Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

पॉलीएक्रेलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सिल्वर स्टेनिंग द्वारा ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन का पता लगाना

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62319
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1, 1, 3, 1,5
1Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences, Curtin University, 5Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Summary

इस रिपोर्ट में जैविक नमूनों से सल्फसेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लिकन (जीएजी) को अलग और शुद्ध करने की तकनीकों का वर्णन किया गया है और उनके आकार के अनुमानित करने के लिए एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस दृष्टिकोण है। GAGs ऊतक संरचना में योगदान और प्रोटीन के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से संकेत प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं । गैग बहुलक लंबाई कॉग्नेट लिगांड के लिए उनकी बाध्यकारी आत्मीयता में योगदान देती है।

Abstract

सल्फेट ग्लाइकोसिनोग्लिकन (जीजीएस) जैसे हेपरन सल्फेट (एचएस) और कोंड्रोइटिन सल्फेट (सीएस) जीवित जीवों में सर्वव्यापी हैं और विभिन्न प्रकार की बुनियादी जैविक संरचनाओं और प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। पॉलिमर के रूप में, GAGs पॉलीसैकराइड चेन युक्त पॉलीडिस्परज़ मिश्रण के रूप में मौजूद है जो 4000 डीए से लेकर 40,000 डीए से अधिक हो सकता है। इन श्रृंखलाओं के भीतर सल्फेट के डोमेन मौजूद हैं, जो नकारात्मक आवेश का एक पैटर्न प्रदान करते हैं जो कॉग्नेट प्रोटीन लिगांड के सकारात्मक आवेशित अवशेषों के साथ बातचीत की सुविधा प्रदान करता है। इन इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए अनुमति देने के लिए जीएजी के सल्फेटेड डोमेन पर्याप्त लंबाई के होने चाहिए। जैविक ऊतकों में GAGs के कार्य को समझने के लिए, अन्वेषक को GAGs के आकार को अलग करने, शुद्ध करने और मापने में सक्षम होना चाहिए। यह रिपोर्ट एक व्यावहारिक और बहुमुखी पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस आधारित तकनीक का वर्णन करती है जिसे विभिन्न जैविक ऊतक प्रकारों से अलग GAGs के बीच आकार में अपेक्षाकृत छोटे मतभेदों को हल करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है।

Introduction

ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (जीएजी) रैखिक पॉलीसैकराइड्स का एक विविध परिवार है जो जीवित जीवों में एक सर्वव्यापी तत्व हैं और कई बुनियादी शारीरिक प्रक्रियाओं में योगदान देते हैं1। हेपरन सल्फेट (एचएस) और कोंड्रोइटिन सल्फेट (सीएस) जैसे जीएजी को पॉलीसैकराइड चेन के साथ अलग-अलग पदों पर सल्फस किया जा सकता है, जो नकारात्मक शुल्क के भौगोलिक डोमेन प्रदान करता है। ये जीएजी, जब प्रोटेओग्लाइकैन के रूप में जाने जाने वाले सेल-सरफेस प्रोटीन के लिए सीमित होते हैं, तो एक्साइटेसेलर स्पेस में प्रोजेक्ट करते हैं और कॉग्नेट लिगांड के लिए बाध्य करते हैं, दोनों सीआईएस के नियमन के लिए अनुमति देते हैं- (एक ही सेल से जुड़ी लिगांड) और ट्रांस-(पड़ोसी सेल से जुड़ी लिगामेंट) सिग्नलिंगप्रक्रियाएं 2। इसके अलावा, जीजीएस ऊतकों में संरचनात्मक तत्वों जैसे ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली3, संवहनी एंडोथेलियल ग्लाइकोलिक्स 4 और पल्मोनरी एपिथेलियल ग्लाइकोलिक्स5 और कनेक्टिव ऊतकों में ऐसे उपास्थि6जैसे महत्वपूर्ण भूमिकाएं भी करते हैं।

गैग पॉलीसैकराइड चेन की लंबाई इसके जैविक संदर्भ के अनुसार काफी भिन्न होती है और इसे अत्यधिक जटिल एंजाइमेटिक नियामक प्रणाली7द्वारा गतिशील रूप से लंबा, क्लीव्ड और संशोधित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि गैग बहुलक श्रृंखलाओं की लंबाई लिगामेंट्स के लिए उनके बाध्यकारी आत्मीयता में काफी योगदान देती है और बाद में, उनके जैविक कार्य8,9में योगदान देती है। इस कारण से, एक अंतर्जात गैग के कार्य के निर्धारण के लिए इसके आकार की सराहना की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विपरीत, बहुत कम आसानी से उपलब्ध तकनीकों का पता लगाने और GAGs, जो ऐतिहासिक रूप से इस विविध पॉलीसैकराइड परिवार की जैविक भूमिकाओं में अपेक्षाकृत सीमित जांच के परिणामस्वरूप है उपाय मौजूद हैं ।

यह लेख सबसे जैविक ऊतकों से जीएजी को अलग और शुद्ध करने का वर्णन करता है, और यह भी बताता है कि विशिष्टता की उचित डिग्री के साथ अलग-थलग पॉलिमर की लंबाई का मूल्यांकन करने के लिए पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) का उपयोग कैसे किया जाए। अन्य, अत्यधिक जटिल (और अक्सर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित) ग्लाइकोमिक दृष्टिकोणों के विपरीत, इस विधि को मानक प्रयोगशाला उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करके नियोजित किया जा सकता है। इसलिए, यह व्यावहारिक दृष्टिकोण, देशी GAGs की जैविक भूमिका और प्रासंगिक रूप से महत्वपूर्ण ligands के साथ उनकी बातचीत का निर्धारण करने के लिए जांचकर्ताओं की क्षमता का विस्तार कर सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण किए गए सभी जैविक नमूने चूहों से प्राप्त किए गए थे, कोलोराडो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत ।

