Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per produrre matrici di microtessuti del muscolo scheletrico umano 3D e saggi di funzione minimamente invasivi a valle in situ, comprese le analisi della forza contrattile e della manipolazione del calcio.
Abstract
I modelli tridimensionali (3D) in vitro del muscolo scheletrico sono un prezioso progresso nella ricerca biomedica in quanto offrono l'opportunità di studiare la riforma e la funzione del muscolo scheletrico in un formato scalabile che è suscettibile di manipolazioni sperimentali. I sistemi di coltura muscolare 3D sono desiderabili in quanto consentono agli scienziati di studiare il muscolo scheletrico ex vivo nel contesto delle cellule umane. I modelli 3D in vitro imitano da vicino gli aspetti della struttura tissutale nativa del muscolo scheletrico adulto. Tuttavia, la loro applicazione universale è limitata dalla disponibilità di piattaforme semplici da fabbricare, costose e facili da usare e producono quantità relativamente elevate di tessuti muscolari scheletrici umani. Inoltre, poiché il muscolo scheletrico svolge un importante ruolo funzionale che è compromesso nel tempo in molti stati patologici, una piattaforma sperimentale per studi di microtissue è più pratica quando le misurazioni minimamente invasive del calcio transitorio e della forza contrattile possono essere condotte direttamente all'interno della piattaforma stessa. In questo protocollo, viene descritta la fabbricazione di una piattaforma a 96 pozzi nota come "MyoTACTIC" e la produzione in massa di microtissue del muscolo scheletrico umano 3D (hMMT). Inoltre, vengono riportati i metodi per un'applicazione minimamente invasiva della stimolazione elettrica che consente misurazioni ripetute della forza muscolare scheletrica e della manipolazione del calcio di ciascuna microtessuta nel tempo.
Introduction
Il muscolo scheletrico è uno dei tessuti più abbondanti nel corpo umano e supporta funzioni chiave del corpo come la locomozione, l'omeostasi del calore e il metabolismo1. Storicamente, modelli animali e sistemi di coltura cellulare bidimensionali (2D) sono stati utilizzati per studiare i processi biologici e la patogenesi della malattia, nonché per testare composti farmacologici nel trattamento delle malattie del muscolo scheletrico2,3. Mentre i modelli animali hanno notevolmente migliorato la nostra conoscenza del muscolo scheletrico in salute e nelle malattie, il loro impatto traslazionale è stato ostacolato da costi elevati, considerazioni etiche e differenze interspecie2,4. Rivolgendosi ai sistemi basati su cellule umane per studiare il muscolo scheletrico, i sistemi di coltura cellulare 2D sono favorevoli grazie alla loro semplicità. Tuttavia, c'è una limitazione. Questo formato spesso non riesce a ricapitolare le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare che si verificano naturalmente all'interno del corpo5,6. Negli ultimi anni, i modelli di muscolo scheletrico tridimensionale (3D) sono emersi come una potente alternativa ai modelli animali interi e ai sistemi di coltura 2D convenzionali consentendo la modellazione di processi fisiologicamente e patologicamente rilevanti ex vivo7,8. In effetti, una pletora di studi ha riportato strategie per modellare il muscolo scheletrico umano in un formato di coltura 3D bioartificiale1. Una limitazione per molti di questi studi è che la forza attiva viene quantificata in seguito alla rimozione dei tessuti muscolari dalle piattaforme di coltura e all'attaccamento a un trasduttore di forza, che è distruttivo e quindi limitato a servire come endpoint assay9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Altri hanno progettato sistemi di coltura che consentono metodi non invasivi di misurazione della forza attiva, ma non tutti sono suscettibili di applicazioni di test molecolari ad alto contenuto7,8,9,10,14,18,22, 23,24,25,26,27,28 ,29.
Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per fabbricare microtessuti muscolari umani (hMMT) nella piattaforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del muscolo scheletrico (MyoTACTIC); un dispositivo a piastra a 96 pozzetti che supporta la produzione in blocco di microtissue del muscolo scheletrico 3D30. Il metodo di fabbricazione della piastra MyoTACTIC consente la generazione di una piastra di coltura da 96 pozzettilsilossano (PDMS) e tutte le caratteristiche corrispondenti del pozzo in una singola fase di fusione, per cui ogni pozzo richiede un numero relativamente piccolo di cellule per la formazione di microtessuti. I microsessu formati all'interno di MyoTACTIC contengono miotubi allineati, striati e multinucleati che sono riproducibili da un pozzo all'altro del dispositivo e, una volta maturati, possono rispondere a stimoli chimici ed elettrici in situ30. Qui, la tecnica per produrre un dispositivo a piastra di coltura PDMS MyoTACTIC da una replica in poliuretano (PU), un metodo ottimizzato per implementare cellule progenitrici miogeniche umane immortalizzate per fabbricare hMMT e la valutazione funzionale della generazione di forza hMMT ingegnerizzata e delle proprietà di manipolazione del calcio sono delineate e discusse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabbricazione di lastre PDMS MyoTACTIC
NOTA: la fabbricazione di piastre PDMS MyoTACTIC richiede uno stampo negativo in PU, che può essere prodotto come descritto in precedenza30. Il file SolidWorks CAD (computer-aided design) per il design della piastra MyoTACTIC è stato reso disponibile su GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Preparare ~ 110 g di soluzione polimerica PDMS in un bicchiere di plastica monouso con un rapporto 1:15 tra monomero e agente polimerizzante utilizzando i componenti del kit di elastomeri siliconici. Mescolare la soluzione polimerica per 2-3 minuti utilizzando una pipetta sierologica monouso da 5 ml fino a quando non è completamente miscelata e omogenea.
ATTENZIONE: Evitare il contatto della soluzione polimerica PDMS con la pelle e gli occhi; ed evitare l'inalazione. Indossare sempre un camice da laboratorio e guanti monouso quando si maneggia la miscela PDMS liquida e fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza (SDS) per protocolli di sicurezza specifici.
NOTA: Proteggere le superfici delle apparecchiature (ad esempio, bilancia, piano di lavoro, ecc.) con un rivestimento monouso in caso di fuoriuscita di soluzione polimerica PDMS. - Degassare la miscela a temperatura ambiente posizionando la tazza all'interno di una camera a vuoto da banco collegata a una pompa per vuoto a secco standard per ~ 30 minuti o fino a quando tutte le bolle non vengono rimosse. Rompere il vuoto ogni 5-10 minuti per aiutare nel degasaggio. Utilizzare un barilotto vuoto da 50 mL per immergere l'aria ed espellere eventuali bolle rimanenti sulla superficie della miscela polimerica secondo necessità.
NOTA: un pezzo di tubo ID da 6,35 mm può essere utilizzato per collegare una punta della pipetta P1250 alla canna per migliorare la velocità e la precisione del flusso d'aria. - Mentre la soluzione polimerica PDMS si sta degassando, rimuovere eventuali pezzi rimanenti di PDMS aderenti allo stampo negativo PU pulendo delicatamente i bordi e la superficie con un tovagliolo di carta asciutto. Utilizzare aria compressa dell'impianto, impostata su 70-100 kPag per rimuovere le particelle fini rimanenti.
NOTA: Proteggere lo stampo negativo in PU da danni e dall'accumulo di particolato mettendolo in un sacchetto di plastica sigillabile e conservandolo all'interno di un cassetto protetto dal traffico di laboratorio. - Posizionare lo stampo in PU in una cappa chimica che è stata protetta con un rivestimento monouso. Posizionare lo stampo orizzontalmente a ~ 75 ° e spruzzare la superficie attiva con uno strato uniforme di distaccante. Spruzzare lo stampo dall'alto verso il basso, quindi da sinistra a destra, tenendo la lattina a 15-20 cm dallo stampo e utilizzando un movimento fluido avanti e indietro. Ruotare lo stampo di 180 ° e ripetere gli spruzzi, quindi lasciare riposare lo stampo in PU nella cappa chimica per 10-15 minuti per asciugare.
