Summary
本报告描述了从生物样本中分离和净化硫化甘油（GAGs）的技术，以及一种聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，以接近其大小。GAG通过静电与蛋白质的相互作用，促进组织结构并影响信号过程。GAG 聚合物长度有助于它们对认知配体的结合亲和力。
Abstract
硫化甘油（GAGs），如硫酸肝（HS）和硫酸软骨蛋白（CS），在生物体中随处可见，在各种基本生物结构和过程中起着至关重要的作用。作为聚合物，GAG 作为聚氨酯混合物存在，其中含有聚糖链，范围从 4000 Da 到 40，000 DA 不等。在这些链条中存在着硫化领域，赋予负电荷模式，促进与认知蛋白配体的正电荷残留物的相互作用。GAG 的硫化域必须足够长度，以便进行这些静电相互作用。要了解GAG在生物组织中的功能，研究者必须能够分离、净化和测量GAG的大小。本报告描述了一种实用且多功能的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，该技术可利用该技术解决从各种生物组织类型中分离出来的 GAG 之间的相对较小的尺寸差异。
Introduction
糖氨糖（GAGs）是线性多糖的多样化家族，是生物体中无处不在的元素，有助于许多基本的生理过程1。硫酸肝素 （HS） 和软骨素硫酸盐 （CS） 等 GAG 可能会在多糖链的不同位置硫化，从而提供负电荷的地理域。这些GAG，当系在细胞表面的蛋白质称为蛋白糖，投射到细胞外空间，并结合识别配体，允许调节两个 cis-（利甘附着在同一细胞）和跨（利甘附着在相邻细胞）信号过程2。此外，GAG还作为结构元素在组织中发挥关键作用，如球状地下室膜3、血管内皮糖碱4和肺上皮糖糖6，以及结缔组织（如软骨6）。
GAG多糖链的长度因其生物背景而有很大差异，可以通过高度复杂的酶调控系统7动态延长、切割和修改。重要的是，GAG聚合物链的长度大大有助于它们对配体的结合亲和力，并随后对它们的生物功能8，9。因此，确定内源性GAG的功能需要对其大小进行欣赏。不幸的是，与蛋白质和核酸不同，很少有现成的技术来检测和测量GAG，这在历史上导致对这一多样化多糖家族的生物作用的调查相对有限。
本文描述了如何从大多数生物组织中分离和净化GAG，并描述了如何使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来评估具有相当程度特异性的分离聚合物的长度。与其他高度复杂的（通常基于质谱）的糖电方法不同，这种方法可以使用标准的实验室设备和技术。因此，这种实际方法可以扩大调查人员确定本地GAG的生物作用及其与上下文重要配体的相互作用的能力。
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Protocol
根据科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会批准的协议，本协议中分析的所有生物样本均来自小鼠。
1. 肝硫酸盐隔离
- 组织样本的脱皮
注：脱脂是富含脂肪组织的可选步骤。- 制作甲醇和二氯甲烷的1：1混合物。每个样品准备约 500 μL;较大的组织块可能需要高达 1 mL。
- 将每个组织样本放入一个小玻璃容器中，盖上盖子，以进行熟食。
注：样本质量可能因感兴趣的组织和实验需求而异。50 毫克或更少通常足以达到足够的 GAG 产量，但最终用户可能需要进行一些优化。 - 在每个玻璃容器中加入 500 微升甲醇：二氯甲烷溶液并混合。确保所有固体组织样本完全淹没在溶剂中。
注：使用血清移液器或塑料锥形管混合和处理甲醇/二氯甲烷溶液：其他塑料可能会溶解。 - 将样品放在摇床（固定机架）的化学烟气罩中，轻轻搅拌1小时。