1. हेपरन सल्फेट अलगाव

  1. ऊतक नमूनों का परिसीमन
    नोट: डिपिडेशन वसा युक्त ऊतकों के लिए एक वैकल्पिक कदम है।
    1. मेथनॉल और डाइक्लोरोमेथेन का 1:1 मिश्रण बनाएं। प्रति नमूना लगभग 500 μL तैयार करें; ऊतक के बड़े टुकड़ों को 1 एमएल तक की आवश्यकता हो सकती है।
    2. प्रत्येक ऊतक नमूने को एक छोटे ग्लास कंटेनर में एक ढक्कन के साथ एक ढक्कन के साथ रखें।
      नोट: नमूना द्रव्यमान ब्याज और प्रयोगात्मक जरूरतों के ऊतकों के अनुसार भिन्न हो सकता है। 50 मिलीग्राम या उससे कम आम तौर पर पर्याप्त गैग उपज के लिए पर्याप्त है, लेकिन अंत उपयोगकर्ता के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
    3. मेथनॉल के 500 माइक्रोन जोड़ें: प्रत्येक ग्लास कंटेनर में डाइक्लोरोमेथेन समाधान और मिश्रण करें। सुनिश्चित करें कि सभी ठोस ऊतक नमूने पूरी तरह से विलायक में डूबे हुए हैं।
      नोट: मेथनॉल/डाइक्लोरोमेथेन समाधान को मिलाने और संभालने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट या प्लास्टिक शंकु नलियों का उपयोग करें; अन्य प्लास्टिक भंग हो सकते हैं।
    4. एक रासायनिक धुएं हुड में एक शेखर (सुरक्षित रैक में) पर नमूने रखें और 1 घंटे के लिए धीरे से आंदोलन करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर मिश्रण और अपकेंद्रित्र करने के लिए नमूनों को उत्तेजित करें।
    6. ऑर्गेनिक सॉल्वेंट अंश (सुपरनैंट) को ध्यान से पिपेट करें। यह लिपिड अंश है - इसमें जीजीएस नहीं है और इसे त्याग दिया जा सकता है।
      नोट: छोटे टुकड़े खो सकता है के रूप में ऊतक परेशान करने के लिए नहीं की कोशिश करो । नमूना हानि को खतरे में डालने के बजाय नमूना कंटेनर में कुछ कार्बनिक परत छोड़ना बेहतर है।
    7. कांच के कंटेनर के ढक्कन को खुला छोड़ दें और इसे हुड में रात भर वाष्पित होने दें। अगले चरण के लिए ट्यूब बदलें क्योंकि वे ट्यूब आगे की प्रक्रिया से जीवित नहीं रहेंगे।
    8. एक बार विलायक मिश्रण पूरी तरह से सुखाया है, यांत्रिक विघटन के लिए आगे बढ़ना (यदि अवशिष्ट नमूना >50 मिलीग्राम) या Actinase ई पाचन (< 50 मिलीग्राम) है।
  2. ठोस ऊतक का यांत्रिक विघटन (वैकल्पिक; बड़े ऊतक नमूनों के लिए)
    नोट: ठोस ऊतक के अधिकांश छोटे टुकड़े (लगभग 50 मिलीग्राम या उससे कम) पाचन चरण के दौरान पूरी तरह से भंग होना चाहिए। हालांकि, बड़े नमूनों को यांत्रिक विघटन की आवश्यकता होगी।
    1. ब्याज के फ्लैश-फ्रीज नमूने उन्हें उचित आकार की पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में रखकर और बंद ट्यूब को तरल नाइट्रोजन में रखकर। नमूना पूरी तरह से ठोस होने तक फ्रीज करने की अनुमति दें।
    2. एक साफ मोर्टार और मूसल का उपयोग करना, एक पाउडर की तरह स्थिरता में जमे हुए नमूनों पीस ।
    3. सीधे ऐक्टिसे ई पाचन (चरण 1.4) पर आगे बढ़ें।
  3. नमूना desalting और एकाग्रता
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है और केवल तरल ऊतक नमूनों को पतला करने के लिए आवश्यक है (उदाहरण के लिए, ब्रोंचो-अल्वेलर लावेज तरल पदार्थ (बाल्फ) या प्लाज्मा)।
    1. उपयुक्त प्रायोगिक समूहों में पूल तरल नमूने (उदाहरण के लिए, जैविक दोहराने, या प्रयोगात्मक समूह द्वारा)
    2. 3,000 डीए के आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) के साथ 500 माइक्रोन सेंट्रल सेंट्रलफ्यूगल फिल्टर कॉलम में कुल नमूना मात्रा रखें।
    3. कमरे के तापमान पर 14,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए स्पिन करें। यदि वांछित नमूना मात्रा अपकेंद्रित्र फ़िल्टर कॉलम की क्षमता से अधिक है तो आवश्यकतानुसार दोहराएं।
    4. प्रत्येक कॉलम 3x को 400 माइक्रोल डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी से धोएं। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    5. फ़िल्टर को उलटें और ताजा, उचित लेबल वाले संग्रह ट्यूबों में 2,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज या अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  4. ऐक्टिनेस ई पाचन
    नोट: यह कदम पचाने और अंततः अपने नमूने से प्रोटीन प्रदूषकों को दूर करने के लिए आवश्यक है ।
    1. 10 मिलीग्राम/एमएल की वांछित एकाग्रता के लिए पुनर्संयोजन ऐक्टिनेज ई के साथ नमूने 1:1 मिलाएं । 10x पाचन बफर ध्यान की उचित मात्रा जोड़ें। वांछित अंतिम एकाग्रता: 0.005 मीटर कैल्शियम एसीटेट और 0.01 मीटर सोडियम एसीटेट, पीएच 7.5। उदाहरण के लिए: तरल नमूना के 190 माइक्रोन, 20 मिलीग्राम/एमएल ऐक्टिनेज ई के 190 माइक्रोन, 0.05 मीटर कैल्शियम एसीटेट के 20 माइक्रोन, 0.1 एम सोडियम एसीटेट।
    2. धीरे-धीरे मिश्रण करने के लिए नमूनों को उत्तेजित करें, फिर 55 डिग्री सेल्सियस (पूरे ऊतक के लिए 7 दिनों तक) पर 48-72 घंटे तक पचा लें।
    3. एक्टिवा ई को गर्म करने के लिए 15-20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी।
    4. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज या 1.5 कदम जारी है।
  5. नमूना desalting और एकाग्रता
    नोट: यदि जैविक नमूने में ब्याज के गैग का कम द्रव्यमान प्रत्याशित है, या यदि उपभोग्य अभिकर्मकों (यानी, अपकेंद्रित्र फिल्टर कॉलम) का संरक्षण वांछनीय है, तो नमूनों को प्रति प्रायोगिक समूह (उदाहरण के लिए, जैविक दोहराने, या प्रयोगात्मक समूह द्वारा) एक भी ध्यान केंद्रित करने के लिए एकत्र किया जा सकता है।
    1. 3,000 डीए के MWCO के साथ 500 माइक्रोन सेंट्रल सेंट्रलाइज्ड फिल्टर कॉलम में कुल नमूना मात्रा रखें।
    2. कमरे के तापमान पर 14,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए स्पिन करें। आवश्यकतानुसार दोहराएं, यदि वांछित नमूना मात्रा अपकेंद्रित्र फ़िल्टर कॉलम की क्षमता से अधिक है।
    3. प्रत्येक कॉलम 3x को 400 माइक्रोन डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी से धोएं। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    4. उलटा फिल्टर और ताजा, उचित लेबल संग्रह ट्यूबों में 2,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन (आम तौर पर अपकेंद्रित्र फिल्टर कॉलम के साथ शामिल) । -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज या अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  6. निर्जलीकरण
    1. या तो चरण 1.5.5 से भंग नमूनों को एक घूर्णन वैक्यूम सांता में रात भर रखें या नीचे विस्तृत रूप में नमूनों को ल्योफिलाइज करें।
    2. नमूनों को अच्छी तरह से फ्रीज करें या तो रात भर -80 डिग्री सेल्सियस में या तरल नाइट्रोजन में डुबकी लगाकर।
    3. एक 18 जी सुई के साथ छेद नमूना lids और lyophilizer कक्ष में जगह है। जरूरत के अनुसार पैकिंग के लिए पेपर टॉवेल डालें।
    4. लियोफिलाइजर चैंबर को लियोफिलाइजर को ठीक करें और रात भर सूखी फ्रीज करें (कम से कम -40 डिग्री सेल्सियस, 0.135 टोर)
  7. Cation एक्सचेंज कॉलम
    1. 8 एम यूरिया के 400 माइक्रोन तक के नमूनों को पुन: स्थापित किया गया, 2% चैप्स समाधान (या, यदि नमूने एकत्र करना, तो अधिकतम (400/n) μL तक पुनर्निर्भर करें, जहां एन = वांछित पूल में नमूनों की संख्या। जितना संभव हो डिटर्जेंट समाधान के रूप में कम का उपयोग करें।
    2. 8 एम यूरिया, 2% चैप्स समाधान के 400 माइक्रोन के साथ cation एक्सचेंज (आईईएक्स) कॉलम को बराबर करें। कमरे के तापमान पर 2,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें।
    3. आईईएक्स कॉलम में नमूने/पूल किए गए नमूनों के 400 माइक्रोन लोड करें। 2,000 x ग्राम पर 5 मिनट केलिए स्पिन।
    4. 8 एम यूरिया, 2% चैप्स समाधान के 400 माइक्रोन के साथ 3x धोएं। हर बार 2,000 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें।
    5. एल्यूट 3x 0.2 एम एनएसीएल के 400 माइक्रोन के साथ। प्रत्येक 2,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। यह कम आत्मीयता अंश है - यदि वांछित हो तो इसे गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए बनाए रखा जा सकता है।
    6. एल्यूट 3x 2.7 एम (16%) नैक के 400 माइक्रोन के साथ। प्रत्येक 2,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। इस अंश में ब्याज के अलग ग्लाइकोसमिनोग्लाइकैन शामिल होंगे - यह सब रखें!
    7. प्रत्येक eluted अंश को कम करने के लिए, 80 vol% तक मेथनॉल जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक नमूने को 2,000 x ग्राम पर 5 मिनट केलिए स्पिन करें। ठोस अवशेषों को ठीक करें क्योंकि यह सूखे डी-नमकीन ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, इस चरण को छोड़ दें और मेथनॉल के बिना एलुएट को डी-नमक करने के लिए 1.8 कदम आगे बढ़ाएं।
  8. नमूना desalting और एकाग्रता
    1. यदि आवश्यक हो, तो उचित प्रयोगात्मक समूहों (उदाहरण के लिए, जैविक दोहराने, या प्रयोगात्मक समूह द्वारा) में पूल eluted अंश (1.7.6 से) ।
    2. 3,000 डीए के MWCO के साथ 500 माइक्रोन सेंट्रल सेंट्रलाइज्ड फिल्टर कॉलम में कुल नमूना मात्रा रखें।
    3. कमरे के तापमान पर 14,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए स्पिन करें। आवश्यकतानुसार दोहराएं, यदि वांछित नमूना मात्रा अपकेंद्रित्र फ़िल्टर कॉलम की क्षमता से अधिक है।
    4. प्रत्येक कॉलम 3x को 400 माइक्रोन डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी से धोएं। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। सीधे 1.9 चरण के लिए आगे बढ़ें।
  9. चेंड्रोइटिन पाचन
    नोट: इस चरण का उद्देश्य अंतिम उपयोगकर्ता के लिए रुचि नहीं GAGs को हटाना है। इस मामले में, कोनड्रोइटिन को हटाने के लिए कोनड्रोइटिन का उपयोग किया जाता है। प्रतिनिधि परिणाम (ब्रोन्चो-अल्वेलर लावेज तरल पदार्थ और पूरे फेफड़े) उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतकों में, कोंड्रोइटिन सल्फेट को पचाने से प्राथमिक अवशिष्ट गैग के रूप में हेपरन सल्फेट होता है। अंत उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोगात्मक उद्देश्य के आधार पर अतिरिक्त पाचन चरण जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है।
    1. पाचन बफर के 350 माइक्रोन लोड (50 mm अमोनियम एसीटेट 2 m कैल्शियम क्लोराइड पीएच 7.0 में समायोजित) झिल्ली को छूने के बिना अपकेंद्रित्र फिल्टर कॉलम के लिए।
    2. 5 माइक्रोनल रीकॉम्बिनेंट कॉन्ड्रोइटिनेस एबीसी जोड़ें।
    3. नमूनों की ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. कॉलम को चालू करें और उचित रूप से लेबल किए गए संग्रह ट्यूबों में रखें। 2000 x ग्राम पर 1 मिनट केलिए स्पिन।
    5. कोंड्रोइटिनेस एबीसी को निष्क्रिय करने के लिए 15-20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी के नमूने।
  10. नमूना desalting और एकाग्रता
    1. यदि आवश्यक हो, तो पूल कोन्ड्रोइटिन ने चरण 1.9.5 से नमूनों को उचित प्रयोगात्मक समूहों में पचाया (उदाहरण के लिए, जैविक दोहराने, या प्रयोगात्मक समूह द्वारा)
    2. कुल नमूना मात्रा को 3,000 डीए के MWCO के साथ 500 माइक्रोन सेंट्रल सेंट्रलफ्यूगल फ़िल्टर कॉलम में रखें।
    3. कमरे के तापमान पर 14,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए स्पिन करें। यदि वांछित नमूना मात्रा अपकेंद्रित्र फिल्टर कॉलम की क्षमता से अधिक है तो आवश्यकतानुसार दोहराएं।
    4. प्रत्येक कॉलम 3x को 400 माइक्रोन डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी से धोएं। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    5. उलटा फिल्टर और ताजा, उचित लेबल संग्रह ट्यूबों में 2,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए स्पिन। -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज या अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  11. निर्जलीकरण
    नोट: इस चरण में, प्रारंभिककरण आवश्यक है ताकि नमूनों को पानी की छोटी से छोटी संभावित मात्रा और चलने वाले बफर में फिर से निलंबित किया जा सके।
    1. या तो चरण 1.10.5 से सीधे एक घूर्णन वैक्यूम सांद्रता में रात भर या इस प्रकार के रूप में lyophilize के नमूनों को पचाने वाले को कोंडाड्रोइटिन रखें:
    2. नमूनों को अच्छी तरह से फ्रीज करें या तो रात भर -80 डिग्री सेल्सियस में या तरल नाइट्रोजन में डुबकी लगाकर।
    3. एक 18 जी सुई के साथ छेद नमूना lids और lyophilizer कक्ष में जगह है। जरूरत के अनुसार पैकिंग के लिए पेपर टॉवेल डालें।
    4. लियोफिलाइजर चैंबर को लियोफिलाइजर को ठीक करें और रात भर सूखी फ्रीज करें (कम से कम 40 डिग्री सेल्सियस, 0.135 टोर)

2. पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस अलग और शुद्ध ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन

  1. पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) के लिए आवश्यक समाधान पहले से तैयार करें(तालिका 1)।
    नोट: नमूने में होने की उम्मीद ग्लाइकोसामिनोग्लाइकाइकैन के आकार के आधार पर जेल समाधान को हल करने के प्रतिशत एक्रिलैमाइड का चयन करें। बड़े टुकड़ों को हल करने के लिए 15% की सिफारिश की जाती है (लंबाई में 30 से अधिक डिआकराइड सब यूनिट); छोटे टुकड़ों के लिए 22% (लंबाई में <20 डिसिट सब यूनिट)।
  2. पेज टैंक में खाली कैसेट रखें। हल करने वाले जेल को इस प्रकार डालें: 15 एमएल ट्यूब में, जेल समाधान को हल करने के 10 एमएल, 10% अमोनियम अनुरल (हौसले से तैयार किया जाना चाहिए) के 60 माइक्रोन मिलाएं, और TEMED के 10 माइक्रोन (पिछले TEMED जोड़ें)। ट्यूब को धीरे-धीरे 2-3x उलटें। कैसेट के लिए ऊपर 10 एमएल समाधान जल्दी से जोड़ने के लिए पिपेट का उपयोग करें। 2 एमएल के डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी के साथ ओवरले करें और हल करने वाले जेल को 30 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें।
    नोट: निम्नलिखित पेज प्रोटोकॉल को लगभग 12mL की कुल मात्रा के साथ 13.3 x 8.7 सेमी (चौड़ाई x लंबाई) 1.0 मिमी मोटी कास्टिंग कैसेट का उपयोग करके एक ऊर्ध्वाधर पेज सिस्टम के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य कैसेट सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है लेकिन अंत उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  3. हल करने के बाद जेल पूरी तरह से बहुलीकृत हो गया है, मढ़ा हुआ पानी त्यागें और स्टैकिंग जेल को इस प्रकार डालें: 15 एमएल ट्यूब में, स्टैकिंग जेल समाधान के 3 एमएल, 10% अमोनियम अनुलुल्फेट के 90 μL (हौसले से तैयार किया जाना चाहिए), 3 μL TEMED (टेम ईडी को अंतिम रूप से जोड़ें)।
  4. ट्यूब को धीरे-धीरे 2-3x उलटें। जम के समाधान जेल पर स्टैकिंग जेल समाधान को जल्दी से जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें; किनारा करने के लिए कैसेट भरें। पूरी तरह से सेट अप के साथ शामिल कंघी डालें। स्टैकिंग जेल को 30 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें।
  5. एक बार जेल बहुलक हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि टेप पट्टी कैसेट के नीचे से हटा दी गई है, और कैसेट को वापस पेज टैंक असेंबली में रखें।
  6. ऊपरी और निचले कक्षों को क्रमशः ऊपरी और निचले कक्ष बफर के साथ भरें।
  7. डियोनाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी की न्यूनतम आवश्यक मात्रा में चरण 1.11.4 से सूखे नमूनों को भंग करें (अधिकांश, पेज जेल में कुओं की मात्रा का 50%)। नमूना लोडिंग बफर के साथ 1:1 मिलाएं। नमूनों और एचएस ओलिगोसैकराइड "सीढ़ी" (तालिका 1देखें) को जेल में लोड करें।
  8. 100 वी पर 5 मिनट के लिए जेल को प्री-रन करें। फिर 20-25 मिनट (15% पॉलीएक्रेलैमाइड समाधान जेल के लिए), 40-50 मिनट (18% पॉलीएक्रेलैमाइड समाधान जेल के लिए), 90-100 मिनट (22% पॉलीएक्रीलामाइड समाधान जेल के लिए) के लिए 200 वी पर जेल चलाएं।
    नोट: 200 वी रन समय का कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है। फिनॉल लाल हेपरिन ओलिगोसैकराइड्स के आगे माइग्रेट होता है जो लंबाई में 2 बहुलक उपइकाइट्स हैं (यानी, बहुलीकरण की डिग्री 2, या डीपी 2); ब्रोमोफेनॉल ब्लू dp10-dp14 के आगे माइग्रेट करता है। वोल्टेज लागू होने पर सबसे अच्छे परिणाम प्राप्त किए जाते हैं ताकि फिनोल लाल बैंड लगभग माइग्रेट हो जाए, लेकिन जेल के नीचे तक काफी नहीं। तदनुसार रन टाइम समायोजित करें।

3. सिल्वर धुंधला प्रोटोकॉल

  1. चांदी के लिए आवश्यक सभी समाधान तैयार करें(तालिका 2)।
    नोट: पेज जेल को तब तक सीधे न छुएं जब तक कि यह दाग, विकसित और स्टॉप समाधान में न रखा जाए। इसके बजाय, साफ प्लास्टिक या ग्लास उपकरणों का उपयोग करके जेल में हेरफेर करें। सीधे जेल को संभालने के परिणामस्वरूप धुंधला होने के बाद जेल पर फिंगर प्रिंट विकृतियां और अन्य दृश्यमान कलाकृतियां होंगी।
  2. एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, कैसेट को अलग करें और एक साफ, मध्यम-बड़े कंटेनर में जेल निकालें, जो डिएकॉनाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी से भरा होता है।
    नोट: सीधे जेल से निपटने से बचने के लिए, पानी में डूबे हुए जेल को धीरे-धीरे कैसेट से दूर छीलने के लिए पिपेट टिप या अन्य प्लास्टिक ऑब्जेक्ट का उपयोग करें। जेल नाजुक हो सकता है - ध्यान से संभालें।
    1. पानी को त्याग दें। 5 मिनट के लिए एल्सियन ब्लू स्टेनिंग समाधान में जेल को दाग दें।
    2. एल्सियन नीले दाग को त्यागें। जल्दी से कुल्ला/deionized, फ़िल्टर पानी के साथ 2-3x धोने जब तक Alcian नीले धुंधला समाधान के अधिकांश हटा दिया गया है ।
    3. रॉकर पर रात भर डिएकोनाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी में डी-दाग की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि किसी भी अवशिष्ट दाग को पूरी तरह से रात भर जेल से धोया जाता है सुनिश्चित करने के लिए deionized, फ़िल्टर पानी की पर्याप्त मात्रा है।
    4. 50% मेथनॉल (40 मिनट कुल, परिवर्तन समाधान 2-3x) में जेल धोएं।
    5. 30 मिनट के लिए डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी में जेल धोएं। पानी को त्यागें और हर बार पानी की जगह कुल 2 घंटे के लिए 3 और समय दोहराएं।
    6. एक ताजा, साफ कंटेनर में, चांदी नाइट्रेट धुंधला समाधान में 30 मिनट के लिए जेल दाग।
    7. चांदी के धुंधला घोल को पूरी तरह से हटाने के लिए डिओनाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी में 2-3x को जल्दी से कुल्ला/धोएं।
    8. डिएकोनाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी में 30 मिनट के लिए धोएं। पानी को त्यागें और हर बार पानी स्नान की जगह कुल 90 मिनट के लिए 2x दोहराएं।
    9. पानी को त्यागें और विकासशील समाधान जोड़ें।
    10. एक बार विकासशील समाधान जोड़ दिया जाता है, ध्यान से जेल का निरीक्षण और बैंड की उपस्थिति के लिए देखते हैं। दाग की गुणवत्ता और नमूना लोड के द्रव्यमान के आधार पर, विकास कुछ सेकंड से कई मिनट तक कहीं भी ले जा सकता है।
    11. जैसे ही वांछित बैंड दिखाई दे रहे हैं, तुरंत विकासशील समाधान को त्यागें और स्टॉप समाधान के साथ संक्षेप में धोएं।
    12. स्टॉप सॉल्यूशन वॉश को छोड़ दें और ताजा स्टॉप सॉल्यूशन से बदलें। एक घुमाव या शेखर पर 1 घंटे के लिए भिगोने के लिए अनुमति दें।
    13. रात भर डिएकाइज्ड, फ़िल्टर किए गए पानी में धोएं (हालांकि, जेल को स्टॉप सॉल्यूशन वॉश के तुरंत बाद इमेज किया जा सकता है)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एल्सियन ब्लू का उपयोग सल्फेटेड जीजीएस 10को दाग देने के लिए किया जाता है; इस संकेत एक बाद चांदी दाग 11के उपयोग से परिलक्षित होता है . चित्रा 1 चांदी धुंधला विकास प्रक्रिया का एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करता है। जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए गए जीएजी का प्रतिनिधित्व करने वाले एलेशियन ब्लू सिग्नल को परिलक्षित किया जाता है क्योंकि विकासशील एजेंट पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में प्रवेश करता है। आमतौर पर, विकासशील प्रक्रिया एक घनत्व निर्भर फैशन में चांदी और Alcian नीले दाग GAGs को कम करेगा, प्रत्येक बैंड के किनारों के साथ पहले कम करने जबकि केंद्र में अधिक घनी धुंधला क्षेत्रों पिछले दाग होगा ।

