Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

Summary

Demonstramos como usar um novo instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas para estimar a distribuição de tamanho e concentração total de partículas de vesículas extracelulares isoladas do tecido adiposo de camundongos e plasma humano.

Abstract

Os papéis fisiológicos e fisiofisiológicos de vesículas extracelulares (EVs) tornaram-se cada vez mais reconhecidos, tornando o campo EV uma área de pesquisa em rápida evolução. Existem muitos métodos diferentes para o isolamento do EV, cada um com vantagens e desvantagens distintas que afetam o rendimento a jusante e a pureza dos EVs. Assim, caracterizar a preparação de EV isolada de uma determinada fonte por um método escolhido é importante para a interpretação dos resultados a jusante e comparação dos resultados entre laboratórios. Existem vários métodos para determinar o tamanho e a quantidade de EVs, que podem ser alterados por estados da doença ou em resposta a condições externas. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é uma das tecnologias proeminentes utilizadas para análise de alto rendimento de EVs individuais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para quantificação e determinação de tamanho de EVs isolados do tecido adiposo do rato e plasma humano usando uma tecnologia inovadora para a NTA representando grandes avanços no campo. Os resultados demonstram que este método pode fornecer dados de concentração de partículas e tamanho totais reprodutíveis e válidos para EVs isolados de diferentes fontes usando diferentes métodos, conforme confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão. A adaptação deste instrumento para a NTA abordará a necessidade de padronização nos métodos NTA para aumentar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa de EV.

Introduction

As vesículas extracelulares (EVs) são pequenas (0,03-2 μm) de vesículas ligadas à membrana secretadas por quase todos os tipos de células¹. Eles são frequentemente referidos como "exossomos", "microvesículos" ou "corpos apoptóticos" dependendo de seu mecanismo de liberação e tamanho². Embora inicialmente se pensasse que os EVs eram simplesmente um meio de eliminar resíduos da célula para manter a homeostase³, agora sabemos que eles também podem participar da comunicação intercelular via transferência de material molecular - incluindo DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipídios e proteínas^4,5 - e que eles são importantes reguladores da fisiologia normal, bem como processos patológicos^{1, 5,6,7,8}.

Existem muitos métodos diferentes para isolar e quantificar EVs, que foram descritos em outros lugares^9,10,11,12. O protocolo de isolamento usado, bem como a fonte de EVs, podem impactar muito o rendimento e a pureza do EV. Mesmo a centrifugação diferencial, considerada por muito tempo a abordagem "padrão-ouro" para o isolamento exóssomo, pode estar sujeita a variabilidade substancial, impactando posteriormente a população de EV obtida e análises a jusante¹³. Assim, as diferentes metodologias de isolamento e quantificação do EV dificultam a comparação, reprodução e interpretação dos resultados dos experimentos relatados na literatura¹⁴. Além disso, a liberação de EV pode ser regulada por condições celulares ou vários fatores externos. Tem sido sugerido que os EVs desempenham um papel na manutenção da homeostase celular protegendo as células contra o estresse intracelular^15,como vários estudos têm mostrado que o estresse celular estimula a secreção de EV. Por exemplo, o aumento da liberação de EV foi relatado após exposição celular à hipóxia, estresse órticulo endoplasmático, estresse oxidativo, estresse mecânico, extrato de fumaça de cigarro e poluição atmosférica de material particulado^{16,17,18,19,20,21,22}. A versão eV também foi mostrada como modificada in vivo; camundongos submetidos a uma dieta rica em gordura ou jejum por dezesseis horas liberaram mais EVs adipócitos²³. Para investigar se um tratamento ou condição específico altera a liberação do EV, o número de EVs deve ser determinado com precisão. A avaliação da distribuição do tamanho do EV também pode indicar a origem subcelular predominante dos EVs (por exemplo, fusão de endosomes/corpos multivesiculares tardios com a membrana plasmática versus brotação da membrana plasmática)²⁴. Assim, há necessidade de métodos robustos para medir com precisão a concentração total e a distribuição de tamanho da preparação de EV que está sendo estudada.

Um método rápido e altamente sensível para a visualização e caracterização de EVs na solução é a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Uma explicação detalhada dos princípios deste método e a comparação com métodos alternativos de avaliação do tamanho e concentração de EV foram descritas anteriormente^25,26,27,28. Resumidamente, durante a medição da NTA, os EVs são visualizados pela luz espalhada quando são irradiados com um raio laser. A luz dispersa é focada por um microscópio em uma câmera que registra o movimento das partículas. O software NTA rastreia o movimento térmico aleatório de cada partícula, conhecido como movimento browniano, para determinar o coeficiente de difusão que é usado para calcular o tamanho de cada partícula usando a equação de Stokes-Einstein. A NTA foi aplicada pela primeira vez à medição de EVs em uma amostra biológica em 2011²⁵. Até recentemente, havia apenas duas empresas tradicionais oferecendo instrumentos NTA comerciais²⁹ até a introdução do ViewSizer 3000 (doravante chamado de instrumento de rastreamento de partículas) que usa uma combinação de novas soluções de hardware e software para superar limitações significativas de outras técnicas NTA.

O instrumento de rastreamento de partículas caracteriza nanopartículas em amostras líquidas analisando seu movimento browniano e caracteriza partículas maiores do tamanho de micron, analisando a fixação gravitacional. O sistema óptico único deste instrumento, que inclui iluminação multiespectral com três fontes de luz laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), permite que os pesquisadores analisem uma ampla gama de tamanhos de partículas (por exemplo, exosósmos, microvesculas) simultaneamente. Um esquema da configuração do instrumento é mostrado na Figura 1.

Aqui, demonstramos como realizar a distribuição de tamanho de partículas e medições de concentração de mouses isolados e EVs humanos usando um novo instrumento NTA.

Figura 1: Sistema óptico do instrumento de rastreamento de partículas. O instrumento NTA ilumina partículas usando três lasers com os seguintes comprimentos de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. A gravação de vídeo da luz dispersa de partículas individuais é detectada e rastreada por uma câmera de vídeo digital orientada a 90° do cuvette. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os trabalhos com essas amostras foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e do Conselho de Revisão Institucional. Uma visão geral esquemática do método NTA é retratada na Figura 2.

Figura 2: Visão geral do método NTA utilizando o instrumento de rastreamento de partículas. A amostra é preparada e inserida no instrumento. O software NTA é aberto, os parâmetros de gravação são ajustados e a amostra é focada. Em seguida, os dados são gravados, processados e exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Isolamento vesícula extracelular

NOTA: Os EVs de tecido adiposo do mouse perigonadal foram isolados como descrito anteriormente²³. Os EVs de plasma foram isolados a partir de 1 mL de plasma humano usando o seguinte protocolo:

1. Colete o plasma e a centrífuga a 3.000 x g por 15 minutos para remover detritos celulares. Transfira o supernatante para um novo tubo.
   NOTA: Se os detritos adicionais permanecerem detectáveis, centrifugar o supernatante por mais 10 min a 12.000 x g e transferir o supernatante para um novo tubo.
2. Adicione 67 μL do reagente de isolamento exososome por 250 μL de plasma. Misture bem invertendo ou mexendo o tubo.
3. Incubar no gelo ereto por 30 minutos.
4. Centrifugar a mistura de reságio/plasma de isolamento exososome a 3.000 x g por 10 min a 4 °C.
   NOTA: A centrifugação pode ser realizada à temperatura ambiente ou 4 °C com resultados semelhantes, mas é preferível 4 °C. Após a centrifugação, os EVs podem aparecer como uma pelota bege ou branca na parte inferior do tubo.
5. Aspire cuidadosamente o supernante. Gire qualquer solução de isolamento exossomo residual e remova todos os traços de fluido por aspiração, tomando muito cuidado para não perturbar os EVs precipitados na pelota.
6. Resuspense a pelota em 200 μL de Buffer B (fornecido pelo fabricante). Meça e regisse a concentração proteica da amostra (para a etapa 2.8) utilizando um espectógrafo, fluorômetro, ensaio de Bradford ou outro método preferido.