- 在 4°C 下搅拌样品，在 17，000 x g 下混合和离心机 5 分钟。
- 小心地移除有机溶剂分数（超高溶剂）。这是脂质分数 - 它不包含 GAG，可以丢弃。
注意：尽量不要打扰组织，因为小块可能会丢失。最好将一些有机层留在样品容器中，而不是冒着样品丢失的风险。 - 将玻璃容器的盖子打开，让它在引擎盖中蒸发过夜。更改下一步的管子，因为这些管子无法继续加工。
- 一旦溶剂混合物完全蒸发，继续机械分解（如果残留样品为>50毫克）或Actinase E消化（<50毫克）。
- 固体组织的机械分解（可选;用于较大的组织样本）
注意：大多数较小的固体组织（约50毫克或更少）应在消化过程中完全溶解。但是，较大的样品需要机械分解。- 将样品放入适当尺寸的聚丙烯管中，并将封闭的聚丙烯管放入液氮中，从而冻结感兴趣的样品。让样品冻结，直到完全固体。
- 使用干净的砂浆和刺，将冷冻样品研磨成粉末状的稠度。
- 直接进行行动酶 E 消化（第 1.4 步）。
- 样品脱盐和浓度
注：这是一个可选步骤，仅需要稀释液体组织样本（例如支气管-藻类厕所液（BALF）或等离子体）。- 将液体样本池入适当的实验组（例如，通过生物复制或实验组）
- 将总样本量放入 500 μL 离心滤芯柱中，分子重量截止 （MWCO） 为 3，000 Da。
- 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品量超过离心滤芯列的容量，则根据需要重复重复。
- 用 400 μL 的去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。
- 倒置过滤器，在 2，000 x g 的新鲜、标记适当的收集管中旋转 1 分钟。冻结在 -80 °C 或继续下一步。
- 行动酶 E 消化
注意：此步骤需要消化并最终从样品中去除蛋白质污染物。- 混合样品 1：1 与重组的Actinase E到所需的浓度为10毫克/毫升。添加适当的体积10倍消化缓冲浓缩物。期望最终浓度：0.005 M醋酸钙和0.01M醋酸钠，pH 7.5。例如：190 微升液体样品，190 微升 20 毫克/毫克 Actinase E，20 微升 0.05 M 醋酸钙，0.1 M 醋酸钠。
- 轻轻搅拌样品混合，然后在 55 °C 下消化 48-72 小时（整个组织最多 7 天）。
- 加热至 80 °C 15-20 分钟，加热灭活 Actinase E。
- 将样品冻结在 -80 °C 或继续踩 1.5。
- 样品脱盐和浓度
注：如果在生物样品中预期感兴趣的GAG质量较低，或者如果可取的消耗品试剂（即离心滤柱）的保存是可取的，则可以将样品集中在一起，以产生每个实验组的单一浓缩物（例如，通过生物复制或实验组）。- 将总样品量放入 500 μL 离心滤芯中，MWCO 为 3，000 Da。
- 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品体积超过离心滤芯的容量，则根据需要重复重复。
- 用 400 μL 去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。
- 倒置滤镜，在 2，000 x g 的新鲜、标签适当的收集管（通常包含离心滤芯列中）中旋转 1 分钟。冻结在 -80 °C 或继续下一步。
- 干燥
- 要么将第 1.5.5 步的溶解样品放在旋转真空浓缩器中过夜，要么将下面详细描述的样品进行放牧。
- 在 -80 °C 或浸入液氮中彻底冷冻样品。
- 皮尔斯样品盖与18G针，并放置在嗜血室。根据需要添加纸巾进行包装。
- 将嗜血室修复为嗜血剂，并冷冻干燥过夜（至少 -40 °C，0.135 托尔）
- Cation 交换列
- 在高达 400 μL 的 8 M 尿素、2% CHAPS 溶液中重新使用干燥样品（或者，如果将样品集中起来，则重新吸收到最大 （400/n） μL，其中 n = 所需池中的样本数量。尽可能少地使用洗涤剂溶液。
- 用 400 μL 的 8 M 尿素、2% 的 CHAPS 解决方案等价放离子交换 （IEX） 列。在室温下旋转 5 分钟，2，000 x g。
- 将 400 μL 的样品/池样本加载到 IEX 列中。旋转5分钟，2000 x g。
- 用 400 微升 8 M 尿素洗 3 倍， 2% CHAPS 溶液。每次旋转 5 分钟，2，000 x g。
- Elute 3x 与 400 μL 的 0.2 M Nacl 。旋转 5 分钟，每克 2，000 x 克 。这是低亲和力分数 - 如果需要，可以保留用于质量控制目的。
- Elute 3x 与 400 μL 的 2.7 M （16%） Nacl 。旋转 5 分钟，每克 2，000 x 克 。这个分数将包含感兴趣的孤立的糖 - 保留这一切！
- 要干燥每个脱盐分数，加入甲醇高达80伏，并在4°C的夜间孵育。以 2，000 x g旋转每个样品 5 分钟。恢复固体残留物，因为这是干燥的去盐糖。
注：或者，跳过此步骤，继续第 1.8 步，在没有甲醇的情况下脱盐。
- 样品脱盐和浓度
- 如有必要，将分数（从 1.7.6）池池到适当的实验组（例如，通过生物复制或实验组）。
- 将总样品量放入 500 μL 离心滤芯中，MWCO 为 3，000 Da。
- 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品体积超过离心滤芯的容量，则根据需要重复重复。
- 用 400 μL 去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。直接进入第 1.9 步。
- 软骨素消化
注：此步骤的目的是删除最终用户不感兴趣的 GAG。在这种情况下，软骨素酶用于去除软骨素。在用于生成 代表性结果 （支气管-藻类厕所液和整个肺）的组织中，消化硫酸软骨素将硫酸肝作为主要残留GAG。最终用户可能需要根据其实验目标添加额外的消化步骤。- 将 350 μL 的消化缓冲器（50 mM 醋酸铵，2 mM 氯化钙调整为 pH 7.0）装载到离心滤芯柱上，而不接触膜。
- 添加 5 μL 重组软骨素 ABC。
- 将样品管放入 37 °C 烤箱中，孵育 1 小时。
- 将柱子翻过来，放入标记适当的收集管中。旋转1分钟在2000×g。
- 将样品加热至 80 °C，15-20 分钟，使软骨酶 ABC 失活。
- 样品脱盐和浓度
- 如有必要，池软骨素将第1.9.5步的样本消化成适当的实验组（例如，通过生物复制或实验组）
- 将总样品量放入 500 μL 离心滤芯柱中，MWCO 为 3，000 Da。
- 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品量超过离心滤芯的容量，则根据需要重复重复。
- 用 400 μL 去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。
- 反向过滤器和旋转 1 分钟，在 2，000 x g 新鲜，适当标记的收集管。冻结在 -80 °C 或继续下一步。
- 干燥
注：在此步骤中，需要干燥，以便样品可以在尽可能少的水量和运行缓冲器中重新使用。- 要么将从第 1.10.5 步中消化的软骨素直接放在旋转真空浓缩器中过夜，要么将嗜血症如下：
- 在 -80 °C 或浸入液氮中彻底冷冻样品。
- 皮尔斯样品盖与18G针，并放置在嗜血室。根据需要添加纸巾进行包装。
- 将嗜血室修复为嗜血剂，并冷冻干燥过夜（至少 40 °C，0.135 托尔）
2. 分离和纯化糖氨糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 提前准备聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 所需的解决方案 （表 1）。
注意：根据样品中预期的糖甘油的大小，选择溶解凝胶溶液的丙烯酰胺百分比。建议 15% 用于解决较大的碎片（长度大于 30 个脱糖子单位）;22% 用于较小的碎片（长度为 <20 个脱糖子单位）。 - 将空盒式磁带放入 PAGE 储罐中。将溶解凝胶铸造如下：在 15 mL 管中，混合 10 mL 的溶胶溶液、60 微升 10% 的说服铵（必须新鲜准备）和 10 微升的 TEMED（最后添加 TEMED）。轻轻倒置管子 2-3 倍。使用移液器快速将上述 10 mL 溶液添加到盒式磁带中。覆盖 2 mL 的去离子、过滤水，让解析凝胶聚合 30 分钟。
注：使用总体积约为 12mL 的 13.3 x 8.7 厘米（宽度 x 长度）1.0 毫米厚的铸造盒式磁带，为垂直 PAGE 系统优化了以下 PAGE 协议。其他盒式磁带系统可以使用，但可能需要最终用户进行优化。 - 溶解凝胶完全聚合后，丢弃覆盖水并投下堆叠凝胶如下：在 15 mL 管中，混合 3 mL 的堆叠凝胶溶液，90 μL 的 10% 氨化汞说服酸盐（必须新鲜准备），3 μL 的 TEMED（最后添加 TEMED）。
- 轻轻倒置管子 2-3 倍。使用移液器快速将堆叠凝胶溶液添加到凝固的溶胶上;填充盒式磁带到边缘。完全插入梳子包含与设置。允许堆叠凝胶聚合 30 分钟。
- 凝胶聚合后，确保磁带条从盒式磁带底部取出，并将盒式磁带放回 PAGE 罐装配件中。
- 分别用上室和下室缓冲填充上室和下腔。
- 将第 1.11.4 步的干燥样品溶解在最小必要量的去离子、过滤水中（最多是 PAGE 凝胶中井体积的 50%）。将 1：1 与样品加载缓冲器混合。将样品和 HS 寡糖"梯子"（参见 表 1）加载到凝胶中。
- 在 100 V 下预运行凝胶 5 分钟。然后在 200 V 下运行凝胶 20-25 分钟（用于 15% 聚丙烯酰胺解析凝胶）、40-50 分钟（用于 18% 聚丙烯酰胺解析凝胶）、90-100 分钟（用于 22% 聚丙烯酰胺解析凝胶）。
注意：可能需要对 200 V 运行时间进行一些优化。苯酚红色在长度为 2 聚合物亚单位的肝素寡糖之前迁移（即聚合程度 2 或 dp2）：溴酚蓝色在 dp10 - dp14 之前迁移。当电压施加时，将取得最佳效果，使酚红带几乎（但不完全）迁移到凝胶底部。相应地调整运行时间。
3. 银染色协议
- 提前准备银渍所需的所有解决方案（表2）。
注意：在 PAGE 凝胶被染色、开发并放置在停止溶液中之前，不要直接触摸它。相反，使用清洁的塑料或玻璃工具操纵凝胶。直接处理凝胶会导致手指打印变形和污渍后凝胶上的其他可见的伪影。 - 运行完成后，拆解盒式磁带，在装满去离子化过滤水的清洁中型容器中提取凝胶。
注意：为了避免直接处理凝胶，请使用移液器尖端或其他塑料物体在浸入水中时轻轻剥去胶水。凝胶可能很脆弱 - 小心处理。- 丢弃水。在阿尔西安蓝色染色溶液中涂上凝胶 5 分钟。
- 丢弃阿尔西亚蓝色污渍。快速冲洗/清洗 2-3 倍，用去离子化的过滤水，直到大部分阿尔西亚蓝色染色液被移除。
- 允许在摇杆上过夜去污。确保有充足的去离子化，过滤的水，以确保任何残留的污渍被完全冲出凝胶过夜。
- 在 50% 甲醇中清洗凝胶（总计 40 分钟，更改溶液 2-3 倍）。
- 在去离子过滤水中清洗凝胶 30 分钟。丢弃水并重复 3 次，总共 2 小时，每次更换水。
- 在新鲜、干净的容器中，将凝胶涂在硝酸银染色溶液中 30 分钟。
- 快速冲洗/清洗 2-3 倍的去离子、过滤水，以完全去除银渍溶液。
- 在去离子过滤水中洗30分钟。丢弃水并重复 2 次，总共 90 分钟，每次更换水浴。
- 丢弃水并添加开发解决方案。
- 添加开发解决方案后，仔细观察凝胶并注意带的外观。根据污渍的质量和加载样品的质量，开发可能需要几秒钟到几分钟的时间。
- 一旦所需的频段可见，立即丢弃开发的解决方案，并短暂地使用停止溶液进行洗涤。
- 丢弃停止溶液洗涤，代之以新的停止溶液。允许在摇床或摇床上浸泡 1 小时。
- 在去离子的过滤水中清洗过夜（但是，凝胶可以在停止溶液洗涤后立即成像）。
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Representative Results
阿尔西安蓝用于染色硫化GAG 10：此信号通过使用随后的银色污渍 11放大。 图1 提供了银染色开发过程的视觉演示。如前所示，当开发剂穿透聚丙烯酰胺凝胶时，代表电泳分离的 GAG 的阿尔西亚蓝色信号被放大。通常，开发过程将减少银色和阿尔西亚蓝色染色的GAG在密度依赖的方式，每个频段的边缘减少第一，而更密集的染色区域在中心将染色持续。
在文献中，使用基于 PAGE 的方法检测 GAG 的报告限制范围为 0.5-1 μg12、13。为了使用我们的方法确定检测极限，不同聚合物长度（未脱损的肝素、dp20、dp10、dp6）的硫酸硫酸寡糖被加载到 22% 的聚丙烯酰胺凝胶上，然后按上文所述运行并染色。每个寡糖在两个不同的质量上加载两次：1.0微克和0.5微克。图2表明，我们的技术可以很容易地检测到0.5微克的纯化GAG。值得注意的是，在测试的四种不同的寡糖中，未违规的肝素最不容易检测到，这可能是由于聚合物尺寸分布较广，相应地降低了每个单个波段的密度。
为了评估液体生物样品中GAG净化的效率，从两个支气管眼（BAL）样本中分离出GAG。如图 3所示，第一个标记为用于GAG隔离的A样本是1 mL的BAL液体从鼠标收获24小时后，切内脂质糖（LPS）（3毫克/千克），管理诱导藻类上皮HS脱落 5。10 μg 的商用 dp6 直接添加到此 BAL 流体中，作为"尖峰"控制，以评估隔离过程中 GAG 的损失。第二个标为B的样本由3只小鼠的10mLBAL液组成，这些小鼠在24小时前被给予细胞内LPS（3毫克/千克），没有外源性GAG尖峰。两个样本同时处理为 GAG 隔离，从离子交换列中分离出的所有 3 个分数都保留并进一步处理，以确定是否有任何 GAG 存在于低亲和力和洗涤分数中。2 μg 的商业购买 dp20、 dp10 和 dp6 硫酸盐寡糖在 PAGE 凝胶中运行，与这些样本一起运行，以提供参考，通过该参考，对每个被隔离分数中的 HS GAG 大小进行定性评估，并参考将密度与接受 GAG 隔离的 10 μg"尖峰"控制进行比较。
为了证明这种技术在固体组织上的使用，从上面描述的15毫克冷冻小鼠肺中分离出硫酸肝。在隔离和净化过程中，离子交换柱上的低亲和力分数（0.2 M NaCl）被保留并与高亲和力（2.7 M NaCl）分数一起处理，并在凝胶上运行（图4）。2 μg 的商业购买 dp20， dp10 和 dp6 硫酸盐寡糖与这些样品一起运行， 以提供大小参考。可以看出，整个肺同质化产生大量的分离HS，最小的片段大约等于dp10的大小。在 2.7 M NaCl 分数中，阿尔西安蓝色/银色染色狂热含量 GAG 的相对丰富表明，硫酸肝与离子交换柱具有高度亲和力，并且可以从具有高特异性的柱子上脱开。整个肺同质化产生大量的分离硫酸肝（2.7 M NaCl分数），最小的片段大约等于dp10的大小。
图1：银渍开发过程。 由电泳分离的未脱损肝素 （UFH） 或大小定义的寡糖 （dp = 聚合度） 的阿尔西亚蓝色染色被银渍放大。从左到右： UFH， dp20， dp10， dp6。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：多丙烯酰胺凝胶和银渍的敏感性，用于检测硫酸肝。 不同长度的肝素硫酸盐寡糖（无节制肝素又名UFH，dp20，dp10，dp6）被放入22%的聚丙烯酰胺凝胶上，并运行和银色染色。每个寡糖在两个不同的质量加载两次：1.0 μg（最左频段）和 0.5 μg（最右频段）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：液体生物样品GAG净化效率。 从两个支气管动物厕所（BAL）样本中分离出来的GAG，在这里标有"A"和"B"，在22%的聚丙烯酰胺凝胶和银渍上运行。样品A包括从小鼠身上采集的1mLBAL液体，在治疗后24小时用3毫克/千克的腹脂糖（LPS）。在此示例中添加了额外的 10 μg 的 dp6 HS 作为"尖峰"控。样本B包括10mlL的聚合BAL液，在LPS施用后24小时从3只小鼠身上收集。每个样本都与离子交换柱中的分数一起运行，其中既有稀释剂（"洗涤"），也包括 NaCl（0.2 M）的低浓度。2 μg 商业购买的 dp20、dp10 和 dp6 硫酸硫酸寡糖用作尺寸参考 （最左频段） 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：测量从健康的小鼠肺中分离和纯化的肝素硫酸盐的大小。 从从健康小鼠身上分离出的15毫克肺冷冻样本中分离出硫酸肝素含量，并以22%的聚丙烯酰胺凝胶运行。硫酸肝酸从离子交换列中分离出，其浓度低（0.2米;亲和力分数低）或高浓度（2.7米，16%溶液;高亲和力分数）的NaCl。2 μg 商业购买的 dp20、dp10 和 dp6 硫酸硫酸寡糖用作尺寸参考 （最左频段） 。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 注：使用前必须过滤所有解决方案（0.22μm）。 | |||
| 溶液 | 食谱 | 组成 | 评论 |
| 解决凝胶/下腔运行缓冲 （2 L 或 4 L） | 博里克酸， MW 61.83 | 2L： 12.36 克：4L： 24.76 克 | 所需浓度： 0.1 M |
| 特里斯基地， MW 124.14 | 2L： 24.2 克：4L： | 所需浓度： 0.1 M | |
| 二氧化钛 EDTA MW 336.21 或二水合物，MW 372.36 | 2L： 6.7 克或 7.4 克：4L 13.4 克或 14.8 克 | 所需浓度： 0.01 M | |
| 电离水 | 2L 或 4L | 完全溶解试剂后将 pH 值调整为 8.3 | |
| 上室运行缓冲器 （1 L） | 甘氨酸 | 93 克 | 所需浓度： 1 M |
| 特里斯基地， MW 124.14 | 24.2 克 | 所需浓度： 0.2 M | |
| 电离水 | 1 L | ||
| 解决凝胶，22%总丙烯酰胺（500mL） | 丙烯酰胺， MW 71.08 | 100.1 克 | 期望浓度： 20.02% w/v |
| N，N'-甲基甲基二甲基丙烯酰胺（二氧化硫，MW 154.17） | 10 克 | 所需浓度：2% w/v | |
| 蔗糖 | 75 克 | 所需浓度： 15% w/v | |
| 解决凝胶缓冲器 | 500 mL | 总容量达到 500mL;将需要少于 500mL 的缓冲总 | |
| 解决凝胶，总丙烯酰胺（400mL） 15% | 丙烯酰胺， MW 71.08 | 56.3 克 | 期望浓度： 14.08% w/v |
| N，N'-甲基甲基二甲基丙烯酰胺（二氧化硫，MW 154.17） | 3.7 克 | 所需浓度：2% w/v | |
| 蔗糖 | 20.8 克 | 所需浓度： 15% w/v | |
| 解决凝胶缓冲器 | 400 mL | 总容量达到 400mL;将需要不到 400mL 的缓冲总量 | |
| 堆叠凝胶 （100 mL） | 丙烯酰胺， MW 71.08 | 4.75 克 | 期望浓度： 4.75% w/v |
| N，N'-甲基甲基二甲基丙烯酰胺（二氧化硫，MW 154.17） | 0.25 克 | 期望浓度： 0.25% w/v | |
| 解决凝胶缓冲器 | 100 mL | 添加 80mL 缓冲器和完全溶解试剂。然后用盐酸将pH值调整到76.3，滴。然后带来总体积 100 mL 与解决凝胶缓冲。 | |
| 样品装载缓冲器 （500 mL） | 蔗糖 | 250克 | 所需浓度： 50% w/v |
| 酚红色 | 500毫克 | 所需浓度：1毫克/毫升 | |
| 布罗莫酚蓝色 | 250毫克 | 所需浓度：0.5毫克/毫升 | |
| 电离水 | 500mL | 总容量达到 500mL;将需要不到500mL的水总量 | |
| 肝素衍生寡糖"梯子"（每个2mL） | dp6 | 0.1毫克 | 注：建议使用肝素衍生寡糖 6 聚合物亚单位的长度 （又名聚合程度 6， 或 dp6） 为最小的频段， dp20 为最大的波段， 和 dp10 为中间频段.但是，如果需要，可以使用其他组合。所需浓度： 0.05 毫克/毫升 |
| dp10 | 0.1毫克 | ||
| dp20 | 0.1毫克 | ||
| 电离水 | 3mL | 将每个寡糖溶解在单独的管子中，每个管子 1mL | |
| 样品加载缓冲器 | 3mL | 在每个寡糖溶液中加入 1mL （1：1 混合物） | |
表1：纯二甘油糖聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的解决方案。 使用前必须过滤所有解决方案（0.22 μm）。
| 注：使用前必须过滤所有解决方案（0.22μm）。 | |||
| 溶液 | 食谱 | 组成 | 评论 |
| 阿尔西安蓝色染色溶液 （500mL） | 阿尔西安蓝色 8GX 粉末 | 2.5克 | 期望浓度： 0.5% w/v |
| 2% v/v 冰川醋酸 | 500mL | ||
| 银渍 （200 mL） | 电离水 | 192.7 mL | 新鲜准备污渍溶液;在一周内使用。 |
| 7.6M 氢氧化钠 | 2 mL | 要制作，在 10 mL 水中加入 3.04 克氢氧化钠颗粒 | |
| 氢氧化铵 | 3.3 mL | ||
| 4M 硝酸银溶液 | 2 mL | 要制作，在 5 mL 水中加入 3.397 克硝酸银。在搅拌时加入滴水以避免降水。 | |
| 开发解决方案 （501 mL） | 电离水 | 500 mL | 开发解决方案必须在 24 小时内进行新鲜和使用。 |
| 2.5% w/v 柠檬酸 | 1 mL | 要制作，添加 100mg 到 4 mL 去离子水。柠檬酸必须新鲜。 | |
| 甲醛 | 250μL | ||
| 停止解决方案 （500 mL） | 电离水 | 300 mL | |
| 冰川醋酸 | 20 mL | ||
| 甲醇 | 90 mL | ||
表2：由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的糖氨糖糖银染色所需的溶液。 使用前必须过滤所有解决方案（0.22 μm）。
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Discussion
GAG 在许多不同的生物过程中发挥着核心作用。硫化 GAG（如 HS 和 CS）的主要功能之一是与配体交互并绑定，这可以改变下游信号功能。GAG 与认知配体结合亲和力的一个重要决定因素是 GAG 聚合物链的长度 8、9、14。 因此，研究人员必须能够合理精确地定义从感兴趣的生物样本中分离出来的GAG链的大小。为了实用，该技术应能够使用通用的实验室设备和试剂进行。