ATTENZIONE: assicurarsi che il distaccante sia utilizzato all'interno di una cappa aspirante chimica, evitare il contatto con la pelle e gli occhi e fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza (SDS) per protocolli di sicurezza specifici
NOTA: un film sottile deve coprire completamente la superficie attiva, ma un rivestimento eccessivo può essere trasferito al PDMS nella fase successiva, che a sua volta può avere un impatto negativo sulla semina hMMT. La superficie dovrebbe essere liscia al tatto ma non bagnata. - Versare 100 g di PDMS in modo uniforme nello stampo pu e posizionarlo all'interno di una camera a vuoto collegata a una pompa per vuoto rotativa a palette. Degasare lo stampo riempito con PDMS per ~ 45 minuti, rompendo il sigillo sottovuoto ogni 5-10 minuti per i primi 20 minuti per accelerare il processo. Lasciare all'interno della camera a vuoto fino a quando la miscela PDMS è completamente priva di tutte le bolle.
NOTA: una pompa per vuoto rotativa a palette viene utilizzata per ottenere un vuoto inferiore e ridurre il tempo necessario per questa fase. Il degasaggio dello stampo riempito con PDMS può essere eseguito utilizzando la camera a vuoto da banco e la pompa per vuoto a secco standard, tuttavia, il tempo per svuotare la miscela di tutte le bolle sarà più lungo. Ciò che è essenziale è la rimozione di tutte le bolle dalla soluzione polimerica PDMS, specialmente in quelle regioni destinate a diventare pali di ancoraggio hMMT. Le bolle in questa regione comporteranno la rottura dell'ancora dopo la rottura, la perdita di pozzi di coltura e, a sua volta, si tradurrà in un piccolo pezzo di PDMS che rimane incastrato nello stampo. - Trasferire lo stampo in PU riempito di PDMS degassato in un forno a 65 °C, incubando durante la notte per polimerizzare la gomma liquida.
- Rimuovere la piastra positiva PDMS indurita dal forno e raffreddare la piastra a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
- Con un bisturi senza lama, staccare delicatamente il PDMS polimerizzato dallo stampo in PU facendo scorrere la parte posteriore del manico tra il PDMS e le pareti dello stampo. Iniziare lungo il bordo superiore e separare tutti e 4 i lati, prima di spingere verso il basso fino alla base dello stampo e staccare questa porzione. Questo passaggio è completo quando la parte posteriore della maniglia scorre senza intoppi tra il PDMS e tutte e 4 le pareti dello stampo PU.
NOTA: Lavorare lentamente e con attenzione con il bisturi senza lama per evitare di rompere lo stampo PU o strappare il PDMS. Questo passaggio dovrebbe richiedere 15-20 minuti. - Partendo da un'estremità, utilizzare il bisturi senza lama per sollevare il bordo del PDMS e lavorare le dita tra la piastra di coltura PDMS polimerizzata e lo stampo PU. Quindi, usando entrambe le mani, spingere ulteriormente le dita sotto la piastra, staccandosi lentamente e uscendo dallo stampo PU.
NOTA: Lavorare lentamente e usare entrambe le mani per sbucciare uniformemente il piatto. Ridurre al minimo la flessione per ridurre la probabilità di rottura del post di ancoraggio. Questo passaggio dovrebbe richiedere 5-10 minuti. - Utilizzare una lama di rasoio a bordo singolo per tagliare la piastra in gruppi di 6 ± 2 pozzetti MyoTACTIC (Figura 1) per scopi di semina dei tessuti. Posizionare piastre MyoTACTIC complete, o porzioni di piastra, in un sacchetto di sterilizzazione dello strumento e in un'autoclave per un ciclo a secco di 25 minuti (20 minuti di tempo di sterilizzazione e 5 minuti di tempo di asciugatura) a 120 °C e 100-140 kPag.
2. Coltura di cellule progenitrici di mioblasti umani immortalizzati
NOTA: I mioblasti immortalizzati utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti dall'Institut de Myologie (Parigi, Francia)31.
- Ottenere un flaconcino di cellule congelate dal dewar di azoto liquido e scongelare rapidamente il flaconcino a 37 °C a bagnomaria (in meno di 1 minuto). Le cellule vengono congelate ad una densità di 7,5 x 105 cellule per 1 mL di mezzi di congelamento costituiti per il 90% da siero bovino fetale (FBS) e per il 10% da dimetilsolfossido (DMSO).
- Trasferire delicatamente il contenuto del flaconcino in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di mezzo di lavaggio preriscaldato composto da 89% DMEM 1x, 10% FBS e 1% Pen/Strep per diluire il DMSO. Ruotare il tubo conico da 15 ml a 400 x g per 10 minuti e quindi aspirare via il fluido facendo attenzione ad evitare il pellet cellulare.
- Risospesciare il pellet in 1 mL di terreno di crescita costituito da 84% di cellule muscolari scheletriche basali con Skeletal Muscle Cell Growth Medium Supplement Mix, 15% FBS e 1% Pen / Strep e quindi trasferire in un tubo conico da 50 mL con 29 mL di mezzi di crescita.
- Trasferire 10 mL di terreno contenente circa 2,5 x 105 celle in una parabola di coltura cellulare da 100 mm x 20 mm. Ripetere questo passaggio con i restanti 20 ml della soluzione cellulare. Quindi trasferire le piastre di coltura cellulare in un incubatore di colture cellulari umidificato impostato a 37 °C e 5% CO2.
- Aggiorna i media culturali a giorni alterni. Coltiva le cellule fino a raggiungere una confluenza ~ 70% -80% (in genere 4-5 giorni), a quel punto le cellule sono preparate per la semina. 1,5 x 10 sono necessarie5 celle per generare ogni hMMT. Pertanto, passare le cellule secondo necessità per ottenere il numero richiesto di cellule.
NOTA: Le linee cellulari progenitrici di mioblasti immortalizzate non devono mai superare l'80% di confluenza prima di seminare le cellule in pozzetti MyoTACTIC, passare le cellule o preparare scorte di congelatore. Le hMMT fabbricate da celle che hanno superato l'80% di confluenza spesso non riescono a raggiungere la maturità contrattile. Le procedure di passaggio sono identiche ai metodi descritti di seguito nel passaggio 3.
3. Semina di hMMT ingegnerizzati con MyoTACTIC
- Preparazione di pozzi di coltura MyoTACTIC e reagenti per la semina hMMT.
NOTA: questo protocollo fornisce dettagli specifici per produrre 6 hMMT.- 2-3 ore prima della semina cellulare, posizionare una porzione di piastra MyoTACTIC da 6 pozzetti in una piastra di coltura cellulare di 10 cm. Preparare bene ogni singola coltura MyoTACTIC aggiungendo 100 μL di una soluzione di F-127 Pluronic al 5% in ciascun pozzetto. Mettere il coperchio sul piatto di coltura da 10 cm, applicare la paraffina per sigillare lo spazio tra il piatto da 10 cm e il coperchio, quindi posizionare la piastra da 10 cm contenente la porzione MyoTACTIC in una centrifuga dotata di un adattatore spinner a piastre.
