O artigo descreve a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes induzidas a organoides pulmonares inteiros tridimensionais contendo células pulmonares epiteliais proximais e disais, juntamente com mesenchyme.
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Artigo de método
Geração de organoides pulmonares 3D inteiros de células-tronco pluripotentes induzidas para modelagem da biologia e doença do desenvolvimento pulmonar
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento pulmonar humano e a doença têm sido difíceis de estudar devido à falta de sistemas de modelos in vitro biologicamente relevantes. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) podem ser diferenciadas em organoides pulmonares multicelulares 3D, feitos de populações epiteliais e células mesenquimais. Recapitulamos pistas de desenvolvimento embrionário introduzindo temporalmente uma variedade de fatores de crescimento e pequenas moléculas para gerar eficientemente o endoderme definitivo, o endoderme anterior e, posteriormente, as células progenitoras pulmonares. Essas células são então incorporadas no meio de matriz de membrana de fator de crescimento (GFR)-porão, permitindo que elas se desenvolvam espontaneamente em organoides pulmonares 3D em resposta a fatores de crescimento externos. Estes organoides pulmonares inteiros (WLO) passam por estágios iniciais de desenvolvimento pulmonar, incluindo morfogênese ramificada e maturação após exposição à dexametasona, AMP cíclico e isobutylxanthine. Os WLOs possuem células epiteliais das vias aéreas expressando os marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (clube) e MUC5AC (cálice), bem como células epiteliais alveolares expressando HOPX (tipo alveolar I) e SP-C (alveolar tipo II). Células mesenquimais também estão presentes, incluindo actina muscular lisa (SMA), e receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas A (PDGFRα). Os WLOs derivados do iPSC podem ser mantidos em condições de cultura 3D por muitos meses e podem ser classificados para marcadores de superfície para purificar uma população celular específica. Os WLOs derivados do iPSC também podem ser utilizados para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, incluindo a sinalização entre o epitélio pulmonar e o mesenquimme, para modelar mutações genéticas na função e desenvolvimento das células pulmonares humanas, e para determinar a citotoxicidade dos agentes infecciosos.
Introdução
O pulmão é um órgão complicado, heterogêneo e dinâmico que se desenvolve em seis estágios distintos - embrionário, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar e maturação microvascular1,2. As duas últimas fases ocorrem pré e pós-natal no desenvolvimento humano, enquanto os quatro primeiros estágios ocorrem exclusivamente durante o desenvolvimento fetal, a menos que ocorram nascimentos prematuros3. A fase embrionária começa na camada de germes endodérmicos e termina com o brotamento da traqueia e dos botões pulmonares. O desenvolvimento pulmonar ocorre em parte através da sinalizaçã....
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Protocolo
Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Programa de Proteção à Pesquisa Humana da UCSD (181180).
1. Indução definitiva de endóderme de células-tronco pluripotentes induzidas (Dia 1 - 3)
- Degelo lento fator de crescimento reduzido (GFR)-membrana de porão (BM) meio de matriz no gelo 30 minutos antes do uso. No DMEM/F12 frio, misture, dilui o meio de matriz BM GFR 1:1 de tal forma que constitua 50% deste meio. Coloque as pontas de pipeta P1000 no congelador para esfriar antes de usar.
- Cubra cada poço de uma placa de 12 poços com 500 μL de matriz de membrana de 50% GFR-porão preparada e....
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Resultados
24 horas após o revestimento, dia 1, os iPSCs devem ser 50%-90% confluentes. No dia 2, o DE deve ser 90%-95% confluente. Durante a indução de DE, é comum observar morte celular significativa no dia 4, mas as células anexadas manterão uma morfologia compacta de paralelepípedo (Figura 2b). Descontinua a diferenciação se a maioria das células aderentes se desprender e considerar reduzir a exposição à mídia DE com ativação A por 6-12 h. Durante a indução da AFE, a morte celular é mínima, e as cé.......
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Discussão
A diferenciação bem sucedida de organoides pulmonares inteiros 3D (WLO) conta com um protocolo de várias etapas e seis semanas com atenção aos detalhes, incluindo tempo de exposição a fatores de crescimento e pequenas moléculas, densidade celular após a passagem e a qualidade dos hiPSCs. Para solucionar problemas, consulte tabela 2. hiPSCs devem ser aproximadamente 70%-80% confluentes, com menos de 5% de diferenciação espontânea antes da dissociação. Este protocolo exige o meio "mTeSR plus"; no entanto, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cultura de célulasplacas de | |||
| 12 poços | Corning | 3512 | |
| Insertos de 12 poços, 0,4um, translúcido | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ácido ascórbico | Sigma | A4544 | |
| B27 sem ácido retinóico | ThermoFisher | 12587010 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) Fração V, solução a 7,5% | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Tecnologias | 35050061 | |
| presunto' s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove' s Dulbecco modificado ' s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monotioglicerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/caixa) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Caneta/estreptococo | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Inibidor de Rocha) | R& D Systems | 1254/1 | |
| Fatores de Crescimento/Pequenas Moléculas | |||
| Activin A | R& D Systems | 338-AC | |
| Ácido retinóico totalmente trans (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R& D Systems | 314-BP / CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorfina | R & D Systems | 3093 | |
| EGF | R& D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R& D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R& D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtil-1-metilxantina) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R& D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R& D Systems | 297-VP/CF | |
| strong>Anticorpos primários | Taxa de diluição | ||
| CXCR4-PE | R& D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R& D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (maduro) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (maduro) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Referências
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M.
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Reimpressões e permissões