2. Purificação de EVs isolados

1. Adicione 200 μL de Buffer A (fornecido pelo fabricante) aos EVs re-suspensos.
2. Tire a coluna de purificação (fornecida), solte a tampa do parafuso e solte o fechamento inferior. Coloque a coluna em um tubo de coleta.
   NOTA: Guarde o fechamento inferior para as etapas 2.7-2.9.
3. Centrifugar a 1.000 x g por 30 s para remover o buffer de armazenamento.
4. Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
5. Para lavar a coluna, remova a tampa e aplique 500 μL de Buffer B em cima da resina e centrífuga a 1.000 x g para 30 s. Descarte o fluxo através. Guarde a tampa para as etapas 2.7-2.9.
6. Repita as etapas 2.4-2.5 mais uma vez para lavar a coluna.
7. Conecte a parte inferior da coluna com o fechamento inferior (a partir da etapa 2.2). Aplique 100 μL de Tampão B em cima da resina para prepará-la para o carregamento da amostra.
8. Adicione todo o conteúdo da etapa 1.6 (ou até o volume equivalente a 4 mg de proteína total) à resina. Coloque a tampa do parafuso na parte superior da coluna.
9. Misture à temperatura ambiente em um agitador rotativo por não mais do que 5 minutos.

3. Elução da amostra

1. Solte a tampa do parafuso e remova o fechamento inferior e transfira imediatamente para um tubo de microcentrifuuagem de 2 mL.
   NOTA: A amostra começará a eluto assim que o fechamento inferior for removido. Certifique-se de que os tubos de microcentrifuuuge de 2 mL estejam prontos para receber elunato para minimizar a perda de amostras.
2. Centrifugar a 1.000 x g por 30 s para obter EVs purificados. Descarte a coluna.

4. Preparação da amostra para análise de rastreamento de nanopartículas

1. Use um material sem fiapos como um pano de microfibra para cobrir o espaço de trabalho e evitar que as fibras entrem em cuvetas.
2. Usando luvas, coloque a cuvette no gabarito de cuvette magnético, em seguida, coloque a barra de agitação no cuvette. Manuseie sempre as cuvetas com luvas para evitar que impressões digitais e manchas apareçam na superfície do cuvette.
3. Use a ferramenta de gancho para colocar a inserção na cuvette, conforme descrito na Figura 3. É importante observar a orientação da inserção para depois (Passo 5.4).

Figura 3: Orientação adequada da inserção dentro da cuvette de quartzo. O "entalhe" da inserção deve ser visível na parte frontal da cuvette. Isso deve ser inserido no instrumento voltado para a câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Usando uma pipeta, adicione lentamente 400-500 μL da amostra diluída ou diluída à temperatura ambiente até o cuvette através do orifício na pastilha. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar. Evite introduzir bolhas de ar.
   1. Primeiro prepare uma cuvette carregada com o diluído escolhido (em branco) para medir a concentração de partículas do diluído. Isso deve ser feito antes de medir a amostra para que a concentração de fundo da amostra possa ser corrigida.
      NOTA: Um bom espaço em branco (salina tamponada de fosfato [PBS] neste caso) terá uma concentração <9 x 10⁶ (dependendo do diluente) e exibirá 1-10 partículas por tela na visão ao vivo(Figura 4). Recomenda-se que a concentração real de partículas amostrais seja pelo menos 3 vezes a concentração de fundo.
   2. Opcionalmente, antes de registrar a amostra prime a cuvette com 400-500 μL da amostra diluída ou diluída antes de medir. Para isso, carregue 400-500 μL da amostra diluída no cuvette, descarte a solução e, em seguida, adicione 400-500 μL a mais da amostra para a medição. Isso pode ajudar na lavagem de resíduos dentro da cuvette.

Figura 4: Exibição de transmissão ao vivo representativa de um diluído dentro da faixa de concentração adequada de um branco. Prepara-se EV diluído em PBS filtrado (0,02 μm ou 3 kDa, preferencial). Um bom branco exibirá ~1-10 partículas por tela na visualização ao vivo, produzindo uma concentração dentro da faixa 10⁵-10⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Tampe o cuvette e verifique se há bolhas. Bata bolhas, se necessário. Use um pano livre de fiapos para limpar as faces externas da cuvette.

5. Procedimento de inicialização do instrumento de rastreamento de partículas

1. Ligue a estação de trabalho e o instrumento do computador, aguarde alguns minutos antes de executar a primeira amostra e inicie o programa clicando no ícone do software. Quando solicitado, clique em NTA na tela para realizar análise de rastreamento de nanopartículas. Comece na guia Gravação e clique nas várias guias de software (Gravar, Processar, Plot) para alternar entre elas ao longo do protocolo. Grave a amostra (preparação diluída ou EV) primeiro, depois processe as gravações e, finalmente, plote os resultados.
2. Siga as instruções na tela para preencher todas as informações necessárias sobre a amostra. Verifique se todos os campos necessários estão concluídos e precisos, ou seja, nome da amostra, Descrição, Preparação da amostra, fator de diluição [1000], temperatura-alvo (Definido para 22 °C) e Diluente: Selecione diluente do menu suspenso e use PBS como diluente para EVs. A seleção do PBS no menu suspenso irá preencher automaticamente a salinidade para 9%. Essas informações são necessárias para determinar a viscosidade dinâmica do líquido.
   NOTA: Pode levar até 3 minutos para que a temperatura se equilibre dentro da cuvette mesmo que a sonda já mostre temperatura desejada (ou seja, ponto verde se torna estável). As leituras das amostras podem variar consideravelmente se a temperatura-alvo não for definida, pois as diferenças de temperatura da amostra podem alterar muito o movimento browniano das partículas.
3. Abra a tampa do instrumento e remova a tampa protetora que cobre onde a cuvette será colocada.
   ATENÇÃO: O instrumento de rastreamento de partículas é certificado como um produto laser classe 1 (21 CFR Ch. Eu parte 1040), contendo lasers que podem ser perigosos e podem causar ferimentos graves, como queimaduras e/ou danos permanentes à visão. Para evitar acidentes ou ferimentos, não remova a tampa do instrumento desparafusando os parafusos do lado. Observe que durante a operação, os raios laser estão completamente fechados, não representando nenhuma ameaça aos usuários. Além disso, um bloqueio de segurança magnética é incorporado no suporte de amostra do instrumento para evitar que os lasers operem quando a tampa do suporte da amostra for removida.
4. Coloque o cuvette (a partir da etapa 4.3) dentro do instrumento na orientação correta (ver Figura 5). Substitua a tampa sobre a tampa e feche a tampa do instrumento. Sempre opere o instrumento com a tampa no lugar sobre o suporte da amostra. Não desabilitar ou tentar contornar o recurso de bloqueio de segurança.

Figura 5: Orientação adequada da cuvette dentro do instrumento de rastreamento de partículas. A face do cuvette (com o "entalhe" da inserção visível) deve ficar de frente para a câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Ligue a câmera clicando na seta acima do Streaming.
6. Clique na seta chevron para expandir as configurações do Registro. Defina energia Gain e Laser para valores apropriados para a aplicação. Consulte Tabela 1 (e Figura Suplementar 1) para parâmetros utilizados para NTA de EVs pequenos (100 nm).
   NOTA: Essas configurações avançadas acessadas clicando na seta chevron podem ser protegidas por senha. Use as mesmas configurações para gravação e processamento para o diluente (em branco) como os utilizados para as amostras subsequentes.
7. Ajuste o foco até que as partículas estejam devidamente focadas. O foco deve ser feito em partículas relativamente pequenas(Figura 6). Para quantificação de EV pequena (consistente com exosósmos), recomenda-se as seguintes configurações de gravação: Taxa de quadros: 30 fps, Exposição: 15 ms, Tempo de agitação: 5 s, Tempo de espera: 3 s, laser power - Azul: 210 mW, Verde: 12 mW, Vermelho: 8 mW, Quadros por vídeo: 300 quadros e Ganho: 30 dB.
   NOTA: O usuário pode aumentar o Zoom para 1x e/ou aumentar o Ganho para ajudar no foco. Lembre-se de reefinar esses parâmetros para valores recomendados antes de gravar vídeos.

Figura 6: Visualizações de transmissão ao vivo representativas mostrando foco em partículas. (A) Uma visão de transmissão ao vivo de partículas não em foco. As partículas têm halo semelhante a brilho ou parecem embaçadas. Ajuste o foco. (B) Um exemplo de visualização ao vivo das partículas em foco adequado. As menores partículas estão em foco. Comece a gravar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Realize uma verificação de qualidade visual para garantir que a amostra esteja devidamente diluída. Se a amostra estiver muito concentrada, remova o cuvette do instrumento e dilua a amostra sequencialmente. Repita até que a amostra esteja devidamente diluída antes de prosseguir para a Etapa 6.
   NOTA: Não dilua demais a amostra! Sempre faça diluições sequencialmente. O branco ideal exibirá apenas algumas partículas na tela (1-4) como mostrado na Figura 4. Em relação às amostras de EV, uma amostra devidamente diluída terá cerca de 20-100 partículas visíveis na tela, sem imagens semelhantes a brilho ou nubladas no fundo (ver Figura 7 como exemplo). Isso deve resultar em uma concentração de partículas ideal na faixa de 5 x 10⁶ a 2 x 10⁸ partículas por mL (não ajuste para fator de diluição).

Figura 7: Visualizações representativas de transmissão ao vivo representando diferentes diluições de partículas. (A) Um exemplo de visualização de transmissão ao vivo de uma amostra muito concentrada. Gravar uma amostra muito concentrada produzirá resultados imprecisos. (B) Uma visão de transmissão ao vivo de uma amostra devidamente diluída. Há 60-100 partículas visíveis na tela e o registro resulta em uma concentração bruta de 5 x 10⁶- 2 x 10⁸ partículas/mL. (C) Uma visão de transmissão ao vivo de uma amostra muito diluída. Se uma amostra for tão diluída, não haverá partículas suficientes rastreadas, diminuindo o tamanho da amostra e, portanto, os resultados serão estatisticamente inválidos. Neste caso, recomenda-se aumentar o número de vídeos gravados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Aquisição de dados de vídeo

1. (Opcional) Defina a configuração de zoom em 0,5x para salvar a largura de banda e evitar quadros perdidos.
2. Comece a gravar os vídeos clicando em Registro (ver Tabela 1 para parâmetros de gravação recomendados).
   NOTA: Por padrão, o instrumento irá agitar a amostra por 5 s, esperar por 3 s e, em seguida, gravar por 10 s antes de repetir este processo. O tempo típico de medição para 50 vídeos é de ~15 minutos para gravar e ~13 min para processar.
3. Não toque no instrumento durante a gravação de vídeos. Certifique-se de que a superfície do banco de laboratório não está vibrando.
   NOTA: É preferível que o instrumento esteja colocado em uma plataforma ou tabela anti-vibração para reduzir quaisquer distúrbios de vibração de equipamentos próximos que interferirão na determinação do movimento das nanopartículas. Evite operar centrífugas, misturadores de vórtices ou outros dispositivos potenciais geradores de vibração no mesmo banco que o instrumento de rastreamento de partículas. Vibrações são facilmente visíveis na tela como alongamento de partículas geralmente redondas. Se exposto a vibrações vigorosas, o instrumento pode exigir realinhamento de elementos ópticos. O instrumento não foi projetado para ser atendido ou calibrado pelo cliente; entrar em contato com o fabricante para manutenção, serviço e calibração.
4. Observe qualquer vídeo gravado que tenha partículas muito grandes visíveis como grandes bolhas brancas irregulares. Remova esses vídeos do processamento na Etapa 7.3.

7. Processar dados adquiridos

1. Quando um prompt aparecer afirmando que os vídeos foram gravados, clique em OK para concluir a gravação. Em seguida, selecione a guia Processo.
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui. O processamento dos dados adquiridos pode ser reiniciado posteriormente, movendo-se diretamente para a guia Process após a abertura do software do instrumento de rastreamento de partículas e especificando o diretório onde os vídeos gravados são salvos.
2. Ao analisar os EVs, verifique a caixa Desativar a substituição de detecção automática e defina o Diâmetro do Recurso para 30. Clique em Processo. (Consulte a Tabela 2 para as configurações de processamento e a Figura Suplementar 2 para exibição de processamento). Um gráfico de distribuição ao vivo será exibido para que o usuário possa visualizar o processamento em tempo real.
   1. Para exosósmos, processe com limiar de detecção definido para a amostra de polidisperse padrão. Processe os dados com o Manual do Limiar de Detecção definido para 0,8 em vez de um limiar padrão de 0,99 apenas para soluções com diferenças muito grandes no tamanho das partículas.
3. Se algum vídeo tivesse partículas visivelmente muito grandes visíveis (veja o Passo 6.4), navegue até o diretório de vídeos gravados e remova o vídeo problemático. Depois de editar a lista de arquivos de vídeo, altere o número de vídeos gravados em outros logs mantidos pelo usuário.
4. Após o processamento ser concluído, clique em OK. Em seguida, selecione a guia Plot. Para EVs, exiba o gráfico principal como LogBinSilica.
   NOTA: Aqui na guia Plot, o usuário pode personalizar outras características do gráfico, como definir a faixa do eixo x (diâmetro de partículas, nm) para definir a área de integração para a figura produzida.

8. Exibir e interpretar resultados

1. Para criar um relatório PDF, clique no botão Relatar. A medição está agora completa, e os resultados podem ser visualizados.
   NOTA: Lembre-se de gravar e processar o em branco primeiro para que a concentração de fundo das amostras subsequentes possa ser corrigida. Se este passo for esquecido, o branco pode ser registrado após amostras e a concentração de partículas da amostra corrigida manualmente.
2. Examine o relatório PDF que exibe o tamanho médio, mediano e de modo, bem como a concentração ajustada para o fator de diluição e corrigida subtraindo a concentração de partículas do diluído. A largura de distribuição (desvio padrão) também é mostrada.
   NOTA: Há muito poucas aplicações em que um único valor é apropriado e representativo. Assim, recomenda-se descrever toda a distribuição de tamanho e relatar a largura da distribuição para qualquer amostra analisada (como mostrado na Tabela 3, por exemplo).
3. Registre as seguintes configurações de instrumentos usadas para gerar os dados que devem ser indicados ao relatar resultados: Diluente, laser de potência de cada laser [mW], Exposição [ms], Gain [dB], Taxa de quadros [fps], Quadros por vídeo, Número de vídeos gravados, Configuração de processamento (por exemplo, LogBinSilica), faixa de integração [min nm, max nm] (recomendado para definir min a 50 nm) e Número de partículas rastreadas (desejável analisar pelo menos ~150 partículas por vídeo; mínimo de 3.750 faixas totais por amostra recomendado para evitar picos artefatos na distribuição do tamanho das partículas e gerar dados estatisticamente significativos).

9. Limpeza das cuvetas

1. Limpe as cuvetas manualmente entre as amostras. Primeiro, esvazie o cuvette.
   NOTA: A amostra pode ser recuperada da cuvette e salva ou descartada.
2. Uma vez que a cuvette esteja vazia, limpe a cuvette enxaguando-a 10-15 vezes com água desionizada (DI). Em seguida, enxágue 3 vezes com etanol (70-100%). Ao fazer isso, certifique-se de encher completamente a cuvette com solvente.
3. Seque o lado de fora da cuvette com um pano de microfibra sem fiapos. Evite manchas nas superfícies. O ar seque o interior da cuvette ou seque usando um espanador de ar comprimido.
   NOTA: Apenas o papel de limpeza da lente ou o pano de microfibra livre de fiapos devem ser usados para limpar as superfícies ópticas da cuvette, uma vez que a maioria dos produtos de papel contém pequenas fibras de madeira que podem arranhar ou danificar a superfície do cuvette.
4. Prepare dois frascos de cintilação de vidro: um cheio com 70-100% de etanol e outro com água DI. Enxágüe as pastilhas e mexa as barras no etanol primeiro (depois água DI) colocando a barra de inserção/mexida no frasco de cintilação apropriado e sacudindo o frasco vigorosamente. Seque as pastilhas e mexa as barras usando panos sem fiapos ou espanadores de ar comprimidos.
   NOTA: O cuvette e a inserção também podem ser limpos usando um banho de água sônico. Para isso, primeiro certifique-se de que a unidade de sonicação contenha água suficiente (pelo menos 5 cm de profundidade). Em seguida, coloque o cuvette e insira dentro de um copo de vidro (50 mL ou maior), encha o béquer com álcool ao mesmo nível do banho de água, coloque o béquer na água e ligue a energia. Sonicate por um máximo de 5 minutos de cada vez, permitindo que a máquina descanse >5 min entre cada rajada de 5 minutos se forem necessários tempos mais longos.
5. Quando terminar, coloque imediatamente todos os componentes limpos e secos para armazenamento.

Results

Antes desta demonstração, a calibração do instrumento foi testada pela primeira vez para garantir a validade dos dados adquiridos, medindo a distribuição de tamanho das normas de contas de poliestireno. Testamos a distribuição de tamanho de contas de 100 nm e 400 nm usando os parâmetros de gravação padrão e as configurações de processamento recomendadas neste protocolo(Figura 8).

Para o padrão de contas de poliestireno de 100 nm, foi medida uma concentração de 4,2...

Discussion

Aqui, demonstramos um protocolo para nta de EVs medir a distribuição de tamanho de uma ampla gama de tamanhos de partículas simultaneamente e medir a concentração total de EV em uma amostra de polidisperse. Neste estudo, o tecido adiposo do rato perigonadal e o plasma humano foram usados como fonte de EVs. No entanto, EVs isolados de outros tecidos ou fluidos biológicos, como soro, urina, saliva, leite materno, fluido amniótico e supernanato de cultura celular também podem ser usados para NTA. As medições das normas de c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	Para diluir amostras
100 nm talão padrão	Thermo Scientific	3100A	Para testar a calibração ViewSizer 3000
400 nm talão padrão	Thermo Scientific	3400A	Para testar a calibração ViewSizer 3000
Unidade de filtro centrífugo	Amicon	UFC901024	Para filtrar PBS diluente
Tubos de coleta, 2 mL	Qiagen	19201	Para isolamento de vesículas extracelulares de plasma humano
Espanador de ar comprimido	DustOff	DPSJB-12	Para limpar cubetas
Inserção de cubeta	HORIBA	Scientific-Fornecido	com a compra do ViewSizer 3000
Gabarito de cubeta	HORIBA	Scientific-Para	alinhar a barra de agitação magnética ao colocar inserções dentro da cubeta; Fornecido com a compra do ViewSizer 3000
Água desionizada	VWR	02-0201-1000	Para limpar cubetas
Computador de mesa com monitor, teclado, mouse e todos os cabos necessários	Fornecido		pela Dell com a compra do ViewSizer 3000
Etanol (70-100%)	Millipore Sigma-Para		limpar cubetas
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	Para isolamento de vesículas extracelulares de plasma humano
Frascos de cintilação de vidro com tampas	Thermo Scientific	B780020	Para limpar cubetasFerramenta
"Gancho"	Excelta-Fornecido		com a compra de ViewSizer 3000
Pano de microfibra sem fiapos	Texwipe	TX629	Para limpar cubetas e cobrir a superfície de trabalho
Tubos de microcentrífuga, 2 mL	Eppendorf	22363344	Para isolamento de vesículas extracelulares de plasma humano
Barra de agitação	Sp Scienceware	F37119-0005
Cubeta de quartzo Suprasil com tampa	Agilent Technologies	AG1000-0544	Inicialmente fornecido com a compra do ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	-	instrumento de rastreamento de nanopartículas