NOTA: se non è disponibile un adattatore per spinner a piastra centrifuga, è possibile utilizzare una punta per pipetta p20 per rimuovere con cura le bolle da dietro i montanti, assicurando così che l'intera superficie di coltura sia rivestita in modo uniforme. - Centrifugare a 1.550 x g per 1 minuto per rimuovere tutte le bolle all'interno dei pozzetti di coltura, specialmente dietro i pali. Conservare la capsula di coltura cellulare di 10 cm contenente la porzione di piastra MyoTACTIC contenente la soluzione di Pluronic F-127 a 4 °C fino a quando le cellule non sono preparate per la semina.
NOTA: il rivestimento Pluronic F-127 può essere applicato per un minimo di 2 ore fino a 24 ore. Ad esempio, i pozzetti possono essere riempiti con la soluzione Pluronic F-127 alla fine della giornata per l'uso il giorno successivo. Non superare le 24 ore in quanto ciò avrà un impatto negativo sul rimodellamento dell'hMMT e non riuscirà a formare tessuti sani che raggiungono la maturità contrattile. - Scongelare lentamente un'aliquota di estrazione di membrana basale da 50 μL e un'aliquota di trombina da 10 μL (soluzione madre da 100 U/mL) sul ghiaccio all'interno della cappa di coltura.
NOTA: Non ricongelare le aliquote dell'estratto di membrana basale. Sono monouso. Le aliquote di trombina sono riutilizzabili, quindi, ricongelare fino a 5 volte dopo l'uso. - Pesare ~ 7 mg di fibrinogeno in polvere in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml e quindi trasferirlo nella cappa di coltura cellulare. Aggiungere 700 μL di soluzione di NaCl allo 0,9% (wt/vol) in acqua (o soluzione salina) per arrivare a una soluzione di concentrazione finale di 10 mg/mL. Non vorticoso il fibrinogeno per dissolversi, posizionare invece il tubo in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per 3-5 minuti.
- Rimuovere e far scorrere delicatamente il tubo, quindi ruotare la soluzione disciolta in una mini centrifuga da banco (microfuga) e tornare alla cappa di coltura. Filtrare la soluzione di fibrinogeno utilizzando una siringa da 1 mL dotata di un filtro a siringa da 0,22 μm. Trasferire la soluzione di fibrinogeno disciolto in ghiaccio insieme all'estratto di membrana basale e alle aliquote di trombina.
- Infine, preparare il mezzo di semina hMMT che verrà introdotto nei pozzetti di coltura dopo la semina dei tessuti. Questo mezzo contiene Skeletal Muscle Cell Basal Medium integrato con il 20% di FBS, l'1% di P/S e il 3% di acido 6-aminocaproico (ACA; la concentrazione finale di 1,5 mg/mL si ottiene diluendo da una soluzione madre da 50 mg/mL; la % è espressa come v/v). Preriscaldare il supporto a 37 °C prima dell'uso.
- 2-3 ore prima della semina cellulare, posizionare una porzione di piastra MyoTACTIC da 6 pozzetti in una piastra di coltura cellulare di 10 cm. Preparare bene ogni singola coltura MyoTACTIC aggiungendo 100 μL di una soluzione di F-127 Pluronic al 5% in ciascun pozzetto. Mettere il coperchio sul piatto di coltura da 10 cm, applicare la paraffina per sigillare lo spazio tra il piatto da 10 cm e il coperchio, quindi posizionare la piastra da 10 cm contenente la porzione MyoTACTIC in una centrifuga dotata di un adattatore spinner a piastre.
- Preparazione di cellule per la semina hMMT.
- Raccogliere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore di colture. Aspirare il fluido da ogni piastra, quindi lavare le celle una volta con D-PBS aggiungendo 5 ml di D-PBS in ogni piastra di coltura. Quindi aspirare il D-PBS e staccare le cellule aggiungendo 1 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% in ogni piatto di coltura. Mettere nell'incubatore di colture cellulari per 3 min.
- Arrestare la tripsina aggiungendo 3 ml di mezzo di lavaggio (89% di 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep) al piatto di coltura. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico di dimensioni appropriate, quindi pellettare le celle centrifugando a 400 x g per 10 minuti. Aspirare il fluido avendo cura di evitare il pellet cellulare. Quindi risospesare il pellet di cella in 1 mL del mezzo di lavaggio.
- Contare le cellule usando un emocitometro e un colorante blu di tripano sotto microscopia a campo luminoso.
Se si utilizzano più piastre di cellule, questa sospensione cellulare sarà molto concentrata. Diluire le sospensioni cellulari prima di contare secondo necessità. - Poiché ogni tessuto richiede 150.000 cellule risospese in 15 μL della miscela di matrice extracellulare (ECM), sono necessarie 900.000 cellule in 90 μL di miscela ECM per 6 tessuti. Per tenere conto della perdita di soluzione cellulare-ECM che si verifica durante il processo di preparazione a causa della formazione di bolle o della perdita di pipette, preparare una miscela extra cellula-ECM (cioè 8 tessuti o 1.200.000 cellule in 120 μL di ECM). Trasferire il volume della sospensione cellulare contenente 1.200.000 cellule in un nuovo tubo conico. Aumentare il volume a 10 ml con il mezzo di lavaggio e girare a 400 x g per 10 minuti.
- Mentre le cellule girano verso il basso, preparare una miscela ECM da 150 μL in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando la seguente ricetta. Aggiungere prima 60 μL di DMEM (40% di volume), quindi aggiungere 60 μL di soluzione di Fibrinogeno 10 mg/mL (40% di volume) e infine aggiungere 30 μL di estratto di membrana basale (20% di volume). Conservare la miscela ECM su ghiaccio fino all'uso.
NOTA: Utilizzare sempre punte pre-refrigerate a -20 °C quando si lavora con soluzioni contenenti estratto di membrana basale. La miscela ECM contiene 4 mg/mL di fibrinogeno.
- Semina hMMTs
- Raccogliere il tubo conico contenente le cellule filate e aspirare il mezzo avendo cura di evitare il pellet cellulare. Far scorrere vigorosamente l'estremità del tubo con un dito guantato per rimuovere il pellet e continuare a scorrere fino a quando il pellet appare come un liquame cellulare.
NOTA: È importante aspirare il maggior numero possibile di mezzi di lavaggio per garantire che la sospensione cell-ECM sia alla diluizione desiderata. Utilizzare una pipetta per rimuovere i supporti di lavaggio rimanenti, se necessario. - Trasferire 120 μL della soluzione ECM al tubo contenente il pellet cellulare. Pipettare su e giù per risospescere completamente le celle all'interno dell'ECM per generare una sospensione a cella singola. Pipettare lentamente e con attenzione per evitare l'introduzione di bolle, che ridurrebbero il volume di lavoro. Quindi, posizionare la soluzione cellulare-ECM su ghiaccio fino all'uso.
- Recuperare le porzioni di piastra MyoTACTIC contenenti pozzetti MyoTACTIC rivestiti con F-127 Pluronic dal frigorifero a 4 ° C e posizionare il piatto da 10 cm contenente i pozzetti MyoTACTIC sopra un impacco di ghiaccio all'interno della cappa di coltura cellulare.
- Aspirare la soluzione Pluronic F-127 da ciascun pozzo. Il PDMS è poroso e assorbirà la soluzione Pluronic F-127, specialmente se le piastre sono state filate con una centrifuga. Lasciare che la soluzione residua di Pluronic F-127 si rilasci e si depositi sul fondo del pozzo lasciando riposare i pozzetti per 5 minuti, quindi aspirare di nuovo.
NOTA: utilizzare una pipetta Pasteur con una punta p1250 attaccata all'estremità e una punta p200 sopra la punta p1250 quando si aspira la soluzione Pluronic F-127. Ciò migliorerà la precisione per prevenire l'aspirazione accidentale delle strutture dei pali. Evitare di raschiare l'area di semina della cella a forma di piscina ovale sul fondo del pozzo con la pipetta in quanto ciò interrompe il rivestimento Pluronic F-127 e interferisce con il processo di auto-organizzazione hMMT. La tecnica corretta è quella di librare la punta della pipetta appena sopra la piscina ovale mentre si aspira la soluzione Pluronic F-127. - Pipettare accuratamente la sospensione cell-ECM per risospescere eventuali cellule che potrebbero essere affondate sul fondo del tubo. Quindi trasferire 105 μL di sospensione cell-ECM in un tubo fresco pre-refrigerato da 1,5 mL. Fare attenzione ad afferrare il tubo vicino alla parte superiore per evitare che la soluzione si riscaldi.
- Aggiungere 0,84 μL della soluzione madre di trombina da 100 U/mL alla sospensione cellulare-ECM da 105 μL per arrivare ad una concentrazione finale di 0,2 U/mg di fibrinogeno. Pipettare rapidamente, con attenzione e accuratamente per mescolare, evitando l'introduzione di bolle.
NOTA: La trombina avvia la rapida conversione del fibrinogeno in un coagulo di fibrina. Come tale, c'è un tempo limitato per seminare i tessuti dopo l'aggiunta di trombina. Per evitare la coagulazione prematura prima che la miscela cellula-ECM venga trasferita nei pozzetti di coltura, impostare una pipetta p20 a 15 μL prima di aggiungere la trombina. Utilizzare punte pre-refrigerate o immergere la punta della pipetta in DMEM ghiacciato per alcuni secondi prima di raccogliere e trasferire 15 μL della miscela cellula-ECM in ciascun pozzetto. È una buona pratica preparare aliquote di miscela cellulare-ECM in modo tale che non vengano seminati più di 6 hMMT alla volta. - Per seminare i tessuti, aggiungere 15 μL di miscela cellula-ECM (cioè 150.000 cellule) a ogni singolo pozzetto. Aggiungere con attenzione la miscela cell-ECM al centro della piscina ovale ed evitare di premere la punta della pipetta sul fondo del pozzo. Quindi, con due movimenti leggeri, distribuire la sospensione cellulare dietro ogni palo nel pozzo. Una volta che la superficie è uniformemente rivestita nella sospensione cell-ECM, passare al pozzo successivo.
NOTA: Lavorare in modo efficiente per evitare la gelificazione prematura della miscela cellula-ECM nel tubo prima che tutti i tessuti siano seminati. Quando si seminano i pozzetti, è estremamente importante evitare il trasferimento di bolle in quanto la bolla interferirà con il rimodellamento dell'hMMT, rendendo l'hMMT inutilizzabile. - Posizionare il coperchio sulla piastra di coltura di 10 cm contenente i pozzetti seminati e trasferirlo in un incubatore di colture tissutali a 37 °C per circa 5 minuti.
NOTA: Inserire il tubo microcentrifuga con miscela residua cellula-ECM nell'incubatore come conferma del processo di polimerizzazione del gel. - Dopo che la miscela cellula-ECM si è polimerizzata, aggiungere 200 μL di mezzi di semina hMMT preribaltati a ciascun pozzetto MyoTACTIC. Sostituire il coperchio del piatto da 10 cm e restituire all'incubatrice le porzioni della piastra MyoTACTIC all'interno del piatto da 10 cm. Questo punto temporale è indicato come Giorno -2. Non disturbare i tessuti fino al passaggio successivo.
- Raccogliere il tubo conico contenente le cellule filate e aspirare il mezzo avendo cura di evitare il pellet cellulare. Far scorrere vigorosamente l'estremità del tubo con un dito guantato per rimuovere il pellet e continuare a scorrere fino a quando il pellet appare come un liquame cellulare.
- Differenziazione degli hMMT
- Dopo 2 giorni di incubazione, rimuovere accuratamente il mezzo di semina hMMT utilizzando una pipetta e sostituirlo con 200 μL di mezzi di differenziazione preriscaldati contenenti il 2% di siero equino, l'1% di Pen/Strep, il 4% di ACA (cioè 2 mg/mL di concentrazione finale da una concentrazione di stock di 50 mg/mL; % è espresso come v/v) e 10 μg/mL di insulina ricombinante umana nel DMEM. Questo punto temporale è indicato come Giorno 0 di differenziazione.
- Successivamente, a giorni alterni, scambia metà dei media con nuovi mezzi di differenziazione fino al giorno 12 di differenziazione, l'ultimo giorno della cultura (Figura 2a).
NOTA: I dettagli del protocollo per fabbricare hMMT utilizzando mioblasti umani primari sono stati pubblicati altrove30. Se ci sono preoccupazioni per la vitalità cellulare dopo la semina, incubare hMMT con calceina e ioduro di propidio per quantificare la vitalità.
4. Stimolazione elettrica e analisi della post deflessione indotta da hMMT
- Impostare un supporto per palco in vetro trasparente o plastica su un microscopio invertito e collegare una fotocamera dello smartphone all'oculare del microscopio utilizzando un supporto per fotocamera per microscopio. Verrà utilizzata la microscopia a contrasto di fase con ingrandimento 10x (Figura 3a).
NOTA: qualsiasi microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo di ingrandimento 10x sarà appropriato. I costrutti del pozzo PDMS verranno rimossi dal piatto da 10 cm e posizionati direttamente sul supporto del palco inferiore trasparente e, quindi, aperti all'aria. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 70% di etanolo e ridurre al minimo il traffico nell'area durante la sperimentazione. - Per preparare gli elettrodi di stimolazione elettrica, tagliare ~ 30 cm di filo di rame rivestito di stagno. Quindi, partendo dal mozzo di un ago smussato normale da 25 G, avvolgere strettamente ~ 10 cm del filo attorno alla metà superiore, lasciando ~ 20 cm di filo in eccesso. Ripetere per un secondo ago e quindi tagliare il mozzo da ciascun ago.
NOTA: il filo deve essere stretto attorno all'ago per assicurarsi che non si muova e la parte avvolta del filo dell'elettrodo non deve toccare il PDMS in quanto ciò può impedire la generazione del campo elettrico. - Collegare BNC al cavo connettore a clip alligatore a un canale di uscita sul generatore di forme d'onda e impostare il canale per impulsi quadrati con ciclo di lavoro del 20%, ampiezza di 5 V (intensità del campo elettrico di 10 V / cm). La frequenza si altererà tra 0,5 Hz e 20 Hz per contrazioni e contrazioni tetaniche, rispettivamente.
NOTA: le impostazioni del generatore di forme d'onda potrebbero richiedere un'ottimizzazione specifica dell'esperimento - Posizionare una porzione di piastra MyoTACTIC contenente hMMT sullo stadio del microscopio e inserire delicatamente ogni estremità smussata dell'elettrodo nel PDMS direttamente dietro ogni palo nella piscina ovale. Fissare con cura le sezioni di 20 cm di filo in eccesso allo stadio del microscopio in modo che gli aghi rimangano verticali e ~ 10 cm di ciascun filo rimangano liberi per il collegamento (Figura 3a).
ATTENZIONE: non posizionare mai un dito nudo su entrambe le estremità dell'elettrodo. Assicurarsi che un ditale sia indossato sul dito indice per applicare una leggera pressione all'elettrodo al momento dell'inserimento nel PDMS. - Focalizzare il campo visivo del microscopio su uno dei due post, in modo tale che la messa a fuoco sia nitida sul bordo del palo più vicino all'elettrodo. Quindi, blocca la messa a fuoco della fotocamera dello smartphone sull'area più chiara del post. Questo è importante per l'analisi a valle in quanto un cambiamento di messa a fuoco durante la registrazione interferirà con l'analisi.
- Collegare le estremità libere dei fili nastrati al generatore di forme d'onda tramite morsetti a coccodrillo (Figura 3a).
- Avviare la registrazione video sulla fotocamera dello smartphone, quindi attivare l'uscita del canale per avviare la stimolazione. Indurre l'hMMT a subire 3 contrazioni e 3 contrazioni tetaniche, con 2 minuti di riposo tra la serie di spasmi e stimolazione tetanica.
- Disattivare l'uscita del canale, staccare le clip di alligatore dai fili di rame rivestiti di stagno, rimuovere il nastro dai fili e pulire ogni elettrodo con etanolo al 70% prima di inserirlo nei successivi pozzetti hMMT. Ripetere la procedura dal passaggio 4.5 per tutti gli hMMT.
NOTA: Limitare il tempo che gli hMMT trascorrono al di fuori dell'incubatore stimolando non più di 3 tessuti alla volta. Se rimangono da analizzare ulteriori hMMT all'interno della porzione di piastra MyoTACTIC, riportare la piastra all'incubatore per 10 minuti per consentire agli hMIT di tornare a 37 °C. - Per analizzare la post deflessione in modo da calcolare la generazione di forza hMMT, utilizzare lo script personalizzato, che è stato reso disponibile su GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Segui le istruzioni in README.md per impostare e avviare lo script, quindi apri ogni video di tracciamento post per condurre l'analisi della forza.
- Seleziona una regione di interesse (ROI) lungo il bordo del post da monitorare per lo spostamento del post. Premere Invio per confermare il ROI e premere nuovamente Invio per eseguire lo script (Video supplementare 1).
NOTA: grandi deflessioni causano il guasto del tracker. Se il tracker fallisce durante la contrazione, la dimensione del ROI può essere aumentata per rendere il tracciamento meno sensibile, ma consentire il tracciamento di grandi deflessioni. Nel codice sono disponibili tre dimensioni che possono essere ottimizzate regolando i commenti dello script. - Lo script termina con due requisiti di input. Innanzitutto, inserisci y per confermare che il video conteneva più contrazioni. In secondo luogo, immettere y (sì) o n (no) per esportare i risultati in un file . Csv (Video supplementare 1).
- Assicurati che i risultati della deflessione siano riportati come spostamento in pixel per ogni contrazione. Convertire i pixel in valori μm per l'impostazione di ingrandimento 10x del microscopio. Quindi, convertire i numeri post spostamento in forze contrattili assolute (μN) moltiplicando i valori (μm) per il fattore di conversione forza-spostamento di 2,36 μN / μm, che corrisponde al rapporto agente polimerizzante 1:15 / monomero del PDMS utilizzato nella fabbricazione MyoTACTIC30.
5. Analisi dei transitori di calcio mediante stimolazione elettrica
NOTA: Per gli esperimenti di manipolazione del calcio, i mioblasti immortalizzati sono stati stabilmente trasdotti con il reporter MHCK7-GCAMP6 come precedentemente descritto11,12. Le cellule trasdotte sono state selezionate FACS per GFP per ottenere la popolazione positiva e quindi utilizzate per fabbricare hMMT. Metodi alternativi per l'imaging del calcio come l'utilizzo di coloranti metrici di rapporto come Fura-2 AM e Indo-1 o l'imaging a vita di fluorescenza di indicatori di calcio (ad esempio, Fluo-4 o Oregon Green BAPTA1) possono essere suscettibili al nostro sistema.
- Impostare lo stadio del microscopio e l'apparecchiatura di stimolazione (elettrodi, generatore di forme d'onda, ecc.) come precedentemente descritto nel passaggio 4. Per questo esperimento, utilizzare un ingrandimento 4x.
NOTA: saranno necessari una camera oscura e un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera CCD. - Avviare il software di imaging del microscopio, selezionare il canale del filtro FITC (luce blu) e selezionare la funzione di registrazione del filmato. Impostato su un'esposizione di 500 ms e una risoluzione di 680 x 510 (Binning 2x2).
NOTA: il software di imaging può variare e l'esposizione viene impostata manualmente dall'utente. Fare attenzione ad evitare la sovraesposizione all'hMMT prima della stimolazione. A riposo, un contorno/ombra di tessuto scuro con fluorescenza spontanea è normale mentre un'immagine tissutale chiara è sovraesposizione (Video supplementare 2). Assicurarsi che l'esposizione sia coerente per tutti gli hMMT all'interno di un esperimento. - Chiudere l'otturatore del microscopio e tenere spento il canale FITC fino a quando non è pronto per registrare la manipolazione del calcio.
- Quando tutte le apparecchiature e il software sono configurati, recuperare la porzione di piastra MyoTACTIC contenente gli hMMT da analizzare e posizionarla direttamente sul palco del microscopio. Quindi, inserire e collegare gli elettrodi come descritto in precedenza nel passaggio 4.
- Utilizzate brightfield per mettere a fuoco il campo visivo al centro dell'hMMT selezionato. Quindi, spegnere la lampada.
- Aprire l'otturatore del canale FITC del microscopio, verificare che la luce blu sia accesa, quindi selezionare Movie Record nel software.
- Accendere l'uscita sul generatore di forme d'onda per avviare la stimolazione elettrica. Indurre l'hMMT a subire 8 contrazioni e 8 contrazioni del tetano. Consentire 2 minuti di riposo tra la serie di spasmi e stimolazione del tetano, durante i quali l'otturatore FITC è in posizione chiusa.
NOTA: Consentire 10 s di attività spontanea prima e dopo la stimolazione elettrica per registrare la fluorescenza minima a fini di calcolo e analisi dei dati. - Spegnere l'uscita del canale, staccare le clip di alligatore dai fili di rame rivestiti di stagno, rimuovere il nastro dai fili e pulire ogni elettrodo con etanolo al 70% prima di inserirlo nei successivi pozzetti hMMT. Ripetere la procedura di stimolazione e registrazione per tutti gli hMMT.
- Salva i filmati in formato di file TIFF per l'analisi in ImageJ o software di imaging alternativo.
NOTA: Limitare il tempo che gli hMMT trascorrono al di fuori dell'incubatore stimolando non più di 3 tessuti alla volta. Se l'hMMT aggiuntivo all'interno della porzione di piastra MyoTACTIC rimane da analizzare, riportare il dispositivo all'incubatore per 10 minuti per consentire agli hMIT di tornare a 37 °C. - Per analizzare i dati transitori del calcio, aprire prima ImageJ. Selezionare Analizza, quindi Imposta misure, quindi selezionare il valore grigio medio e deselezionare tutte le altre opzioni. Al termine, aprire un video di calcio (.tiff) (Video supplementare 2).
- Delineare il bordo del microtissue utilizzando uno strumento di selezione dei poligoni e salvare quest'area come ROI (Video supplementare 2). In Altro nella finestra ROI Manager, selezionare Multi misura e misurare l'intensità fluorescente per tutte le sezioni di file in una riga per sezione ( Videosupplementare 2).
- Copia tutte le misurazioni, incluso il numero di fetta (fotogramma), in un foglio di calcolo e confronta l'intensità fluorescente di ogni fetta con l'intensità fluorescente spontanea minima dal file usando ΔF/F0 = (Fimmediato - Fminimo)/ Fminimo (Video supplementare 2).
- Calcola il tempo per ogni fotogramma moltiplicando la velocità del fotogramma di registrazione del filmato per il numero di sezioni (fotogramma) e traccia ΔF / F0 rispetto al tempo per la risposta transitoria del calcio hMMT alla stimolazione (Video supplementare 2).
- Selezionare il segnale transitorio di picco del calcio per ciascuna delle 6 contrazioni consecutive e i valori medi per calcolare la variazione media relativa dell'intensità fluorescente di picco di ciascun hMMT (Video supplementare 2).
NOTA: escludere sempre dall'analisi complessiva i dati derivanti dalla prima contrazione di contrazione. Un foglio di calcolo intitolato "Calcium Handling Template.xlsx" è stato fornito su GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) per facilitare l'analisi dei transitori di calcio hMMT. Le celle compilabili in cui devono essere immessi valori e input sono evidenziate in grigio. Assicurati di regolare i numeri di selezione dei picchi in quanto questa è solo una guida per aiutare nella selezione dei picchi (Video supplementare 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Di seguito sono descritti i metodi per lanciare una piattaforma di coltura MyoTACTIC basata su PDMS a 96 pozzetti da uno stampo PU, per fabbricare matrici di tessuti replica hMMT e per analizzare due aspetti della funzione hMMT all'interno della generazione della forza del dispositivo di coltura e della manipolazione del calcio. La Figura 1 offre una panoramica schematica della preparazione dei pozzetti di coltura MyoTACTIC prima della semina hMMT. PDMS è un polimero a base di silicone ampiamente utilizzato, che può essere facilmente modellato per creare dispositivi complessi32. Un protocollo basato su PDMS è stato progettato per lanciare un numero illimitato di dispositivi di coltura a 96 pozzetti da uno stampo PU negativo fabbricato30. La piastra positiva PDMS polimerizzata finale è flessibile e può essere facilmente tagliata in unità funzionali di dimensioni più piccole con l'aiuto di una lama di rasoio a bordo singolo (Figura 1). Ciò consente all'utente di ridimensionare il dispositivo per soddisfare le esigenze di replica hMMT specifiche per la progettazione sperimentale. Queste unità funzionali più piccole sono anche utili per superare la limitazione di lavorare con uno scaffold ECM che polimerizza rapidamente, come gli idrogel di fibrina, regolando facilmente il numero di pozzetti per abbinare la velocità di semina cellulare dell'utente. Inoltre, pdms è facilmente autoclavabile e può essere conservato per un periodo indefinito. Infine, dal punto di vista logistico, una piastra MyoTACTIC completa può essere coperta da qualsiasi coperchio standard a piastra a 96 pozzetti e le dimensioni e il profilo delle porzioni di piastra MyoTACTIC sono suscettibili di incubazione all'interno di una piastra di coltura di 10 cm, per garantire la sterilità della coltura hMMT. Il rivestimento della soluzione Pluronic F-127 prima della semina cellulare svolge un duplice ruolo nel fornire una misura aggiuntiva di sterilizzazione dei pozzi di coltura e come tensioattivo non ionico, prevenendo l'adesione cellulare a favore del rimodellamento uniforme delle cellule - ECM (Figura 1).
Quando la popolazione di cellule progenitrici miogeniche immortalizzate è pronta per la sperimentazione, le cellule vengono quindi incapsulate in un idrogel composto da fibrinogeno ed estratto di membrana basale. La miscela cellula-ECM viene quindi depositata uniformemente nella piscina ovale sul fondo di ciascun pozzetto MyoTACTIC, e quindi per un periodo di coltura di 14 giorni, le cellule si auto-organizzano spazialmente attraverso questi due pali verticali per formare una microtessuta 3D popolata da un letto di miotubi allineati, multinucleati e striati che assomigliano ad aspetti dell'organizzazione dei tessuti nativi (Figura 2a, g,h). Durante il processo di rimodellamento, viene generata una tensione uniassiale tra i due punti di ancoraggio, e questo guida il processo di auto-organizzazione del tessuto per guidare a sua volta la formazione di un tessuto compatto. Durante il periodo di differenziazione, la larghezza degli hMMT costruiti da mioblasti derivati da pazienti sani rimane abbastanza coerente. Tuttavia, in caso di errori che interferiscono con il rimodellamento hMMT, questa uniformità viene persa (Figura 2a-f), rendendo questa semplice metrica utile nella valutazione del controllo qualità hMMT. Ad esempio, la miscelazione troppo zelante della cellula - la sospensione ECM può provocare la formazione di bolle. Le bolle trasportate al MyoTACTIC impediscono bene il rimodellamento hMMT. In questi casi, le bolle spostano alcuni o tutti i mioblasti dall'area occupata dalla bolla, formando infine una fessura nell'hMMT finale (Figura 2b; vedi freccia rossa). Un altro esempio riguarda l'integrità del rivestimento Pluronic F-127 nei pozzi. Pluronic F-127 è un tensioattivo non ionico che impedisce alle cellule di aderire al pozzo MyoTACTIC. Se il rivestimento viene raschiato via durante l'aspirazione, i mioblasti aderiranno alla superficie dei pozzetti MyoTACTIC, formando nuovi punti di ancoraggio e dando luogo a miotubi che non sono allineati attraverso i due pali (Figura 2c). Ulteriori errori possono anche causare un rimodellamento hMMT aberrante, come si vede nella Figura 2d-f. La vitalità cellulare post-semina può anche essere valutata utilizzando saggi di colorazione a base di calceina / ioduro di propidio. Quando questi errori tecnici vengono evitati, gli hMMT sono popolati da un letto di miotubi allineati e multinucleati che si estendono per tutta la lunghezza di ciascun hMMT (Figura 2g). I miotubi sono di dimensioni abbastanza uniformi per tutta la loro lunghezza e tra diversi hMMT (Figura 2h-i). I miotubi sono caratterizzati dalla presenza di striature sarcomere che vengono visualizzate mediante immunocolorazione per α sarcomerico - actinina (SAA; Figura 2h).
Le proprietà funzionali possono anche essere esaminate in hMMT a partire da circa 7 giorni di differenziazione. L'impostazione sperimentale per completare questi studi funzionali è illustrata nella Figura 3a. La configurazione al microscopio è raffigurata sopra un tavolo vibraplano; tuttavia, questo non è necessario per completare le indagini funzionali. Negli studi funzionali, gli elettrodi generati come descritto nella sezione di stimolazione elettrica del protocollo vengono inseriti nel PDMS, in modo tale che gli elettrodi risiedano dietro i pali. È importante avere una buona visualizzazione della regione del palo prima di inserire l'elettrodo poiché la necessità di reinserire può comportare lo spostamento del tessuto dal palo. Il corretto inserimento degli elettrodi è anche importante per ottenere una messa a fuoco nitida del palo in modo che la post-deflessione possa essere successivamente tracciata con lo script python. La Figura 3b mostra uno spostamento rappresentativo del palo della piastra del pozzo MyoTACTIC in risposta alla stimolazione elettrica hMMT a bassa (contrazione, 0,5 Hz) e ad alta frequenza (tetano, 20 Hz). La quantificazione del post spostamento può essere utilizzata per calcolare la forza contrattile indotta degli hMMT (Figura 3c). Quando queste informazioni sono combinate con l'area della sezione trasversale hMMT, la forza specifica può esseredeterminata 30. Inoltre, i transitori di calcio svolgono un ruolo importante nella contrazione muscolare. La trasduzione stabile dei mioblasti muscolari scheletrici con un indicatore di calcio geneticamente codificato come GCaMP612,30,33,34,consente la sorveglianza in tempo reale dei transitori di calcio12,30,34. I transienti di calcio sono stati analizzati utilizzando la configurazione di stimolazione elettrica sopra descritta fino a stimolare gli hMMT del giorno 12 generati con mioblasti immortalizzati che esprimono il reporter MHCK7-GCAMP6 (Figura 4a) e quantificati come intensità fluorescente di picco media durante la stimolazione elettrica a bassa (contrazione, 0,5 Hz) e ad alta frequenza (tetano, 20Hz) (Figura 4b). Si osserva che le proprietà di manipolazione del calcio hMMT misurate in diversi esperimenti sono relativamente coerenti (Figura 4b). I metodi di quantificazione per la post-deflessione e la manipolazione del calcio sono descritti nel video supplementare 1 e nel video supplementare 2.
Figura 1: Preparazione della piastra PDMS miotattica prima della semina hMMT. La piattaforma a 96 pozzi denominata MyoTACTIC è fabbricata polimerizzando prima il polidimetilsilossano (PDMS) all'interno di uno stampo in poliuretano negativo (PU). La piattaforma di coltura basata su PDMS viene quindi accuratamente staccata dallo stampo PU negativo. In un ambiente accademico, il dispositivo PDMS viene quindi tagliato in unità più piccole contenenti 6 ± 2 pozzi funzionali. Questi pozzetti vengono quindi posti in un sacchetto di sterilizzazione, autoclavati e conservati fino all'uso. Fino a un giorno prima dell'uso, il numero desiderato di porzioni del dispositivo viene posizionato all'interno di una piastra di coltura di 10 cm e Pluronic F-127 viene aggiunto a ciascun pozzetto. Viene aggiunto il coperchio del piatto da 10 cm, il bordo viene sigillato con parafilm prima di incubare la piastra a 4 ° per 2-24 ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: MyoTACTIC supporta l'auto-organizzazione hMMT e la formazione di miotubi allineati. (a) (in alto) Timeline schematica dell'auto-organizzazione hMMT e successiva maturazione dei miotubi in un periodo di coltura di 14 giorni. (in basso) Immagini rappresentative a contrasto di fase 4x per illustrare la cinetica dell'auto-organizzazione dei mioblasti immortalizzati attraverso i due pali verticali che provocano la formazione di un hMMT 3D. Barra di scala, 500 μm. (b-f) Immagini rappresentative 4x a contrasto di fase di hMMT al giorno 12 della differenziazione che mostrano i risultati hMMT causati da (b) una bolla all'interno della cellula - ECM al momento della semina (punti freccia rossa per indurre danni hMMT), (c) aspirazione errata del rivestimento della soluzione Pluronic F-127 e (d-f ) sovra-rimodellamento hMMT che può segnalare una gelificazione ECM impropria, mancanza di attività ACA nei terreni di coltura, cura impropria della linea parentale del mioblasto, ecc. Barra di scala, 500 μm. (g) Immagine confocale piastrellata e appiattita rappresentativa di un giorno 12 hMMT scattata con ingrandimento 10x. Gli hMMT vengono fissati direttamente nello stampo PDMS, quindi accuratamente rimossi e collocati in una piastra di coltura a 96 pozzetti per la colorazione. Sarcomerico α-actinina (SAA) mostrato in magenta, e Hoechst 33342 contromacchia nucleare mostrato in ciano. Barra di scala, 500 μm. (h) Immagine confocale rappresentativa di un day 12 hMMT con ingrandimento 40x. I miotubi e i nuclei hMMT sono visualizzati mediante immunocolorazione per SAA (magenta) e controcolorazione con Hoechst 33342 (ciano). Barra di scala, 50 μm. (i) Grafico a punti del diametro medio del miotubo hMMT al giorno 12 di differenziazione. I valori sono riportati come medi ± SEM. n = 8 hMMT da 3 repliche biologiche, distinte da forme di simboli, per cui vengono analizzati almeno 30 miotubi per hMMT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazione in situ della forza contrattile all'interno della piattaforma MyoTACTIC. (a) Rappresentazione della disposizione di stimolazione elettrica (a sinistra). Sebbene nella foto in questa configurazione, non è necessario un tavolo vibraplane. Una fotocamera e un supporto per smartphone sono stati equipaggiati con l'oculare di un microscopio invertito dotato di una lampada a fluorescenza per le registrazioni video di hMMT di stimolazione elettrica post spostamenti (a sinistra). Gli aghi da 25 G sono stati avvolti con fili di rame rivestiti di stagno (in basso a destra), collegati a un cavo connettore a clip BNC a alligatore (in alto a destra) e sono stati fissati a un generatore di forme d'onda arbitrarie. Il posizionamento degli elettrodi durante la stimolazione elettrica è mostrato in basso a destra. b)Istantanee rappresentative tratte da video post deflessione acquisiti da hMMT il giorno 12 di differenziazione. I video sono stati catturati con un ingrandimento di 10x. Le linee verticali bianche solide mostrano il post posizionamento quando gli hMMT sono rilassati, mentre le linee verticali bianche tratteggiate mostrano lo spostamento post dopo la stimolazione ad alta (tetano 20 Hz) o bassa (0,5 Hz). Barra di scala, 100 μm. (c) Grafico a punti della contrazione media hMMT (0,5 Hz) e della forza contrattile indotta dal tetano (20 Hz) il giorno 12 della differenziazione. I valori sono riportati come ± SEM. n = 9 hMMT da 3 repliche biologiche, distinte da forme di simboli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misurazione in situ della manipolazione del calcio all'interno della piattaforma MyoTACTIC. (a) Immagini rappresentative da una registrazione video di ingrandimento 4x di transienti spontanei GCaMP6+ calcio e transienti di calcio in risposta a stimolazione elettrica a bassa (contrazione della contrazione, 0,5 Hz) e ad alta frequenza (contrazione del tetano, 20 Hz). Gli hMMT sono delineati da una linea gialla tratteggiata. Barra di scala, 200 μm. (b) Grafico a punti che mostra la quantificazione dell'intensità fluorescente di picco media per hMMT dopo stimolazione elettrica a bassa (contrazione della contrazione, 0,5 Hz) e alta (contrazione del tetano, 20 Hz). I valori sono riportati come ± SEM. n = 9 hMMT da 3 repliche biologiche, distinte da forme di simboli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Dimostrazione dei metodi per analizzare i dati post-deflessione. Un video rappresentativo dell'analisi post deflessione al giorno 12 della differenziazione monitorato dallo script personalizzato durante la stimolazione del tetano. Innanzitutto la dimensione del ROI viene selezionata direttamente all'interno dello script di post tracking. Successivamente il video viene aperto selezionando il pulsante di riproduzione per eseguire lo script. Una regione focalizzata nitida del post viene selezionata come ROI e viene posizionata la casella di monitoraggio del post blu. Invio viene premuto per bloccare il ROI e premuto di nuovo per eseguire lo script. "y" viene inserito come risposta al prompt "Video di contrazione multipla? [Y/N]", quindi 'n' viene inserito come risposta al prompt "Esporta posizioni post come file .csv? [S/N]". La deflessione post come spostamento relativo in pixel è l'output finale. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Dimostrazione dei metodi per analizzare i dati transitori del calcio GCaMP6. Un video rappresentativo dell'analisi della gestione del calcio in epifluorescenza al giorno 12 della differenziazione durante la stimolazione del tetano. In primo luogo, un video di transienti di calcio (salvato come una serie di immagini tiff) è stato aperto in ImageJ e l'utente ha navigato attraverso i fotogrammi fino a quando l'hMMT è visibile. Quindi, viene confermata la misurazione di analisi richiesta "valore grigio medio" e l'hMMT viene delineato utilizzando lo strumento di disegno poligonale. Questo schema viene salvato come regione di interesse e l'intensità fluorescente di ogni porzione video viene analizzata utilizzando la multi-misura. Queste misurazioni vengono copiate nel foglio di calcolo "Calcium Handling Template" con i dati del frame e i valori di picco transitori del calcio compilati e confermati. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e analizzare un modello di coltura hMMT 3D che può essere applicato a studi di biologia muscolare di base, modellazione di malattie o per test di molecole candidate. La piattaforma MyoTACTIC è economica, facile da produrre e richiede un numero relativamente piccolo di cellule per produrre microtessuti muscolari scheletrici. Gli hMMT formati all'interno della piattaforma di coltura MyoTACTIC sono composti da miotubi allineati, multinucleati e striati e rispondono agli stimoli elettrici avviando transienti di calcio che innescano la contrazione (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Studi precedenti hanno dimostrato che gli hMMT offrono una risposta simile agli stimoli biochimici e possono raggiungere livelli di maturazione corrispondenti a quelli riportati in modelli di muscolo scheletrico 3D di formato più grande12,30.
Un tema critico in tutta la fabbricazione della piastra MyoTACTIC e nella generazione di hMMT è garantire che le bolle siano prevenute e, se formate, siano state rimosse. Per facilitare la fusione in un unico passaggio di uno stampo PDMS operabile, è stato generato uno stampo in PU a valle dello stampo in plastica stampato in 3D iniziale precedentemente descritto da Afshar et al.30. Lo stampo in PU che è stato generato consente agli utenti di produrre un ingombro di 96 pozzi di stampo PDMS per cui un massimo di 96 pozzi sono funzionali (contengono due pali), come dettato dalla fase di fabbricazione dello stampo in PU. Durante la fabbricazione della piastra PDMS MyoTACTIC, i nuovi utenti spesso perdono bolle più piccole che rimangono indietro nel PDMS liquido, anche dopo il degasaggio. Le bolle che si localizzano nelle regioni dello stampo PU corrispondenti alle strutture flessibili del palo di ancoraggio comporteranno la rottura del post dopo la separazione dello stampo PU dalla piastra di coltura PDMS e, nel processo, lasceranno dietro di sé un piccolo pezzo di PDMS indurito nello stampo PU. L'aria compressa può essere utilizzata per rimuovere questi resti PDMS induriti e in caso contrario si ridurrà efficacemente il numero di pozzetti funzionali disponibili per i futuri getti di lastre. Pertanto, è fondamentale assicurarsi che tutte le bolle siano state rimosse prima che la piastra PDMS venga polimerizzata poiché un vantaggio di questa piattaforma è che si tratta di un dispositivo autonomo, in cui tutte le caratteristiche della piastra vengono fuse in un unico passaggio piuttosto che richiedere che ogni singolo punto di ancoraggio della microtessuta venga introdotto manualmente nei pozzetti dicoltura 35, 36,37. La maggior parte degli studi di laboratorio accademici non richiede un'intera piastra di coltura MyoTACTIC. Per massimizzare l'uso di ogni piastra PMDS, viene tagliato manualmente in gruppi di 6 ± 2 pozzetti miotattici. Per migliorare questo processo uno stampo in PU che consente agli utenti di sbucciare unità funzionali di 6 ± 2 pozzetti MyoTACTIC può eliminare completamente questa fase di taglio della piastra. Inoltre, le grandi bolle introdotte nella soluzione cellulare-ECM durante la miscelazione o durante la procedura di semina dei tessuti comprometteranno la corretta formazione dei tessuti. Queste grandi bolle spostano le cellule dalla regione occupata dalla bolla, spesso risultando in hMMT con regioni con pochi miotubi che soccombono allo stress contrattile e scattano durante la stimolazione elettrica.
Un notevole vantaggio di MyoTACTIC è la capacità di quantificare la generazione di forza attiva e le proprietà di manipolazione del calcio in situ. Questa è una sfida affrontata da molti altri sistemi di coltura 3D, in cui lo studio della forza contrattile tissutale 3D viene implementato come test endpoint dopo la rimozione del tessuto dal dispositivo dicoltura 12,37. Pertanto, MyoTACTIC è adatto a supportare studi longitudinali, ad esempio, comprendendo gli effetti temporali del trattamento farmacologico sul muscolo scheletrico. Una limitazione del metodo qui descritto per quantificare la generazione di forza attiva e le proprietà di manipolazione del calcio in situ è il posizionamento manuale degli elettrodi, che limita l'uso di questo sistema per applicazioni di test molecolari ad alto contenuto. Una possibile soluzione sarebbe quella di progettare un coperchio trasparente di elettrodi impostato come un circuito parallelo che può essere inserito direttamente in un insieme standardizzato di pozzi funzionali che consentono la stimolazione elettrica di più tessuti contemporaneamente. In alternativa, l'uso di una linea cellulare progenitrice miogenica che esprime stabilmente un costrutto di channelrhodopsin consentirebbe la depolarizzazione della membrana cellulare muscolare e, quindi, la contrazione tissutale indotta dall'esposizione alla luce blu. Inoltre, la forza attiva viene catturata nei video poiché la deflessione e la quantificazione della forza contrattile attiva possono essere condotte in modo imparziale utilizzando uno script python semi-automatico personalizzato per tracciare la deflessione post in brevi video. Pertanto, la valutazione longitudinale imparziale della forza contrattile stimolata è abilitata da MyoTACTIC30. Per migliorare l'efficienza dell'analisi dei dati, le applicazioni per smartphone progettate per misurare la forza e contemporaneamente acquisire video di post deflessione, sono ideali per aumentare il throughput.
Infine, il valore di questa piattaforma è stato anche precedentemente descritto nella sua capacità di prevedere con precisione la risposta ai farmaci. Analogamente agli esiti clinici, abbiamo precedentemente riportato che il trattamento delle hMMT (fatte con mioblasti primari) con composti miotossici (desametasone, cerivastatina) ha indotto l'atrofia del miotubo e diminuito la forza contrattile attiva30. Inoltre, il valore predittivo degli hMMT generati da MyoTACTIC è stato convalidato dimostrando che un dosaggio clinicamente rilevante di un chemioterapico usato per trattare il cancro del pancreas, una malattia che è spesso associata alla cachessia2, ha ridotto significativamente la qualità hMMT e la forza contrattile30. Pertanto, la semplice fabbricazione di MyoTACTIC e la sua facilità d'uso nella generazione di hMMT 3D mostra molti vantaggi per l'acquisizione di dati ad alto contenuto, come dimostrato dalla sua affidabilità per quanto riguarda gli output strutturali e funzionali. Una limitazione generale dei dispositivi di coltura cellulare basati su PDMS è che PDMS assorbe le proteine. Il metodo qui descritto fa uso di terreni di coltura contenenti siero, che superano questa limitazione servendo a "bloccare" il dispositivo e consentire di osservare gli effetti dei trattamenti molecolari e farmacologici. Tuttavia, a causa di questa limitazione, le conclusioni definitive sulle dosi molecolari devono essere evitate e le curve di risposta alla dose sono incoraggiate. Al contrario, questa piattaforma non è adatta per la coltura di microtessuti senza siero in quanto gli additivi assorbiranno al PDMS, ostacolando così la salute e lo sviluppo dei tessuti. In futuro, l'integrazione di tecniche come la bioprinting 3D e / o la gestione automatizzata dei liquidi migliorerà la produttività nella produzione di colture hMMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi per aver contribuito all'invenzione della piattaforma culturale MyoTACTIC e per aver stabilito i metodi di fabbricazione e analisi descritti nel presente documento. HL ha ricevuto finanziamenti da un programma di formazione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship e da una borsa di studio per laureati Wildcat dell'Università di Toronto. PMG è la cattedra di ricerca canadese in riparazione endogena e ha ricevuto supporto per questo studio dall'Ontario Institute for Regenerative Medicine, dalla Stem Cell Network e da Medicine by Design, un canada first research excellence program. I diagrammi schematici sono stati creati con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