साहित्य में, पेज-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके जीएजी का पता लगाने की कथित सीमा 0.5-1 माइक्रोग्राम12, 13से होती है। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग कर पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए, विभिन्न बहुलक लंबाई (बिना उल्लंघन हेपरिन, dp20, dp10, dp6) के हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स को 22% पॉलीएक्रालेमाइड जेल पर लोड किया गया था, फिर ऊपर वर्णित के रूप में दौड़ा और दाग दिया गया था। प्रत्येक ओलिगोसैकराइड को दो अलग-अलग जनता पर दो बार लोड किया गया था: 1.0 माइक्रोग्राम और 0.5 माइक्रोन। चित्रा 2 दर्शाता है कि हमारी तकनीक काफी आसानी से शुद्ध गैग के 0.5 माइक्रोग्राम का पता लगा सकती है। विशेष रूप से, बिना उल्लंघन वाले हेपरिन को कम से कम चार अलग-अलग ओलिगोसैकराइड्स का परीक्षण किया गया था, जो कि प्रत्येक बैंड के घनत्व को तदनुसार कम करने वाले बहुलक आकारों के व्यापक वितरण के कारण होने की संभावना है।

तरल जैविक नमूनों से गैग शुद्धिकरण की दक्षता का आकलन करने के लिए, जीएजी को दो ब्रोंकोलवेओलर लावगे (बाल) नमूनों से अलग किया गया था। जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, गैग अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले बाल तरल पदार्थ का 1 एमएल था जो इंट्राट्राचेल लिपोपॉलिसाकराइड (एलपीएस) (3 मिलीग्राम/किलो) के बाद माउस 24 घंटे से काटा गया था, जो अल्वेलर एपिथेलियल एचएस बहा 5को प्रेरित करने के लिए प्रशासित था। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dp6 के 10 μg इस बाल तरल पदार्थ के लिए सीधे जोड़ा गया था एक "में स्पाइक" नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए अलगाव की प्रक्रिया के दौरान GAGs के नुकसान का आकलन । बी के रूप में चिह्नित दूसरे नमूने में 3 चूहों से पूल किए गए बाल द्रव के 10 एमएल शामिल थे, जिन्हें इंट्राचेल एलपीएस (3 मिलीग्राम/किलो) 24 घंटे पहले दिया गया था, बिना बहिर्जात गैग स्पाइक-इन के । दोनों नमूनों को एक साथ गैग अलगाव के लिए संसाधित किया गया था, और आयन एक्सचेंज कॉलम से सभी 3 अंशों को बनाए रखा गया था और आगे यह निर्धारित करने के लिए संसाधित किया गया था कि क्या कोई GAGs कम आत्मीयता में मौजूद थे और अंशों को धोते थे। व्यावसायिक रूप से खरीदे गए dp20, dp10, और dp6 हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स के 2 μg इन नमूनों के साथ पेज जेल में एक संदर्भ प्रदान करने के लिए चलाए गए थे जिसके द्वारा प्रत्येक eluted अंश में एचएस GAGs के आकार का गुणात्मक आकलन करने के लिए, साथ ही साथ 10 माइक्रोन "स्पाइक इन" नियंत्रण के साथ घनत्व की तुलना करने के लिए एक संदर्भ है कि अलगाव GAG से गुजरना पड़ा ।

ठोस ऊतक पर इस तकनीक के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हेपरन सल्फेट को ऊपर वर्णित जमे हुए माउस फेफड़ों के 15 मिलीग्राम टुकड़े से अलग किया गया था। अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान, आयन एक्सचेंज कॉलम से कम आत्मीयता अंश (0.2 एम एनएसीएल) को उच्च आत्मीयता (2.7 एम एनएसीएल) अंश के साथ बनाए रखा गया था और संसाधित किया गया था और जेल(चित्रा 4)पर चलाया गया था। आकार के लिए संदर्भ प्रदान करने के लिए इन नमूनों के साथ व्यावसायिक रूप से खरीदे गए dp20, dp10, और dp6 हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स के 2 माइक्रोन चलाए गए थे। जैसा कि देखा जा सकता है, पूरे फेफड़े समरूप अलग एचएस की एक पर्याप्त मात्रा में मिले, छोटे टुकड़े के साथ लगभग आकार में dp10 बराबर । २.७ एम NaCl अंश में Alcian नीले/चांदी दाग शौकीन चावला सामग्री GAGs के सापेक्ष संवर्धन दर्शाता है कि heparan सल्फेट आयन विनिमय स्तंभों के लिए उच्च आत्मीयता के साथ बांधता है और उच्च विशिष्टता के साथ कॉलम से eluted किया जा सकता है । पूरे फेफड़े समरूप अलग हेपरन सल्फेट (2.7 एम एनएसीएल अंश) की पर्याप्त मात्रा में मिले, जिसमें सबसे छोटे टुकड़े लगभग आकार में dp10 के बराबर थे।

Figure 1
चित्रा 1:चांदी दाग विकास प्रक्रिया। इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए गए बिना उल्लंघन वाले हेपरिन (यूएफएच) या आकार-परिभाषित ओलिगोसैकराइड्स (डीपी = डिग्री बहुलीकरण) का एलेशियन ब्लू धुंधला चांदी के धुंधला द्वारा परिलक्षित होता है। बाएं से दाएं: यूएफएच, डीपी20, डीपी10, डीपी 6। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:हेपरन सल्फेट के लिए पता लगाने के लिए पॉलीएक्रीलामाइड जेल और चांदी के दाग की संवेदनशीलता। विभिन्न लंबाई के हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड (बिना उल्लंघन हेपरिन उर्फ यूएफएच, डीपी 20, डीपी 10, डीपी6) 22% पॉलीएक्रीलामाइड जेल पर थे और भागा और चांदी दाग दिया गया। प्रत्येक ओलिगोसैकराइड को दो अलग-अलग जनता पर दो बार लोड किया गया था: 1.0 माइक्रोन (लेफ्टेस्ट बैंड) और 0.5 माइक्रोन (सबसे सही बैंड)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:तरल जैविक नमूनों से गैग शुद्धिकरण की दक्षता। दो bronchoalveolar lavage (बाल) नमूनों से अलग GAGs, "ए" और "बी" के रूप में यहां लेबल, एक 22% पॉलीएक्रियालैमाइड जेल और चांदी दाग पर चला रहे थे । नमूना ए में 3 मिलीग्राम/किलो इंट्राआचेल लिपोपॉलीसैकराइड (एलपीएस) के साथ उपचार के बाद माउस 24 घंटे से काटा गया बाल तरल पदार्थ का 1mL शामिल था । इस नमूने में "स्पाइक इन" नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त 10 माइक्रोन जोड़ा गया था। नमूना बी में एलपीएस के प्रशासन के बाद 3 चूहों 24 घंटे से एकत्र पूल्ड बाल तरल पदार्थ के 10 एमएल शामिल थे। प्रत्येक नमूना आयन विनिमय स्तंभ से अंशों के साथ चलाया गया था या तो पतला ("धोने") या NaCl (0.2 M) की कम सांद्रता के साथ eluted । व्यावसायिक रूप से खरीदे गए dp20, dp10, और dp6 हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स का उपयोग आकार संदर्भ (सबसे अधिक बैंड) के रूप में किया जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एक स्वस्थ माउस फेफड़ों से अलग और शुद्ध हेपरन सल्फेट के आकार को मापने। हेपरिन सल्फेट सामग्री एक स्वस्थ माउस से अलग फेफड़ों के 15 मिलीग्राम जमे हुए नमूने से अलग और शुद्ध और 22% पॉलीएक्रीलामाइड जेल पर चलती है। हेपरन सल्फेट को आयन एक्सचेंज कॉलम से या तो कम सांद्रता (0.2 एम; कम आत्मीयता अंश) या उच्च सांद्रता (2.7 एम, 16% समाधान; उच्च आत्मीयता अंश) के साथ नैकल के साथ स्पष्ट किया गया था। व्यावसायिक रूप से खरीदे गए dp20, dp10, और dp6 हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स का उपयोग आकार संदर्भ (सबसे अधिक बैंड) के रूप में किया जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: उपयोग से पहले सभी समाधानों को फ़िल्टर (0.22μm) किया जाना चाहिए।
घोल नुस्खा संयोजन टिप्पणियाँ
जेल/लोअर चैंबर रनिंग बफर (2 एल या 4 एल) को हल करना बोरिक एसिड, मेगावाट 61.83 2L: 12.36 ग्राम; 4L: 24.76 ग्राम वांछित एकाग्रता: 0.1 मीटर
ट्रिस बेस, मेगावाट 124.14 2L: 24.2 ग्राम; 4L: वांछित एकाग्रता: 0.1 मीटर
डिसोडियम एडटा मेगावाट 336.21 या डिहाइड्रेट, मेगावाट 372.36 2L: क्रमशः 6.7 ग्राम या 7.4 ग्राम; 4L 13.4 ग्राम या 14.8 ग्राम, क्रमशः वांछित एकाग्रता: 0.01 मीटर
डिवोनाइज्ड वाटर 2L या 4L पूरी तरह से अभिकर् ता को भंग करने के बाद पीएच को 8.3 तक समायोजित करें
ऊपरी कक्ष चल बफर (1 एल) ग्लाइसिन 93 ग्राम वांछित एकाग्रता: 1 एम
ट्रिस बेस, मेगावाट 124.14 24.2 ग्राम वांछित एकाग्रता: 0.2 मीटर
डिवोनाइज्ड वाटर 1 एल
जेल को हल करना, 22% कुल एक्रिलामाइड (500mL) एक्रिलैमाइड, मेगावाट 71.08 100.1 ग्राम वांछित एकाग्रता: 20.02% w/v
N,N'-मेथिलीन-बीआईएस-एक्रिलैमाइड (बीआईएस, मेगावाट 154.17) 10 ग्राम वांछित एकाग्रता: 2% w/v
शर्करा 75 ग्राम वांछित एकाग्रता: 15% w/v
जेल बफर को हल करना 500 एमएल 500mL की कुल मात्रा में लाओ; बफर कुल के 500mL से कम की आवश्यकता होगी
जेल को हल करना, 15% कुल एक्रिलामाइड (400mL) एक्रिलैमाइड, मेगावाट 71.08 56.3 ग्राम वांछित एकाग्रता: 14.08% w/v
N,N'-मेथिलीन-बीआईएस-एक्रिलैमाइड (बीआईएस, मेगावाट 154.17) 3.7 ग्राम वांछित एकाग्रता: 2% w/v
शर्करा 20.8 ग्राम वांछित एकाग्रता: 15% w/v
जेल बफर को हल करना 400 एमएल 400mL की कुल मात्रा में लाओ; बफर कुल के 400mL से कम की आवश्यकता होगी
स्टैकिंग जेल (100 एमएल) एक्रिलैमाइड, मेगावाट 71.08 4.75 ग्राम वांछित एकाग्रता: 4.75% w/v
N,N'-मेथिलीन-बीआईएस-एक्रिलैमाइड (बीआईएस, मेगावाट 154.17) 0.25 ग्राम वांछित एकाग्रता: 0.25% w/v
जेल बफर को हल करना 100 एमएल 80mL बफर और पूर्ण भंग अभिकर्मक जोड़ें। फिर पीएच को हाइड्रोक्लोरिक एसिड, ड्रॉपवाइज के साथ 76.3 पर समायोजित करें। फिर जेल बफर को हल करने के साथ कुल 100 एमएल की मात्रा में लाएं।
नमूना लोडिंग बफर (500 एमएल) शर्करा 250ग्राम वांछित एकाग्रता: 50% w/v
फिनोल लाल 500मिलीग्राम वांछित एकाग्रता: 1mg/mL
ब्रोमोफेनॉल नीला 250मिलीग्राम वांछित एकाग्रता: 0.5 मिलीग्राम/एमएल
डिवोनाइज्ड वाटर 500mL 500mL की कुल मात्रा में लाओ; कुल पानी के 500mL से कम की आवश्यकता होगी
हेपरिन ने ओलिगोसाचराइड 'सीढ़ी' (2mL प्रत्येक) dp6 0.1 मिलीग्राम नोट: सबसे छोटे बैंड के लिए हेपरिन व्युत्पन्न ओलिगोसैकराइड्स 6 पॉलीमर सबयूनिट (उर्फ डिग्री बहुलकीकरण 6, या डीपी6) का उपयोग करने की सलाह दें, सबसे बड़े बैंड के लिए dp20, और मध्य बैंड के लिए dp10। हालांकि, यदि वांछित हो तो अन्य संयोजनों का उपयोग किया जा सकता है। वांछित एकाग्रता: 0.05 मिलीग्राम/
dp10 0.1 मिलीग्राम
dp20 0.1 मिलीग्राम
डिवोनाइज्ड वाटर 3mL प्रत्येक ओलिगोसैकराइड को 1mL प्रत्येक के साथ अलग-अलग ट्यूबों में भंग करें
नमूना लोडिंग बफर 3mL प्रत्येक ओलिगोसैकराइड समाधान में 1mL (1:1 मिश्रण) जोड़ें

तालिका 1: शुद्ध ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन के पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए आवश्यक समाधान। उपयोग से पहले सभी समाधानों को फ़िल्टर किया जाना चाहिए (0.22 माइक्रोन)।

नोट: उपयोग से पहले सभी समाधानों को फ़िल्टर (0.22μm) किया जाना चाहिए।
घोल नुस्खा संयोजन टिप्पणियाँ
एल्सियन ब्लू स्टेनिंग समाधान (500mL) एल्सियन ब्लू 8जीएक्स पाउडर 2.5 ग्राम वांछित एकाग्रता: 0.5% w/v
2% v/v हिमनदों एसिटिक एसिड 500mL
चांदी का दाग (200 मिलीएल) डिवोनाइज्ड वाटर 192.7 एमएल दाग समाधान ताजा तैयार करें; एक सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
7.6 M सोडियम हाइड्रोक्साइड 2 एमएल बनाने के लिए, 10 एमएल पानी में 3.04 ग्राम सोडियम हाइड्रोक्साइड छर्रों जोड़ें
अमोनियम हाइड्रोक्साइड 3.3 एमएल
4M चांदी नाइट्रेट समाधान 2 एमएल बनाने के लिए, 5 एमएल पानी में 3.397 ग्राम चांदी नाइट्रेट जोड़ें। वर्षा से बचने के लिए सरगर्मी करते समय ड्रॉपवाइज जोड़ें।
समाधान विकसित करना (501 एमएल) डिवोनाइज्ड वाटर 500 एमएल विकासशील समाधान ताजा बनाया जाना चाहिए और 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
2.5% w/v साइट्रिक एसिड 1 एमएल बनाने के लिए, 4 एमएल डिएकोनाइज्ड पानी में 100मिलीग्राम जोड़ें। साइट्रिक एसिड को ताजा बनाया जाना चाहिए।
फ़ॉर्मलडिहाइड (ज़हरीली गैस) 250μL
समाधान बंद करो (500 एमएल) डिवोनाइज्ड वाटर 300 एमएल
हिमनद एसीटिक एसिड 20 एमएल
मेथनॉल 90 एमएल

तालिका 2: पॉलीएक्र्लेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए गए ग्लाइकोसिनोग्लाइकैन के चांदी के धुंधला के लिए आवश्यक समाधान। उपयोग से पहले सभी समाधानों को फ़िल्टर किया जाना चाहिए (0.22 माइक्रोन)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GAGs कई विविध जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । सल्फेटेड जीओजी (जैसे एचएस और सीएस) के प्रमुख कार्यों में से एक लिगांड के साथ बातचीत करना और बांधना है, जो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कार्यों को बदल सकता है। गैग बाइंडिंग एफ़िनिटी का एक महत्वपूर्ण निर्धारक गैग बहुलक श्रृंखला 8 , 9,14की लंबाई है । इस कारण से, शोधकर्ताओं के लिए यह महत्वपूर्ण है कि वे ब्याज के जैविक नमूनों से अलग गैग चेन के आकार को उचित परिशुद्धता के साथ परिभाषित करने में सक्षम हों। व्यावहारिक होने के लिए, इस तकनीक को आम प्रयोगशाला उपकरणों और अभिकर्णों का उपयोग करके प्रदर्शन करने में सक्षम होना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल जैविक नमूनों से GAGs को अलग और शुद्ध करने के लिए, उन्हें पृष्ठ के माध्यम से आकार से अलग करने के लिए, और उन्हें Alcian नीले और चांदी धुंधला तकनीक का उपयोग कर कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । जबकि आकार के अनुसार ग्लाइकोसमिनोगलाइकन को अलग करने के कई तरीके हैं, हमारे दृष्टिकोण में जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में इस तकनीक के अनुप्रयोग के लिए विशिष्ट कई ताकतें हैं। सबसे पहले, 0.5 माइक्रोग्राम का पता लगाने की सीमा के साथ, यह तकनीक ब्याज के GAGs का पता लगाने में अत्यधिक संवेदनशील है। हमारे अनुभव में, यहां तक कि नमूने जिनमें जीएजी (यानी, बाल द्रव नमूनों) की अपेक्षाकृत कम सांद्रता होती है, को इस विधि का उपयोग करके पता लगाने के लिए पर्याप्त गैग से अधिक उपज प्राप्त करनी चाहिए। जबकि अलगाव और बाल तरल पदार्थ के शुद्धिकरण से उपज तकनीक और ब्याज की विशिष्ट झूठ के द्वारा भिंन होगा, यह हमारा अनुभव है कि कच्चे बाल तरल पदार्थ के 10 मिलीएल पर्याप्त एचएस पैदावार के लिए इस तकनीक का उपयोग कर पता लगाने योग्य हो गया है । ठोस अंगों से उपज काफी अधिक है, ऊतक काटा पर निर्भर करता है, लेकिन यह हमारा अनुभव है कि 10 मिलीग्राम का एक प्रारंभिक ठोस नमूना इस तकनीक का उपयोग कर का पता लगाने के लिए पर्याप्त एचएस निकलेगा ।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दागदार पेज जेल की अंतिम इमेजिंग अंत उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के अनुसार भिन्न होगी। जेल की डिजिटल तस्वीरों को कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल प्रलेखन प्रणालियों या एक नियमित वाणिज्यिक कैमरे सहित कई विभिन्न प्रणालियों का उपयोग करके लिया जा सकता है, उपलब्ध उपकरणों और आवश्यक पता लगाने की संवेदनशीलता के आधार पर (आमतौर पर जेल पर लोड किए गए नमूने की मात्रा से तय होता है)। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस जेल को डिजिटल रूप से छवि देने के लिए आवश्यक प्रकाश स्रोत नमूने के घनत्व और धुंधला प्रक्रिया के दौरान आवश्यक विकास समय की मात्रा के आधार पर भिन्न हो सकता है। जैल जो तेजी से विकसित होते हैं और नग्न आंखों को आसानी से दिखाई देने वाले चांदी के दाग वाले बैंड का उत्पादन करते हैं, उन्हें सर्वोत्तम छवियों के लिए यूवी ट्रांसिल्यूमिनेशन की आवश्यकता होगी, क्योंकि अधिकांश प्रकाश अप्रतिम एलेशियन नीले रंग से अवशोषित हो जाएंगे। जैल कि लंबे समय तक विकास के समय की आवश्यकता होती है (जैसे कि नमूना की बहुत कम मात्रा वाले) को सामान्य पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रकाश के साथ या तो एपि-रोशनी या ट्रांसलियूमिनेशन की आवश्यकता होगी, क्योंकि यह चांदी के दाग से सबसे अच्छा अवशोषित होगा।

इस तकनीक की एक और ताकत यह है कि यह विशेष रूप से जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलनीय है, सरल पृष्ठ प्रौद्योगिकी में इसके आधार के कारण, उपकरण और अभिकर् यओं का उपयोग कर जो आमतौर पर उपलब्ध हैं और सस्ते में अधिग्रहीत हैं। जबकि अलग गैग पॉलिमर (जैसे, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस) की लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए अन्य दृष्टिकोण हैं, उन्हें आम तौर पर ज्ञान और उपकरण दोनों की आवश्यकता होती है जो आमतौर पर अधिकांश जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं होते हैं15,16। इस दृष्टिकोण की सादगी और अपेक्षाकृत सस्ती और उपलब्ध प्रकृति की आवश्यकता है इस तकनीक को जीवन विज्ञान शोधकर्ताओं द्वारा आसानी से अनुकूलनीय बनाता है जो उनके दिए गए उपक्षेत्रों के संदर्भ में गैग जीव विज्ञान का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं। इसके अलावा, यह तकनीक जैविक ऊतकों में जीएजी का पता लगाने की बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित तकनीकों के लिए एक आवश्यक पूरक के रूप में कार्य करती है। जबकि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण उच्च संवेदनशीलता के साथ GAGs का पता लगाने और जटिल नमूनों से संरचना में सूक्ष्म मतभेदों को समझने में सक्षम हैं17,प्रौद्योगिकी की प्रकृति के कारण यह आकार के अनुसार गैग पॉलिमर के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं है। इस कारण से, ब्याज के जैविक नमूनों में एचएस पॉलिमर के आकार को विभाजित करने के लिए एक पृष्ठ आधारित दृष्टिकोण आवश्यक है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस पेपर में वर्णित तकनीकों की कई सीमाएं हैं। पहला और सबसे प्रमुख यह है कि एलियन ब्लू स्टेनिंग प्रतिक्रिया के लिए केंद्रीय चार्ज-चार्ज इंटरैक्शन के कारण, यह दृष्टिकोण अत्यधिक सल्फेटेड जीओजी के लिए अत्यधिक चयनात्मक है और केवल अधिक तटस्थ रूप से चार्ज किए गए मोइटीज (उदाहरण के लिए, हायलूरोनिक एसिड18)को कमजोर रूप से दाग देगा। इस प्रकार, इस तकनीक को और अधिक अम्लीय GAG moieties की ओर अपने परिणामों पूर्वाग्रह की संभावना है । इस कारण से, ब्याज के जैविक नमूनों (जैसे, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित तकनीकों) में गैग सामग्री को मापने के लिए पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग प्रयोग किया जाना चाहिए ताकि प्रायोगिक नमूनों में मौजूद GAGs की अधिक पूर्ण तस्वीर प्रदान की जा सके । इसके अलावा, अंतिम उपयोगकर्ताओं के लिए विशेष रूप से हायलुरोनन के आकार को मापने में रुचि रखते हैं, दूसरों ने इसी तरह की पृष्ठ आधारित तकनीकों का वर्णन किया है जो बायोटिनाइलेटेड हायलूरोनिक एसिड बाइंडिंग प्रोटीन (HABP) का लाभ उठाते हैं जो यहां वर्णित बुनियादी तकनीक के अनुकूल हो सकते हैं19।

संक्षेप में, इस लेख में प्रस्तुत तकनीक का उपयोग संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ-साथ इन पॉलीसैकराइड श्रृंखलाओं की मूल लंबाई को मापने के साथ जैविक नमूनों से जीओजी को अलग करने, शुद्ध करने और उनका पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह जानकारी कॉग्नेट लिगामेंट बाध्यकारी आत्मीयता का निर्धारण करने में गैग बहुलक लंबाई के महत्व के कारण गैग-लिगांड इंटरैक्शन के बारे में परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है। इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं, विशेष रूप से इसकी सापेक्ष सादगी और जीवन विज्ञान अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलनशीलता, हालांकि यह नकारात्मक आरोप लगाया GAG moieties की ओर अपने सापेक्ष पूर्वाग्रह से सीमित है । इस खामी के बावजूद, यह तकनीक एक मजबूत उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है जो जांचकर्ताओं को अंग हो्योस्टेसिस और बीमारी में GAGs की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रोत्साहित करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (आरजेएल और ईपीएस) द्वारा वित्त पोषित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge thermoFisher Scientific 13-100-675 Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP170-100 Electrophoresis grade
Actinase E Sigma Aldrich P5147 Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid) thermoFisher Scientific AC400460100
Ammonium acetate (solid) thermoFisher Scientific A639-500 Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid) thermoFisher Scientific A669S-500 certified ACS
Ammonium persulfate (solid) thermoFisher Scientific BP179-25 electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System ThermoFisher Scientific 10-451-217PKG Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid) thermoFisher Scientific A73-500 Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid) thermoFisher Scientific B392-5
Calcium acetate (solid) ThermoFisher Scientific 18-609-432 Molecular biology grade
Calcium chloride (solid) ThermoFisher Scientific AC349610250 Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) ThermoFisher Scientific 28299
Chondroitinase ABC Sigma Aldrich C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) Bio-Rad 3459901 Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) Bio-Rad 1656019 any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid) thermoFisher Scientific AC610931000 certified ACS
EDTA disodium salt (solid) thermoFisher Scientific 02-002-786 Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid) thermoFisher Scientific A35-500 Certified ACS
Glycine (solid) thermoFisher Scientific G48-500 Electrophoresis grade
Heparanase I/III Sigma Aldrich H3917 From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10) galen scientific HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6) Galen scientific HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20) galen scientific HO20
Hydrochloric acid (liquid) thermoFisher Scientific A466-250
Lyophilizer Labconco 7752020 Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid) thermoFisher Scientific A412-500 Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad 170-8170 Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP171-25 Electrophoresis grade
Phenol red (solid) thermoFisher Scientific P74-10 Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column Vivapure VS-IX01QH24 Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid) thermoFisher Scientific S181-25 certified ACS
Sodium Acetate (solid) ThermoFisher Scientific S210-500 Molecular biology grade
Sodium chloride (solid) thermoFisher Scientific S271-500 Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid) thermoFisher Scientific S392-212
Sucrose (solid) thermoFisher Scientific BP220-1 Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) thermoFisher Scientific BP150-20 Electrophoresis grade
Tris base (solid) thermoFisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff Amicon UFC500324 Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid) ThermoFisher Scientific 29700
Vacufuge Plus Eppendorf 22820001 Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume thermoFisher Scientific 569-0020 Alternative volumes and filter materials acceptable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Tags

जीव विज्ञान अंक 168
पॉलीएक्रेलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सिल्वर स्टेनिंग द्वारा ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन का पता लगाना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima,… More

LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima, K., McMurtry, S. A., Linhardt, R. J., Schmidt, E. P. Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (168), e62319, doi:10.3791/62319 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter