Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

Resumo

Demonstramos como usar um novo instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas para estimar a distribuição de tamanho e concentração total de partículas de vesículas extracelulares isoladas do tecido adiposo de camundongos e plasma humano.

Resumo

Os papéis fisiológicos e fisiofisiológicos de vesículas extracelulares (EVs) tornaram-se cada vez mais reconhecidos, tornando o campo EV uma área de pesquisa em rápida evolução. Existem muitos métodos diferentes para o isolamento do EV, cada um com vantagens e desvantagens distintas que afetam o rendimento a jusante e a pureza dos EVs. Assim, caracterizar a preparação de EV isolada de uma determinada fonte por um método escolhido é importante para a interpretação dos resultados a jusante e comparação dos resultados entre laboratórios. Existem vários métodos para determinar o tamanho e a quantidade de EVs, que podem ser alterados por estados da doença ou em resposta a condições externas. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é uma das tecnologias proeminentes utilizadas para análise de alto rendimento de EVs individuais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para quantificação e determinação de tamanho de EVs isolados do tecido adiposo do rato e plasma humano usando uma tecnologia inovadora para a NTA representando grandes avanços no campo. Os resultados demonstram que este método pode fornecer dados de concentração de partículas e tamanho totais reprodutíveis e válidos para EVs isolados de diferentes fontes usando diferentes métodos, conforme confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão. A adaptação deste instrumento para a NTA abordará a necessidade de padronização nos métodos NTA para aumentar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa de EV.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são pequenas (0,03-2 μm) de vesículas ligadas à membrana secretadas por quase todos os tipos de células¹. Eles são frequentemente referidos como "exossomos", "microvesículos" ou "corpos apoptóticos" dependendo de seu mecanismo de liberação e tamanho². Embora inicialmente se pensasse que os EVs eram simplesmente um meio de eliminar resíduos da célula para manter a homeostase³, agora sabemos que eles também podem participar da comunicação intercelular via transferência de material molecular - incluindo DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipídios e proteínas

Protocolo

Todos os trabalhos com essas amostras foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e do Conselho de Revisão Institucional. Uma visão geral esquemática do método NTA é retratada na Figura 2.

Figura 2: Visão geral do método NTA utilizando o instrumento de rastreamento de partículas. A amostra é preparada e inserida no instrumento. O software NTA é aberto, os ....

Resultados

Antes desta demonstração, a calibração do instrumento foi testada pela primeira vez para garantir a validade dos dados adquiridos, medindo a distribuição de tamanho das normas de contas de poliestireno. Testamos a distribuição de tamanho de contas de 100 nm e 400 nm usando os parâmetros de gravação padrão e as configurações de processamento recomendadas neste protocolo(Figura 8).

Para o padrão de contas de poliestireno de 100 nm, foi medida uma concentração de 4,2.......

Discussão

Aqui, demonstramos um protocolo para nta de EVs medir a distribuição de tamanho de uma ampla gama de tamanhos de partículas simultaneamente e medir a concentração total de EV em uma amostra de polidisperse. Neste estudo, o tecido adiposo do rato perigonadal e o plasma humano foram usados como fonte de EVs. No entanto, EVs isolados de outros tecidos ou fluidos biológicos, como soro, urina, saliva, leite materno, fluido amniótico e supernanato de cultura celular também podem ser usados para NTA. As medições das normas de c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	Para diluir amostras
100 nm talão padrão	Thermo Scientific	3100A	Para testar a calibração ViewSizer 3000
400 nm talão padrão	Thermo Scientific	3400A	Para testar a calibração ViewSizer 3000
Unidade de filtro centrífugo	Amicon	UFC901024	Para filtrar PBS diluente
Tubos de coleta, 2 mL	Qiagen	19201	Para isolamento de vesículas extracelulares de plasma humano
Espanador de ar comprimido	DustOff	DPSJB-12	Para limpar cubetas
Inserção de cubeta	HORIBA	Scientific-Fornecido	com a compra do ViewSizer 3000
Gabarito de cubeta	HORIBA	Scientific-Para	alinhar a barra de agitação magnética ao colocar inserções dentro da cubeta; Fornecido com a compra do ViewSizer 3000
Água desionizada	VWR	02-0201-1000	Para limpar cubetas
Computador de mesa com monitor, teclado, mouse e todos os cabos necessários	Fornecido		pela Dell com a compra do ViewSizer 3000
Etanol (70-100%)	Millipore Sigma-Para		limpar cubetas
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	Para isolamento de vesículas extracelulares de plasma humano
Frascos de cintilação de vidro com tampas	Thermo Scientific	B780020	Para limpar cubetasFerramenta
"Gancho"	Excelta-Fornecido		com a compra de ViewSizer 3000
Pano de microfibra sem fiapos	Texwipe	TX629	Para limpar cubetas e cobrir a superfície de trabalho
Tubos de microcentrífuga, 2 mL	Eppendorf	22363344	Para isolamento de vesículas extracelulares de plasma humano
Barra de agitação	Sp Scienceware	F37119-0005
Cubeta de quartzo Suprasil com tampa	Agilent Technologies	AG1000-0544	Inicialmente fornecido com a compra do ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	-	instrumento de rastreamento de nanopartículas