differire a seconda che il tumore sia primario o ri-allografato. I ricercatori possono aspettarsi di raggiungere tassi di resa tumorale del >50% per i tumori primari e >70% per i tumori re-allografati. Inoltre, questo metodo riduce il tempo di iniezione per mosca ospite di quasi il 50% rispetto al metodo dell'iniettore manuale.
Questa procedura ha i suoi limiti, tuttavia, principalmente a causa dell'incoerenza dell'incisione tumorale, della posizione di iniezione e delle dimensioni della ferita. Se i tumori primari non vengono tagliati in frammenti di dimensioni uniformi prima dell'allotrapianto, alcuni ospiti di mosche possono ricevere frammenti più grandi di altri. Questo è un fattore confondente che influenza gli studi che mirano a monitorare il tasso di crescita del tumore. Questo può potenzialmente essere mitigato misurando il tasso differenziale di crescita del tumore a intervalli di due giorni dopo l'allotrapianto. Inoltre, durante l'iniezione, l'operatore deve scegliere un sito coerente nella cuticola addominale su tutte le mosche ospiti. Questo aiuta a mitigare un'altra variabile confondente che può influenzare la sopravvivenza dell'ospite della mosca e la posizione finale dell'attaccamento del tumore.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare tra gli autori.
Acknowledgments
Ringraziamo gli ex membri del laboratorio Dr. Sheng-An Yang e Mr. Juan-Martin Portilla per il loro contributo nello sviluppo di questo protocollo. Siamo grati al laboratorio del Dr. Yan Song presso la Scuola di Scienze della Vita dell'Università di Pechino per aver condiviso il loro protocollo sull'allotrapianto manuale. Ringraziamo anche il signor Calder Ellsworth e il signor Everest Shapiro per la lettura critica del manoscritto.
WMD ha ricevuto finanziamenti (GM072562, CA224381, CA227789) per questo lavoro dal National Institute of Health (https://www.nih.gov/) e finanziamenti (IOS-155790) dalla National Science Foundation (htps://nsf.gov/). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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