该协议描述了一种从生物样本中分离和净化GAG的方法，通过PAGE按大小分离它们，并使用阿尔西亚蓝色和银色染色技术将其可视化。虽然有几种方法按大小区分糖糖糖，但我们的方法有几个优势，具体到该技术在生命科学实验室中的应用。首先，该技术的检测限制为 0.5 μg，在检测感兴趣的 GAG 时非常敏感。根据我们的经验，即使是含有相对低浓度的GAG（即BAL液体样品）的样品，也应该产生足够的GAG来使用这种方法进行检测。虽然BAL流体的隔离和纯化产量会因技术和特定的兴趣GAG而异，但我们的经验是，10 mL的原BAL流体产生足够的HS，可以使用这种技术进行检测。固体器官的产量要高得多，这取决于收获的组织，但我们的经验是，10毫克的初始固体样本将产生充足的HS用于使用该技术检测。
请务必注意，染色 PAGE 凝胶的最终成像将因最终用户可用的成像技术而异。凝胶的数码照片可以使用许多不同的系统拍摄，包括许多商用凝胶文档系统或普通商用摄像机，具体取决于可用设备和检测所需的灵敏度（通常由装在凝胶上的样品量决定）。还应注意，以数字方式成像此凝胶所需的光源可能因样品密度和染色过程中所需的开发时间而异。迅速发育并产生肉眼可见的银色带的凝胶需要紫外线透光才能获得最佳图像，因为大多数光线将被未激活的阿尔西亚蓝色吸收。需要较长的开发时间（如样本量非常小的凝胶）需要表观照明或具有正常全光谱光的透光，因为银色污渍最好吸收这些光。
这项技术的进一个优点是，它特别适应生命科学实验室，因为它的基础是简单的PAGE技术，使用设备和试剂，这是常见的和廉价获得的。虽然还有其他方法来量化分离的GAG聚合物的长度（例如毛细电电泳），它们通常需要知识和设备，这是在大多数生命科学实验室15，16中通常没有的。这种方法的简单性和所需的试剂相对经济实惠和可用性，使得对研究GAG生物学感兴趣的生命科学研究人员很容易适应这种技术。此外，该技术是质量光谱技术检测生物组织中GAG的重要补充。虽然基于质谱的方法能够检测高灵敏度的GAG，并从复杂的样品17中辨别结构的细微差别，但由于技术的性质，它无法按大小区分GAG聚合物。因此，基于 PAGE 的方法对于在感兴趣的生物样本中挖掘 HS 聚合物的大小至关重要。
需要注意的是，本文所述的技术存在若干局限性。第一个也是最突出的是，由于电荷相互作用是阿尔西亚蓝色染色反应的核心，这种方法对高硫GAG具有高度选择性，并且只会弱地弄脏更中性电荷的摩尔（例如，透明质酸18）。因此，这种技术可能会偏向于更酸性的GAG莫伊蒂斯的结果。因此，应辅之以补充方法，测量感兴趣的生物样本中的GAG含量（例如，基于质谱的技术），以更全面地了解实验样本中的GAG。此外，对于特别有兴趣测量透明质素大小的最终用户，其他人描述了类似的基于PAGE的技术，利用生物淀粉酸结合蛋白（HABP），这可能适应这里19所述的基本技术。
综上所述，本文中提出的技术可用于分离、净化和检测具有极高灵敏度和特异性的生物样品中的 GAG，以及测量这些多糖链的原生长度。由于 GAG 聚合物长度在确定认知配体结合亲和力方面的重要性，这些信息对于测试关于 GAG-配体相互作用的假设至关重要。这种方法有几个优点，最明显的是它相对简单和适应生命科学研究实验室，虽然它受到其相对偏向负电加格的偏见的限制。尽管有这种缺点，这项技术仍是一个强有力的工具，可以鼓励研究人员研究GAG在器官平衡和疾病中的作用。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作由F31 HL143873-01（WBL），R01 HL125371（RJL和EPS）资助
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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