यह पांडुलिपि 3 डी मानव कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूज की सरणी का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है और अनुबंध बल और कैल्शियम हैंडलिंग विश्लेषण सहित कार्य के सीटू परख में न्यूनतम आक्रामक डाउनस्ट्रीम है।
कंकाल की मांसपेशी के विट्रो मॉडल में त्रि-आयामी (3 डी) जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक मूल्यवान उन्नति है क्योंकि वे कंकाल मांसपेशियों में सुधार और एक स्केलेबल प्रारूप में कार्य करने का अवसर प्रदान करते हैं जो प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए उत्तरदायी है। 3 डी मांसपेशी संस्कृति प्रणालियां वांछनीय हैं क्योंकि वे वैज्ञानिकों को मानव कोशिकाओं के संदर्भ में कंकाल मांसपेशी पूर्व वीवो का अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं। 3 डी इन विट्रो मॉडल वयस्क कंकाल की मांसपेशियों की देशी ऊतक संरचना के पहलुओं की बारीकी से नकल करते हैं। हालांकि, उनका सार्वभौमिक अनुप्रयोग उन प्लेटफार्मों की उपलब्धता से सीमित है जो निर्माण, लागत और उपयोगकर्ता के अनुकूल सरल हैं, और मानव कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों की अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में उपज देते हैं। इसके अतिरिक्त, चूंकि कंकाल की मांसपेशी एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका निभाती है जो कई रोग राज्यों में समय के साथ बिगड़ा हुआ है, माइक्रोटिस्यूई अध्ययन के लिए एक प्रयोगात्मक मंच सबसे व्यावहारिक है जब न्यूनतम आक्रामक कैल्शियम क्षणिक और अनुबंध बल माप सीधे मंच के भीतर ही आयोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक 96-अच्छी मंच का निर्माण जिसे ‘मायोटैक्टिक’ के नाम से जाना जाता है, और 3 डी मानव कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूज़ (एचएमएमटीएस) के सामूहिक उत्पादन का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, विद्युत उत्तेजना के न्यूनतम आक्रामक अनुप्रयोग के तरीके जो कंकाल की मांसपेशियों के बल और समय के साथ प्रत्येक माइक्रोटिस्यू के कैल्शियम हैंडलिंग के दोहराए गए माप को सक्षम बनाता है।
कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में ऊतकों में से एक है और लोकोमोशन, हीट होमोस्टेसिस और मेटाबोलिज्म जैसे प्रमुख शरीर के कार्यों का समर्थन करती है1। ऐतिहासिक रूप से, पशु मॉडल और दो आयामी (2डी) सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग जैविक प्रक्रियाओं और रोग रोगजनकों का अध्ययन करने के साथ-साथ कंकाल मांसपेशियों की बीमारियों के उपचार में औषधीय यौगिकों के परीक्षण के लिए किया गया है2,3। जबकि पशु मॉडलों ने स्वास्थ्य और रोग में कंकाल की मांसपेशियों के बारे में हमारे ज्ञान में बहुत सुधार किया है, उनके अनुवादीय प्रभाव को उच्च लागत, नैतिक विचारों और अंतरप्रजातिमतभेदों 2,4से बाधित किया गया है। कंकाल की मांसपेशियों का अध्ययन करने के लिए मानव कोशिका आधारित प्रणालियों की ओर मुड़ने में, 2डी सेल संस्कृति प्रणालियां उनकी सादगी के कारण अनुकूल हैं। हालांकि इसकी एक सीमा भी है। यह प्रारूप अक्सर कोशिका-कोशिका और सेल-एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स इंटरैक्शन को फिर से काटने में विफल रहता है जो शरीर के भीतर स्वाभाविक रूप से होते हैं5,6. पिछले कई वर्षों में, तीन आयामी (3 डी) कंकाल मांसपेशी मॉडल शारीरिक और रोग प्रासंगिक प्रक्रियाओं पूर्व वीवो7,8 के मॉडलिंग की अनुमति देकर पूरे पशु मॉडल और पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप मेंउभराहै । दरअसल, अध्ययनों की अधिकता एक जैव कलानीय 3 डी संस्कृति प्रारूप1में मानव कंकाल मांसपेशी मॉडल के लिए रणनीतियों की सूचना दी है । इनमें से कई अध्ययनों के लिए एक सीमा यह है कि संस्कृति प्लेटफार्मों से मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने और एक बल ट्रांसड्यूसर के प्रति लगाव के बाद सक्रिय बल की मात्रा निर्धारित की जाती है, जो विनाशकारी हैऔर इसलिए, एक अंत बिंदु परख9,10, 11,12,13,14,15,17, 18के रूप में सेवा करने तक सीमित है ,19,20,21. अन्य लोगों ने संस्कृति प्रणालियों को डिजाइन किया है जो सक्रिय बल को मापने के गैर-आक्रामक तरीकों की अनुमति देते हैं, लेकिन सभी उच्च सामग्री अणु परीक्षण अनुप्रयोगों7, 8,9,10,14, 18,22, 23,24,25,26,27, 28के लिए उत्तरदायी नहीं हैं ,29.
यह प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी (मायो) माइक्रोटिस्यू सरणी वसीयत में मानव मांसपेशी माइक्रोटिस्यूस (एचएमएमटीएस) बनाने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है ताकि फोर्स (MyoTACTIC) मंच की जांच की जा सके; एक 96 वेल प्लेट डिवाइस 3 डी कंकाल मांसपेशी माइक्रोटिस्यूज30के थोक उत्पादन का समर्थन करता है . MyoTACTIC प्लेट निर्माण विधि एक 96 अच्छी तरह से पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) संस्कृति प्लेट की पीढ़ी को सक्षम बनाती है और एक ही कास्टिंग चरण में सभी समान अच्छी तरह से सुविधाओं को सक्षम बनाती है, जिससे प्रत्येक अच्छी तरह से माइक्रोटिस्यूई गठन के लिए अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। MyoTACTIC के भीतर गठित माइक्रोटिस्यूस में गठबंधन, स्ट्रिएटेड और बहुनीय मायोट्यूब होते हैं जो डिवाइस के अच्छी तरह से अच्छी तरह से पुन: उत्पन्न होते हैं, और परिपक्वता पर, सीटू30में रासायनिक और विद्युत उत्तेजनाओं का जवाब दे सकते हैं। इसके साथ ही, पॉलीयूरेथेन (पीयू) प्रतिकृति से पीडीएमएस मायोटेक्टिक कल्चर प्लेट डिवाइस का निर्माण करने की तकनीक, एचएमएमटी बनाने के लिए अमर मानव मायोजेनिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को लागू करने के लिए एक अनुकूलित विधि, और इंजीनियर एचएमएमटी बल उत्पादन और कैल्शियम हैंडलिंग गुणों के कार्यात्मक मूल्यांकन को रेखांकित और चर्चा की जाती है।
यह पांडुलिपि एक 3 डी एचएमएमटी संस्कृति मॉडल बनाने और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करती है जिसे बुनियादी मांसपेशी जीव विज्ञान, रोग मॉडलिंग, या उम्मीदवार अणु परीक्षण के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकत?…
The authors have nothing to disclose.
हम मोहम्मद अफशर, हाबेन अबराहा, मोहसेन अफशर-बकोशली और सैदेग दावौदी को MyoTACTIC संस्कृति मंच के आविष्कार में योगदान देने और यहां वर्णित निर्माण और विश्लेषण विधियों की स्थापना के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । एचएल को ऑर्गन-ऑन-ए-चिप इंजीनियरिंग एंड एंटरप्रेन्योरशिप और यूनिवर्सिटी ऑफ टोरंटो वाइल्डकैट ग्रेजुएट स्कॉलरशिप में नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (एनएसईआरसी) ट्रेनिंग प्रोग्राम से फंडिंग मिली । पीएमजी एंडोजेनस रिपेयर में कनाडा रिसर्च चेयर है और इसे ओंटारियो इंस्टीट्यूट फॉर रिजेनरेटिव मेडिसिन, स्टेम सेल नेटवर्क और मेडिसिन से डिजाइन, कनाडा फर्स्ट रिसर्च एक्सीलेंस प्रोग्राम से इस अध्ययन के लिए समर्थन प्राप्त हुआ। BioRender.com के साथ योजनाबद्ध आरेख बनाए गए थे।
0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma – Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
Benchtop Vacuum Chamber | Sigma – Aldrich | D2672 | |
BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma – Aldrich | D8418-250ML | |
DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma – Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 – 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Human Recombinant Insulin | Sigma – Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
Microscope | Olympus | IX83 | |
Microscope – Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma – Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma – Aldrich, etc. |
Polyurethane Negative Mold | In House | ||
Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
Thrombin from human plasma | Sigma – Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at – 20°C. |
Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |