Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

En eksperimentell design innen emne ved hjelp av en objektplasseringsoppgave hos rotter

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62458
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1,5
1Danish Research Institute of Translational Neuroscience (DANDRITE), Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Universitätsklinikum Würzburg, Institut für Klinische Neurobiologie, 3Translational Neuropsychiatry Unit, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 4Faculty of Science, Radboud University, 5Center for Proteins in Memory - PROMEMO, Danish National Research Foundation, Department of Biomedicine, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen gir detaljerte trinn for en objektplasseringsoppgave med fire repetisjoner som bruker samme kohort av rotter. Svak og sterk koding kan gi kortsiktige og langsiktige minner. Fleksibiliteten i protokollen med repetisjon kan være gunstig for studier som involverer kirurgiske operasjoner ved å spare tid og arbeidskraft.

Abstract

Objekt stedgjenkjenning er en fremtredende metode som brukes til å undersøke romlig minne hos gnagere. Dette gjenkjenningsminnet for objektstedet danner grunnlaget for objektplasseringsoppgaven. Dette dokumentet gir en omfattende protokoll for å veilede etableringen av en objektplasseringsoppgave med mulighet for opptil fire repetisjoner ved hjelp av samme kohort av rotter. Både svake og sterke kodingsprotokoller kan brukes til å studere kortsiktige og langsiktige romlige minner av varierende styrke og for å muliggjøre implementering av relevante minnehemmende eller -forsterkende manipulasjoner. I tillegg tillater gjentakelse av testen med motvekten som presenteres her kombinasjonen av resultater fra to eller flere tester for sammenligning innen emnet for å redusere variasjon mellom rotter. Denne metoden bidrar til å øke statistisk kraft og anbefales på det sterkeste, spesielt når du kjører eksperimenter som gir høy variasjon i individuell oppførsel. Dette forbedrer studien direkte ved å øke dataene som er hentet fra hvert dyr og redusere det totale antallet dyr som trengs. Til slutt øker implementeringen av den gjentatte objektplasseringsoppgaven effektiviteten til studier som involverer kirurgiske prosedyrer ved å spare tid og arbeidskraft.

Introduction

Spontane anerkjennelsesoppgaver(f.eks. objektgjenkjenning, objektstedgjenkjenning) har i stor grad blitt brukt i undersøkelsen av minne hos gnagere. Disse testene er ulikt de forskjellige testene som brukes til å vurdere minne som er basert på enten fryktkondisjonering eller belønningsmotivasjon, ved at spontane anerkjennelsesoppgaver utelukkende er basert på spontan utforskende oppførsel mot nye stimuli. Denne oppførselen, referert til som 'neotisk preferanse'1, er iboende hos gnagere så vel som i andre pattedyrarter og noen ikke-pattedyr som fugler og fisk2. Gjenkjenning av objektplassering, som avhenger av romlig minne, kan observeres ved hjelp av objektplasseringsoppgaven (også kjent som romlig objektgjenkjenningsoppgave)3. Lesjonsstudier har vist at objektplassgjenkjenning krever en intakt hippocampus4,5. På grunn av den relativt enkle opplæringsprotokollen og fraværet av forsterkning, er denne oppgaven å foretrekke i mange studier. Fraværet av både positiv og negativ forsterkning minimerer tilleggsparametrene og hjerneregionene som kan drive atferden. Derfor er oppførsel her nøytral og er basert på nysgjerrighet og romlig minne, slik at undersøkelse av mekanismer som er involvert i koding, konsolidering og gjenfinning av romlig minne.

Protokollen for objektplasseringsoppgaven består vanligvis av habituation-økter etterfulgt av en enkelt økt med kodings- og testforsøk, atskilt med en forsinkelsesperiode, som varierer fra flere minutter til timer. Det anbefales sterkt at rotter håndteres på forhånd for å minimere dyrets stressnivå, og dermed oppførsel som kan påvirke anerkjennelsesminnet, for eksempel aversjon mot nyhet. På samme måte spiller en godt designet habituation-protokoll en viktig rolle i å forhindre stress som kan hindre rottens naturlige oppførsel under oppgaven. Omfanget av håndtering og habituation varierer imidlertid i stor grad mellom laboratorier og eksperimenter, noe som kan bidra til lav replikerbarhet6,7,8. I kodingsforsøket får rotten tid til å utforske en arena med to identiske objekter plassert i to utpekte hjørner. I testforsøket, som er forsinket med en periode, får rotten tid til å utforske arenaen med samme par objekter, men denne gangen har en av dem blitt flyttet til et nytt sted. Den spontane preferansen utstilt av rotter og den resulterende økningen i tid brukt på å utforske objektet på den nye plasseringen, indikerer romlig anerkjennelse og minnet om objektplasseringene3. Endring av kodingsforsøket (varighet og antall repetisjoner) påvirker minnets styrke.

Avhengig av målet med studien, kan lengden på forsinkelsen mellom koding og testforsøk endres for å modellere proteinsynteseuavhengig korttidshukommelse eller proteinsynteseavhengig langtidshukommelse. Derfor kan objektplasseringsoppgaven brukes til et bredt spekter av studier ved å tilpasse protokollen etter behov. Videre er implementering av eksperimentelle manipulasjoner, som farmakologiske og optogenetiske intervensjoner, også mulig mellom disse studiene, som det er in vivo-avbildning. Det er flere studier9,10 som rapporterer gjentatte gjentakelser av objektplasseringsoppgaven i samme rottekohort. Dette står i kontrast til den tradisjonelle bruken der ett dyr har en økt uten repetisjoner. Imidlertid har effektiviteten av disse paradigmene ikke blitt grundig undersøkt, og det er heller ingen metodepapirer som beskriver disse. Så vidt vi vet, er dette den første rapporterte beskrivelsen av en protokoll som beskriver i detalj en objektplasseringsoppgave med opptil fire repetisjoner ved hjelp av samme rottekohort, som også systematisk sammenligner resultatene fra hver repetisjon. Repetisjoner kan brukes til å motvirke eksperimentelle forhold for å tillate sammenligning innen emne med redusert variasjon mellom tester. Den pålitelige gjentakelsen av oppgaven gjør at data kan samles, noe som betyr at tilstrekkelig stor mengde data kan genereres ved hjelp av et relativt lite antall rotter. Til slutt kan repetisjoner ved hjelp av samme rotte være gunstige i eksperimenter som involverer kirurgiske operasjoner og implantasjoner ved å senke antall rotter som kreves som følgelig sparer tid og arbeidskostnader.

Denne studien presenterer en omfattende protokoll som beskriver hvordan man utfører en objektplasseringsoppgave hos voksne rotter ved hjelp av sterke og svake kodingsforsøk etterfulgt av testforsøk med forsinkelser på 1 t og 24 timer. Den sterke kodingsprotokollen produserer statistisk signifikant anerkjennelsesminne når den testes med forsinkelser på 1 t og 24 timer og kan dermed brukes til å studere både kortsiktige og langsiktige minner ved implementering av manipulasjoner for å hemme disse minnene11. Den svake kodingsprotokollen gir derimot bare betydelig kortsiktig minne når den testes med en forsinkelse på 1 t. Fraværet av langsiktig minne kan brukes til å studere manipulasjoner for å forbedre oppbevaringen av minne11,12. Denne protokollen inneholder også detaljerte håndterings- og habituation-økter, som tar sikte på å øke replikerbarheten til objektplasseringsoppgaven. Dette dokumentet demonstrerer også gjentakelse av oppgaven i fire forskjellige sammenhenger med samme kohort av rotter ved hjelp av den svake kodingsprotokollen, som bekreftes å produsere repliserbare og konsistente resultater hver gang.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av danske nasjonale myndigheter (Lisensnummer: 2018-15-0201-01405) i samsvar med dansk og EU dyrevelferdslovgivning.

1. Eksperimentelt oppsett og utarbeidelse av distinkte kontekster

  1. Plasseringsarena for objekt med kontekst
    MERK: Oppsettet nedenfor er demonstrert i en lukket lydisoleringsboks (Figur 1B) med lyskilden plassert langs kantene av taket og kameraet som er plassert midt i taket på esken. Arenaen, 60 cm x 60 cm med vegger som er 100 cm høye (Figur 1B), er plassert inne i esken og er helt isolert fra det omkringliggende rommet. Alle romlige signaler er inne i arenaen. Dette forenkler prosessen med å opprette distinkte kontekster. Et lignende isolasjonsnivå fra det omkringliggende rommet kan oppnås ved å omslutte en vanlig åpen arena med et jevnt gardin rundt veggene.
    1. Få en firkantet arena laget av ugjennomsiktig, ikke-porøs hard plast med minimum 60 cm bredde og minimum 50 cm høyde. Velg en farge for gulvet i kontrast til rottens farge for vellykket opptak av rottebevegelser av den automatiserte programvaren (hvis aktuelt). Plasser arenaen enten inne i en boks (Figur 1B) eller på en plattform som er omsluttet av et gardin.
    2. For å skape en kontekst, få et ekstra lag med innsettingsvegger(f.eks. veggbelegg laget av samme materiale som arenaen, eller plasttapet som lett kan rengjøres) i forskjellige farger og /eller mønstre (f.eks. svart, hvit, striper eller prikker). Sett inn det andre laget av vegger i arenaen slik at de er forskjellige fra hverandre.
    3. Oppnå tredimensjonale (3D) romlige signaler (1-2 per kontekst) med dimensjoner som varierer mellom 10 cm x 10 cm x 5 cm og 20 cm x 15 cm x 15 cm (bredde x lengde x høyde) og har (i) distinkte geometriske former og (ii) farger som kontrasterer veggfargen. Heng dem på veggene høyt nok slik at rotter ikke kan nå disse signalene.
    4. Få forskjellige par med objekter (så mange som kontekstnummeret) som ikke er porøse, ikke-tyggebare og enkle å rengjøre. Ta sikte på å ha distinkte geometriske former og teksturer for hvert nytt objekt. Velg objekter som er mellom 5 og 15 cm i bredde og høyde (unngå høyere gjenstander). Se figur 1D for eksempler på fire forskjellige objekter (kjegler, fotballer, rektangulære prismer og trekantede prismer).
      MERK: Hvert objekt bør være av samme interesse som rotter, slik at de totale letetidene for alle objekter er sammenlignbare.
    5. Finn den beste løsningen for å feste gjenstandene på gulvet på arenaen (f.eks. ved hjelp av klissete matter, dobbeltsidig tape, feste en metallplate under objektet og en parmagnet under arenaen etc.).
    6. Når du oppretter en annen kontekst, oppretter du veggene på nytt slik at de kontrasterer fordelingen av farge og mønster på veggene fra de(n) forrige kontekst(e). Bruk nye 3D-romlige signaler som er forskjellige fra, og i motsetning til, alle tidligere signaler. Se figur 1C hvis du vil se eksempler på fire forskjellige kontekster.
    7. Få en lyskilde som vil sikre en diffus og lik belysning i arenaen, og som har et dimmeralternativ. Juster lysintensiteten til ca. 100-120 lux i hjørnene av arenaen etter å ha skapt hver kontekst. Få tak i et kamera og plasser det i midten av taket på esken.
      MERK: Lysintensiteten kan justeres til et lavere nivå hvis automatisk poengberegningsprogramvare ikke brukes.
  2. Objektsamling
    1. Få en bøtte (>50 cm i diameter). Ikke velg en firkantet form for å unngå likhet med den eksperimentelle arenaen. Fyll den med sengetøy.
    2. Få 5-10 objekter av forskjellige former og størrelser (forskjellig fra objektene som skal brukes i eksperimentet) og plasser dem tilfeldig i bøtte (Figur 1A).

Figure 1
Figur 1: Det eksperimentelle oppsettet, inkludert fire forskjellige kontekster og objekter. (A) Objektsamlingen for objektvanesetting. (B) Eksperimentapparatet (til venstre), som omslutter objektets plasseringsarena, kameraet og lyskilden. Eksperimentell boks og arena før kontekstoppsett (i midten) og arena med kontekstoppsett (høyre). (C) Fire sammenhenger (1-4) med distinkte veggfarger og -mønstre, i tillegg til tredimensjonale romlige indikatorer. (D) Fire objekter som brukes i kontekstene 1-4, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Kamera- og sporingsprogramvare (valgfritt)
    1. Få programvare som kan brukes til å fjernstyre kameraopptakeren, og som kan spore rotteneser. Gjør programvarejusteringene for hver spesifikke kontekst og rottestamme før hvert eksperiment.
  2. Motvekt av objektplasseringer og eksperimentelle grupper
    1. Klargjør mulige kombinasjoner av objektplasseringer for koding og testforsøk, og navngi disse som tellere. Opprett kombinasjonene slik at de dekker alle hjørner som objektplasseringer, og objektbevegelse fra tilstøtende til diagonale hjørner og omvendt (Figur 2A).
    2. Forbered en tidsplan for det spesifikke eksperimentet, som samsvarer med hver rotte i en eksperimentell gruppe med en teller. Bruk hvert par av de to parede tellerne (figur 2A) i én gruppe, hvis det er nok rotter. Bruk samme sett med tellere for begge eksperimentelle grupper i én enkelt kodings-/testøkt (Figur 2B). Tilordne tellere for følgende økter på nytt (dvs. hver nye kontekst).
      MERK: Kjør rottene i blandet rekkefølge under koding/testøkter (f.eks.ikke kjør alle rotter i det ene buret etter hverandre; roter i stedet bur for å sikre et rolig miljø i et bur med mer enn en rotte).
    3. Når du bruker to eller flere kontekster for å balansere de eksperimentelle gruppene (for eksempel 1-h minne kontra 24-timers minnegrupper), tilordne rotter til hver gruppe og endre gruppene i følgende sammenhenger (Figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Representative motvektsmetoder. (A) Mulige orienteringer av objekter på arenaen ved koding og testforsøk kalles tellere. Objekt 1 er alltid det bevegelige objektet. Hver to tellere motvekter slik at plasseringen av det bevegelige objektet endres. Hvert hjørne er opptatt to ganger, og objekt 1 flyttes fra diagonal til tilstøtende og omvendt i like mange ganger. (B) Eksempel på koding/testplan for to motvektsøkter (f.eks. kontekst 1 og 2). Rotter er tildelt eksperimentelle forhold i kontekst 1 (økt X, venstre). Et sett med tellerpar (dvs. 1-2, 3-4, 5-6 og 7-8) velges og tilordnes hver rotte i en eksperimentell gruppe. Det samme settet med tellere er tildelt rotter i begge eksperimentelle grupper. I den følgende økten i kontekst 2 (økt X +1; høyre), endres rottene i eksperimentelle grupper for motvekt, og et nytt sett med tellerpar tildeles. Tidspunktet i begynnelsen av koding og testforsøk bør noterres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Alle håndterings-, habituation- og kodings-/testøkter i denne protokollen ble optimalisert i lysfasen av en 12-timers lys/mørk syklus, og derfor anbefales det at eksperimenter utføres i lysfasen.

2. Håndtering og habituation

  1. Begynn å håndtere rotter som begynner enten fra avvenning (hvis rottene blir oppdrettet i hjemmeanlegget) eller 2-3 uker før begynnelsen av eksperimenter (i tilfelle at rottene bestilles fra et eksternt anlegg, etter å ha tillatt dem å akklimatisere i en uke etter ankomst).
  2. Bruk minst 10-15 min på hvert bur med 4 rotter i 2 eller 3 dager i uken til rottene er komfortable med å bli berørt og plukket opp av eksperimentet. Juster tiden som er tildelt per bur, avhengig av antall rotter i et bur.
    MERK: Det er viktig at alle eksperimenter som forventer å jobbe med rottene er til stede under håndtering.
  3. I tilfeller der håndteringen begynner ved avvenning, reduser håndteringen til et minimum (valgfritt) når dette nivået er nådd. Hvis du begynner 2-3 uker før forsøkene, fortsett å håndtere til begynnelsen av habituation økter.
  4. Ta rottene i burene sine til eksperimentrommet for å habituate rottene til transporten så vel som til det eksperimentelle rommet. La rotter sitte i minst 30 minutter for å gi dem tid til å roe seg ned og habituate. Etter denne tiden, returner rotter / bur til boligrommet.
    MERK: Trinn 2.4 kan kombineres med håndtering og gjentas så mange ganger som nødvendig. Ytterligere habituation kan implementeres på dette trinnet hvis protokollen inkluderer ytterligere manipulasjoner(f.eks. håndtering for prosedyren for injeksjoner etc.).
  5. Utfør objektvanesetting for å habituate rotter til å samhandle med objekter og for å redusere generelle stressnivåer som stammer fra opplevelsen av nye miljøer.
    1. For økt 1, ta med alle hjemmeburene til eksperimentrommet, og la rottene habituate til rommet og bosette seg i minst 30 min. Sett rotter (2-4 rotter) fra samme bur sammen i bøtte i 20 min. Rengjør bøtte ved å fjerne fekal materie mellom hver gruppe rotter. Gjenta prosedyren for alle bur. Sett alle rotter i sine hjemmebur og gå tilbake til boligrommet.
    2. For økt 2, på en egen dag, ta alle burene til eksperimentrommet og la det stå i minst 30 minutter. Sett hver rotte individuelt i bøtte i 10 min. Plasser rotten tilbake i hjemmeburet og rengjør bøtte etter hver rotte. Returner alle bur til boligrommet.
    3. For økt 3 gjentar du trinn 2.5.2 på en egen dag.
  6. Hvis det eksperimentelle apparatet er en lukket boks (figur 1B), velger du å utføre tom boksvane for å habituate rottene til det nye eksperimentelle apparatet. I økt 4, ta alle burene til eksperimentrommet og la det stå i minst 30 minutter. Plasser rotter fra samme bur sammen (2-4 rotter) i den tomme arenaen uten kontekst eller romlige signaler (Figur 1B, midten) i 20 min. Plasser alle rotter tilbake i hjemmeburet, og tørk arenaen med 70% etanol etter hver gruppe rotter.
    MERK: Trinn 2.5 og 2.6 skal utføres i løpet av en enkelt uke, før kontekstvaneuken (trinn 2.7; se figur 3). En pause i et par dager i løpet av disse trinnene er akseptabelt. Etter at du har startet trinn 2.7, bør imidlertid hvert trinn utføres på påfølgende dager som angitt, frem til slutten av testforsøket (trinn 2.9).
  7. Utfør kontekstvane for å habituate rotter til konteksten og 3D-signaler, for å redusere generelle stressnivåer og for å støtte romlig læring av miljøet.
    1. Endre den tomme arenaen for å skape den første konteksten som beskrevet i pkt. 1.1, men ikke plasser objektene i arenaen. Klargjør opptaksutstyret.
    2. For økt 1, ta alle burene til eksperimentrommet og la det stå i minst 30 minutter. Start opptakeren hvis du gjør dette manuelt. Plasser den første rotten i midten av arenaen, og la rotten utforske arenaen i 10 min. Stopp deretter opptakeren (hvis manuell), og plasser rotten tilbake i hjemmeburet. Tørk arenaen grundig med 70% etanol etter hver rotte, og returner alle bur til boligrommet når du er ferdig.
    3. For økt 2 og 3 gjentar du trinn 2.7.2 for hver rotte over to påfølgende dager, slik at det totalt er 3 økter med kontekstvane per rotte.
      MERK: Vurder å stokke i hvilken rekkefølge rotter går inn i arenaen, spesielt når du arbeider med en stor gruppe. Dette unngår å kjøre spesifikke rotter gjentatte ganger på samme tid på dagen.

Figure 3
Figur 3: Utformingen av atferdseksperimentet, inkludert håndtering, habituation og oppgaveprotokoller for objektplassering. Rotter bør håndteres regelmessig fra noen uker før habituation uken. I uke 0 utføres objekt- og eksperimentelle boksvaner over 4 økter med minst 24-timers intervaller i mellom. I uke 1 utføres kontekstvaneføring over 3 påfølgende økter med 24-timers intervaller i mellom, etterfulgt av koding og testforsøk. Det bør være minimum 48 timer og opptil 1 ukes intervall før du fortsetter med følgende økt (f.eks. begynne habituation til neste kontekst i uke 2 eller 3). Forkortelse: Hab., habituation. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Prøveversjon av koding (økt 4)
    MERK: Ved farmakologiske manipulasjoner kan en rimelig tid for å administrere et middel enten være før eller umiddelbart etter kodingsforsøket(e) og/eller før testforsøket, avhengig av legemiddelets art.
    1. Ta alle burene til eksperimentrommet og la det stå i minst 30 minutter. Bruk tidsplanen som er utarbeidet på forhånd (Figur 2B), plasser det første identiske par objekter på de angitte stedene (i 2 hjørner og en avstand på >10 cm fra hver respektive vegg; et L-formet stykke papp kan brukes til å opprettholde samme avstand hver gang) ved hjelp av klissete matter eller dobbeltsidig tape.
    2. Start opptakeren (hvis manuell). Plasser den første rotten i arenaen vendt mot en vegg eller et hjørne som ikke er okkupert av noe objekt (lik avstand til hvert objekt).
      MERK: Følg trinnene nedenfor for enten svak eller sterk koding.
    3. For svak koding (1 studie), la rotten utforske arenaen og objekter i 20 min. Stopp deretter opptakeren (hvis manuell), og plasser rotten tilbake i hjemmeburet. Fjern gjenstandene, og tørk både gjenstandene og arenaen grundig med 70% etanol.
    4. Gjenta trinn 2.8.3 for alle rotter slik at hver rotte mottar 1 kodingsstudie på 20 min.
    5. For sterk koding (3 forsøk), la rotten utforske arenaen og objekter i 5 min. Stopp deretter opptakeren (hvis manuell), og plasser rotten tilbake i hjemmeburet. Ikke fjern objektene. Tørk arenaen og gjenstander med 70% etanol.
    6. Gjenta trinn 2.8.5 to ganger til med samme rotte slik at det er 3 studier totalt. Plasser rotten tilbake i hjemmeburet når tiden er inne. Fjern gjenstandene for grundig rengjøring, og tørk gjenstandene og arenaen med 70% etanol.
      MERK: Intervallet mellom prøvene for en rotte skal være ca. 1-2 min.
    7. Gjenta trinn 2.8.5-2.8.6 for hver rotte.
    8. Hvis forsinkelsestiden er kortere enn 24 timer, hold burene i eksperimentrommet til testforsøket. Hvis ikke, returner alle burene til boligrommet når du er ferdig.
  2. Prøveforsøk (økt 4)
    MERK: Forsinkelsesperioden skal telles fra begynnelsen av kodingsforsøket.
    1. I tilfelle en 24-timers forsinkelse (eller forsinkelse som krever at testforsøket utføres neste dag), ta alle burene til eksperimentrommet, og la det være tilstrekkelig tid før den første testen, slik at rottene kan stå i minst 30 minutter. I henhold til tidsplanen plasserer du objektene på de angitte stedene (ett av objektene på et nytt sted).
    2. Når tiden er inne, start opptakeren (hvis manuell). Plasser den første rotten i arenaen vendt mot en vegg eller et hjørne som ikke er okkupert av noe objekt (lik avstand til hvert objekt).
    3. La rotten utforske arenaen og gjenstander i 5 min. Stopp deretter opptakeren (hvis manuell). Plasser rotten tilbake i hjemmeburet. Fjern gjenstandene, og tørk både gjenstandene og arenaen grundig med 70% etanol.
    4. Gjenta trinnene 2.9.2-2.9.3 for hver rotte. Returner alle burene tilbake til boligrommet.
      MERK: I hver følgende kodings-/testøkt starter du habituation-protokollen fra trinn 2.7 (kontekstvaneføring) etter et intervall på minst 48 timer og opptil 1 uke.

3. Dataanalyse

  1. For hver rotte scorer du letetiden for hvert objekt i både kodings- og testforsøkene ved hjelp av programvare designet for dette formålet eller ved hjelp av et manuelt oppsett. Forsøk med poengkoding for hele varigheten. Score testforsøk i 2 min for beste diskriminering ytelse3. Hvis du bruker automatisk poengsum for programvare på Internett, eksporterer du poengberegningsdataene fra programvaren.
  2. Tell letetid når rotten er i kontakt med objektet, snus objektet eller vendt mot objektet i en avstand mindre enn 2 cm. Inkluder klatring og sittende på objektet som utforskning med mindre rottens oppmerksomhet ser ut til å være et annet sted enn objektet (f.eks. ser bort fra objektet).
  3. Beregn den totale letetiden for begge objektene for hver rotte. Vurder å ekskludere rotter som har en total letetid på mindre enn 10 s i teststudien (for 2 minutters poengregning) fra denne testen, da den kan gjenspeile upålitelig leting.
  4. Beregn leteprosenten for hvert objekt (ligning 1) eller diskrimineringsindeksen (DI) for hver rotte (ligning 2), og beregn gjennomsnittsverdier for gruppene.
    Equation 1 (1)
    Equation 2
    MERK: Hvis % leting er 50 % eller DI er 0, betyr det at ytelsen er på sjansenivå, og rotten har ingen preferanse for noen av objektene. Gjennomsnittlig prosentandel leting og DI under kodingsforsøk bør være henholdsvis ~ 50% eller 0. Enhver rotte som viser en preferanse høyere enn [gjennomsnittlig ± (2 × SD)] for et av objektene i kodingsforsøket, bør utelukkes fra analysen av den respektive testen. Dette muliggjør pålitelig tolkning av preferanse i testforsøket som minnet om det stabile objektstedet. Denne verdien kan beregnes for en individuell test eller for kombinerte kodingsdata fra flere tester.
  5. Analyser dataene ved hjelp av metoden som passer best til det eksperimentelle oppsettet. Bruk en t-testmed ett utvalg for å oppdage en betydelig preferanse over sjansenivået.
  6. Når du bruker mer enn én kontekst med motvekt, kombinerer du resultatene av den samme eksperimentelle tilstanden på tvers av kontekster.
    MERK: Dette vil resultere i grupper som består av de samme rottene, noe som muliggjør sammenligning innen emne ved hjelp av en parvis t-testfor to grupper og ved hjelp av gjentatte målanalyse av varians (ANOVA) for mer enn to grupper.

Representative Results

Vist her er de representative resultatene for både de sterke og svake kodingsprotokollene beskrevet ved hjelp av mannlig tyrosinhydroksylase (Th)-Cre transgene rotter13 med Long-Evans belastning tilbakekrysset fire ganger til Lister Hooded belastning og wild-type Lister Hette rotter. Th-Cre transgene rotter ble brukt da denne rottelinjen vil bli brukt i fremtidige studier som involverer optogenetikk. Ved hjelp av hver protokoll ble minnet testet med forsinkelser på 1 og 24 timer. Tester ved 1 time viser korttidshukommelse, mens 24-timers tester viser langtidshukommelse. Eksklusjonsverdien for kodingspreferanse ble beregnet som beskrevet i protokollen, ved hjelp av de kombinerte dataene fra fem tester (sterke og svake kodingsprotokoller) som [50,8 % ± (2×10,8 %)]. Rotter som hadde en kodingspreferanse over og under disse verdiene ble utelukket fra analysene av de respektive testene.

For sterke kodingsforsøk ble 16 rotter brukt, og for svake kodingsforsøk ble 19 rotter brukt. Under de sterke kodingsforsøkene (3 × 5 min koding; Figur 4A), var det ingen signifikant preferanse for noen av objektene (52,0 ± 1,9 %, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå). Denne sterke kodingsprotokollen førte til preferanse for objektet på den nye plasseringen, som vist i form av gjennomsnittlig prosentvis leting, som var betydelig høyere enn sjansenivået (50%) i tester med både 1-t og 24-timers forsinkelser (1-t minne, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; 24-timers minne, 65,2 ± 5,3 %, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå). Det var ingen signifikant forskjell mellom 1-h og 24-timers minne (p = 0,056; uparret Welchs t-test).

Under de svake kodingsforsøkene (20 min. koding, resultater samlet fra fire sammenhenger; Figur 4B), var det ingen signifikant preferanse for noen av objektene (51,1 ± 1,0 %, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå). Denne svake kodingsprotokollen ga en betydelig økning i preferansen for objektet på den nye plasseringen sammenlignet med tilfeldighetsnivå i tester med en 1-timers forsinkelse, men ikke 24-timers forsinkelse (kombinerte data fra alle fire kontekster; 1-h minne, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; 24-timers minne, 49,6 ± 2,6 %, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå). Det var en signifikant forskjell mellom ytelsen i tester med 1-h og 24-timers forsinkelser (1-h minne: n = 32, 24-h minne: n = 34, t61,5 = 5,2, p < 0,001; uparret Welchs t-test).

Minne på gruppenivå ble ikke observert i forsinkelsestesten på 24 timer som indeksert av ytelse på sjansenivå, men viste individuelle variasjoner. Denne høyere variasjonen for svake til ikke-minneforhold(f.eks.24-timers test) ble ofte observert på grunn av mer tilfeldig utforskning av objektene. Derfor er det viktig å ikke tolke ytelsen til rotter individuelt. I stedet kan distribusjon av individuelle datapunkter brukes sammen med gruppegjennomsnittet som det pålitelige resultatet av testen. Jo sterkere kodingen er, jo mer ensartet blir rottens oppførsel, og jo færre rotter som trengs for å nå statistisk signifikans, som det kan observeres i figur 4A for den sterke kodingsprotokollen. I motsetning til dette er det behov for større grupper for å oppnå pålitelige resultater for svake forhold (Figur 4B).

Figure 4
Figur 4: Minneytelse etter sterk og svak koding. (A) Den sterke kodingsforsøket (3 × 5 min koding) etterfulgt av enten 1-t eller 24-timers testforsøk. Det var ingen signifikant preferanse for noen av objektene under kodingsforsøk (n = 16). Den sterke kodingen ga betydelig økt preferanse for objektet på den nye plasseringen i testene med både 1-t og 24-timers forsinkelser sammenlignet med sjansenivå (1-t og 24-timers minne: n = 8 i hver gruppe). Det var ingen signifikant forskjell mellom gruppene. (B) Den svake kodingsforsøket (20 min koding) etterfulgt av enten 1-t eller 24-timers testforsøk. Det var ingen signifikant preferanse for noen av objektene som gruppe under kodingsforsøk (n = 66). Den svake kodingen ga betydelig økt preferanse for objektet på den nye plasseringen i testen med en 1-t, men ikke 24-timers forsinkelse, sammenlignet med tilfeldighetsnivå (1-h minne: n = 32; 24-timers minne: n = 34). Det var en signifikant forskjell mellom ytelsen i tester med 1-t og 24-timers forsinkelser. Resultatene ble samlet fra fire sammenhenger. Individuelle datapunkter presenteres som prikker. Alle stolper viser prosentandelen av utforskning av objektet på et nytt sted som gjennomsnitt ± SEM. * p < 0,05, * *** p < 0,001; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå (50 %, stiplet linje). ###p < 0,001; ns, ikke signifikant; uparret Welchs t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En betydelig fordel med denne etablerte protokollen er at den kan utføres fire ganger ved hjelp av fire forskjellige sammenhenger (figur 1C) med samme kohort av rotter. Resultatene vist i figur 5 viser en mulig måte å bruke motvekt med to eksperimentelle grupper (1-t og 24-timers minnegrupper). De to gruppene ble motvektet over to sammenhenger (kontekst 1 og 2), og dette ble gjentatt i to ekstra sammenhenger (kontekst 3 og 4; Figur 5A). Resultatene fra de fire kontekstene presenteres individuelt i figur 5B,D, der minnet for hver eksperimentell gruppe ble vurdert ved å sammenligne preferansen til tilfeldighetsnivå i hver kontekst (1-h minne: Kontekst 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p < 0,001; Kontekst 2, 65,6 ± 3,9 %, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Kontekst 3, 65,2 ± 3,8 %, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Kontekst 4, 65,3 ± 5,6 %, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; 24-timers minne: Kontekst 1, 45,1 ± 6,4 %, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Kontekst 2, 49,1 ± 4,9 %, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Kontekst 3, 57,2 ± 4,1 %, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Kontekst 4, 47,6 ± 4,7 %, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå).

I sammenhenger 1, 2 og 4, mellom-emne sammenligning av gruppene avdekket signifikante forskjeller mellom 1-h og 24-h minne (1-h minne versus 24-h minne: Kontekst 1, t12.7 = 3.4, p = 0.005; Kontekst 2, t15,2 = 2,6, p = 0,019; Kontekst 3, t13,0 = 1,4, p = 0,17; Kontekst 4, t12,2 = 2,4, p = 0,032; uparret Welchs t-test). For en bedre representasjon og sammenligning av dataene i emnet ble resultatene fra to motvektskontekster kombinert (Figur 5C,E). De kombinerte eksperimentelle gruppene ble sammenlignet med tilfeldighetsnivå individuelt igjen (Kontekst 1 og 2 kombinert: 1-timers minne, 67,8 ± 2,6 %, n = 18, t17 = 6,7, p < 0,001; 24-timers minne, 47,1 ± 3,9 %, n = 18, t17 = 0,74, p = 0,47; Kontekster 3 og 4 kombinert: 1-t minne, 65,3 ± 3,3 %, n = 14, t13 = 4,7, p < 0,001; 24-timers minne, 52,4 ± 3,2 %, n = 16, t15 = 0,73, p = 0,48; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå). Deretter ble de eksperimentelle gruppene sammenlignet med hverandre.

I begge kontekstparene var det signifikante forskjeller mellom grupper som ble avslørt av sammenligninger i et emne (1-h minne versus 24-timers minne: Kontekster 1 og 2 kombinert, t16 = 3,5, p = 0,003; Kontekster 3 og 4 kombinert, t13 = 2,4, p = 0,032; parvis t-test). Sammenlignbare resultater ble oppnådd med wild-type Lister Hooded rotter også, i den svake koding protokollen ved hjelp av kontekster 1 og 4 for de to motvekt økter (data ikke vist). Replikerbarheten og påliteligheten til resultatene ble validert ved å sammenligne hvert datasett ved hjelp av enveis ANOVA. Det ble ikke oppdaget noen signifikant forskjell mellom de fire kontekstene (1-h minne: F3,28 = 0,31, p = 0,81; 24-timers minne: F3,30 = 0,99, p = 0,41). Derfor kan objektplasseringstesten gjentas pålitelig med minimal påvirkning av repetisjoner, gitt at instruksjonene i denne protokollen følges.

Figure 5
Figur 5: Ulike måter å presentere og analysere resultatene av den svake kodingsprotokollen med to eksperimentelle grupper motvektet over to økter. (A) Eksperimentell design for motvekt med to eksperimentelle grupper (1-t og 24-timers minnegrupper) over to økter (kontekster 1 og 2). Motvekten ble gjentatt i to ekstra økter (kontekst 3 og 4). (B og D) Resultatene fra hver kontekst og eksperimentelle grupper ble individuelt sammenlignet med tilfeldighetsnivå og hverandre. I alle fire sammenhenger ble preferansen for objektet på den nye plasseringen i tester med en forsinkelse på 1 t betydelig økt sammenlignet med tilfeldighetsnivå [Kontekst 1 og 2: n = 9 per gruppe (B); Kontekst 3 og 4: n = 7 per gruppe (D)]. I 24-timers forsinkelsestester var preferansen for objektet på den nye plasseringen ikke forskjellig fra tilfeldighetene (kontekst 1 og 2: n = 9 per gruppe; Kontekst 3 og 4: n = 8 per gruppe). Det var en signifikant forskjell mellom preferansene til eksperimentelle grupper i sammenheng 1, 2 og 4, men ikke kontekst 3, som avslørt av sammenligning mellom emner. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå (50 %, stiplet linje). #p < 0,05; ##p < 0,01; ns, ikke signifikant; uparret Welchs t-test. (C og E) Resultatene presenteres etter å ha kombinert eksperimentelle grupper fra de to motvektskontekstene [Kontekst 1 og 2 kombinert, n = 17 per gruppe (C); Kontekster 3 og 4 kombinert, n = 14 per gruppe (E)]. Preferansen for objektet på den nye plasseringen ble betydelig økt sammenlignet med tilfeldighetsnivå i tester med en 1-t, men ikke 24-timers forsinkelse, i begge kontekstparene. Den generelle sammenligningen av eksperimentelle grupper viste signifikante forskjeller mellom preferansene for objektet på det nye stedet i tester med 1-t og 24-timers forsinkelser i begge kontekstparene. p < 0,001; t-test med ett utvalg kontra sjansenivå (50 %, stiplet linje). #p < 0,05, # p< 0,01; sammenkoblet t-test. Individuelle datapunkter presenteres som prikker. Alle stolper viser prosentandelen av utforskning av objektet på den nye plasseringen som betyr ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Objektplasseringsoppgaven kan brukes i en rekke studier for å undersøke romlig minne som beskrevet tidligere. Fleksibiliteten til oppsettet muliggjør modellering av kortsiktig og langsiktig minne av forskjellige styrker, og det kan enkelt implementeres til en lav pris. Men siden det er mange parametere i protokollen som kan påvirke resultatene, og forskjellige studier varierer litt i disse parametrene6, kan man få problemer med å implementere oppgaven for første gang. Protokollen ovenfor er ment å veilede leserne gjennom denne prosessen jevnt. Ytterligere viktige trinn som kan være viktige i vellykket implementering av oppgaven med høy replikerbarhet vil bli diskutert nedenfor.

Selv om kodings-/testøkten ofte er fokus når du kjører eksperimenter med objektplassering, har håndterings- og habituasjonsprotokoller en dyp effekt på utfallet av denne typen atferdstester der utfallet avhenger av uforstyrret naturlig rotteoppførsel14,15. Som sådan bør trinnene før kodingen / testøkten utformes med forsiktighet, da de kan påvirke rotteadferd og minne og følgelig påvirke sluttresultatene. Et godt nivå av håndtering og habituation slik at rotter blir kjent med eksperimentet, og oppgaven vil minimere effekten av stressfaktorer samtidig som sannsynligheten for å vise naturlig oppførsel8økes. Som nevnt i protokollen kan håndteringen begynne så tidlig som avvenning av valper hvis rottestammen opprettholdes i hjemmeanlegget. Basert på tidligere erfaring (data ikke vist) og fra flere tidligere studier16,17, resulterer denne tidlige håndteringen i lav angst og forbedret nysgjerrighet i månedene som følger.

Ettersom objektplasseringsoppgaven bare avhenger av rottenes iboende utforskende drivkraft, kan forventet oppførsel lett hindres hvis rotter ikke er ivrige etter å utforske eller motvillige til å nærme seg nyhet, som kalles 'neofob oppførsel'1. Som sådan anbefales det på det sterkeste å inkludere en grundig håndterings- og habituasjonsprotokoll i henhold til studiens spesifikke behov. Denne protokollen kan brukes som en minimumskravguide, og ytterligere trinn kan implementeres (f.eks.hvis studien skal inkludere injeksjoner på et senere tidspunkt, er det nødvendig med habituation til injeksjonsprosedyrer og spesifikk holdeposisjon). Belastningen og alderen til de eksperimentelle rottene er to andre innflytelsesrike faktorer og bør vurderes før du planlegger et eksperiment for å unngå suboptimale resultater. Ulike rottestammer kan ha forskjellig atferd og baseline angstnivåer18,19,20 og derfor kan det være nødvendig med spesifikk justering av protokollen avhengig av belastningen som brukes.

Denne protokollen er bekreftet å fungere godt med Th-Cre transgene rotter med Long-Evans belastning tilbakekrysset fire ganger til Lister Hooded belastning og wild-type Lister Hette rotter. En logisk ideell startalder for rotter i atferdseksperimenter er rundt 12 uker20, men variasjon mellom belastninger og de spesifikke kravene til oppgaven bør redegjøres for. Det kan også være mulig å bruke utviklende rotter hvis det er av interesse for studien, selv om justeringer i protokollen kan være nødvendig og ikke dekkes her. Det er imidlertid viktig å vurdere om rotten i en gitt alder har utviklet de kognitive funksjonene som kreves for å kunne utføre denne oppgaven. En studie21 som undersøker dette har rapportert at bare ungdomsrotter på barseldag 38 og ikke før, viste allokentrisk romlig minne reflektert i preferanse for objekt på det nye stedet, som observert hos voksne rotter. Protokollen som presenteres her var vellykket ved hjelp av rotter som var 15-16 uker gamle i begynnelsen av den første kodingen / testøkten. Tidligere produserte den samme sterke kodingsprotokollen suboptimale til negative resultater ved bruk av 23 uker gamle rotter som ikke hadde nådd det optimale nivået av habituation på grunn av mangel på håndtering og habituating i ung nok alder. Disse rottene klarte enten ikke å utføre annerledes enn tilfeldig nivå eller faktisk viste aversjon mot nyhet som observert når det gjelder preferanse for de stabile objektene i stedet for de fordrevne objektene (data ikke vist). Disse resultatene gir bevis på at alderen og tidspunktet for håndteringen av habituation kan ha innvirkning på effektiviteten av habituation og som et resultat bidra til observasjon av engstelig og neofobisk oppførsel i testene.

Her skisseres to forskjellige protokoller, noe som sikrer sterk eller svak koding i objektplasseringsoppgaven. Under etableringen av disse protokollene ble det observert at interessen for objektene gikk ned etter 5-10 minutters utforskning under enkle lange forsøk(f.eks. 20 min koding), og rotter sluttet til slutt å utforske. Dette resulterer i svakere minne for objektplasseringene. En kodeprotokoll som innleder kodingsforsøk med korte hvileperioder(f.eks. 3 x 5 min koding) overvinner dette og fører til høy utforskning gjennom forsøkene. Dermed påvirker den aktive letetiden og den forskjellige utformingen av disse to kodingsprotokollene styrken til minnet, som er sterkere etter 3 x 5 min koding enn etter 20-minutters kodingsprotokoller. Lignende resultater kan også oppnås ved hjelp av litt forskjellige varigheter med enkeltforsøk kontra sammenflettede prøveprotokoller, og justeringer kan gjøres for å passe behovene til studien og rottestammen.

I motsetning til protokoller som bruker et vanlig hvitt åpent felt med bare eksterne signaler i rommet, bruker protokollen som presenteres her en arena med distinkte kontekster og intra-labyrint signaler som sannsynligvis krever mer tid til å lære. Derfor anbefales det å legge til et kontekstvanetrinn i protokollen før kodingsforsøket. Dette vil tillate rotter å danne et romlig kart over hver kontekst under habituation og redusere varigheten av følgende kodingsstudie, da rottene bare trenger å kode plasseringene til objektene i forhold til dette kartet. Videre vil kontekstvaneføring tillate rotter å habituate til enhver mulig distraktor i hver kontekst, for eksempel 3D romlige signaler, minimere atferd annet enn objektutforskning i kodingen / testøkten å følge. Med implementeringen av en grundig motvektsmetode som består av flere nivåer (dvs. et bredt spekter av objektplasseringskombinasjoner (tellere) og retning av objektforskyvningen), minimeres uønskede preferanser som kan stige på grunn av variasjoner i lysintensitet og veggfarger / mønstre i hjørnene av arenaen.

Flere faktorer bør vurderes når du gjentar oppgaven for å øke replikerbarheten mellom koding / testøkter og minimere påvirkningen av repetisjon. For det første må distinkte kontekster (så mange som antall repetisjoner av kodings-/testøkter) utformes for å unngå opphopning av romlig minne som kan være forårsaket av å utføre gjentatte økter i samme kontekst. For å oppnå dette ble det brukt et apparat med utskiftbare vegger av forskjellige farger og mønstre (Figur 1B,C). De distinkte veggene og 3D-objektene (for eksempel leker eller små hverdagsartikler med distinkte farger og former, se protokoll og figur 1C) hengt på veggene er de romlige signalene og landemerkene som rottene potensielt bruker til å lære objektplasseringer i forhold til deres kontekster. I tilfelle en test ikke klarer å produsere preferanse for det flyttede objektet, kan du vurdere å endre disse parametrene for konteksten (veggdesign og romlige signaler). Alternativt kan en rektangulær eller sirkulær arena brukes til objektplasseringsoppgaver i stedet for en firkantet arena som i denne protokollen. Sirkulære arenaer rapporteres å eliminere hjørnepreferanser22 som ofte observeres på arenaer med hjørner, og dermed kan det være gunstig når du arbeider med en spesielt høy angst rotte eller musestamme. Selv om kravene til å skape fire forskjellige kontekster i denne protokollen fungerer mest optimalt med en firkantet form, kan en sirkulær arena også gjøres funksjonell etter noen justeringer.

For det andre bør intervallene mellom hver koding / testøkt bestemmes slik at rotter beholder samme interessenivå hver gang, samtidig som de unngår risikoen for kumulativ læring som følge av en tett tidsplan for repetisjoner. Vanligvis er et intervall på minst dobbelt så lang forsinkelsestid mellom koding og testforsøk tilstrekkelig, med lengre intervaller som er gunstigere for mer enn to repetisjoner. Dette betyr at selv om et intervall på minimum 48 timer etter en 24-timers test er tilstrekkelig for en eller to repetisjoner, anbefales det å bruke et 1-ukers intervall for fire repetisjoner. Etter hvert som resultatene i figur 5 og sammenligningen ved hjelp av ANOVA viser, kan oppgaven gjentas fire ganger. Basert på dette kan den etablerte protokollen brukes til å motvirke opptil fire eksperimentelle forhold. Antall eksperimentelle grupper bestemmer antall repetisjoner av kodings-/prøveøkter i distinkte sammenhenger. Resultatene i figur 5 representerer en mulig måte å bruke protokollen på med to eksperimentelle grupper. Gruppene ble motvektet i to økter, og de samme betingelsene ble gjentatt i to ekstra økter (for valideringsformål). Det andre settet med motvektsøkter kan også brukes til å motvirke nye forhold. På samme måte kan tre eller fire eksperimentelle forhold sammenlignes med henholdsvis tre eller fire motvektsøkter.

I disse tilfellene bør kontekstene utformes for å imøtekomme kontrasterende egenskaper som er beskrevet i protokollen. Det er bemerkelsesverdig at den motvektede designen kanskje ikke er egnet for eksperimenter der ytterligere manipulasjoner, for eksempel en farmakologisk intervensjon som kan etterlate en langvarig effekt eller skade, skal brukes. For å opprettholde effektiviteten og replikerbarheten av testene, bør eksperimentet utformes tilsvarende. Dataene fra gjentatte tester kan presenteres og analyseres på flere måter, som vist i figur 5. For en innledende analyse kan de eksperimentelle gruppene i hver kontekst sammenlignes individuelt med tilfeldig nivå ved hjelp av t -testmed ett utvalg for å bestemme eventuelle signifikante preferanser (Figur 5B,D). Dette kan være nyttig for å få en rask forståelse av dataene, men det sikrer bare en indirekte sammenligning av gruppene. Så for å sammenligne to eller flere grupper, bør dataene analyseres ved hjelp av henholdsvis to-utvalgs t-tester (parvis eller uparret) eller ANOVA. Dette kan være i form av sammenligning mellom emne for gruppene i en enkelt kodings-/testøkt (Figur 4A og Figur 5B,D) eller sammenligning av gruppene innenfor emnet fra to (eller flere) motvektskontekster (Figur 5C,E). Sistnevnte metode anbefales sterkt, spesielt når du arbeider med svake minneforhold, som, som forklart tidligere, resulterer i høy varians på grunn av tilfeldighet i atferd.

Ved å kombinere de motvektskontekstene fører det til større grupper som kreves for å visualisere gruppens virkemåte på en pålitelig måte med minimal variasjon. Ved å bruke en protokoll med repetisjoner i motvektsøkter, kan man forvente en nedgang i antall rotter til rundt en tredjedel av tallet som kreves ved hjelp av en enkelt test med samme statistiske kraft. Vanligvis er prøvestørrelser i et område på 7 til 15 rotter (totalt) for motvektsøkter og i et område på 20 til 50 rotter (10 til 25 per gruppe) for en enkelt økt med en effektstørrelse og kraft som begge er større enn 0,8 tilstrekkelig. Nedgangen i antall dyr som trengs og økningen i informasjonen vi får fra hvert dyr ved hjelp av denne protokollen, foredler både studien og tjener 3R-prinsippene for etisk bruk av dyr i forskning. Det er viktig på dette trinnet å huske på at tilfeldig rotteadferd, som ikke er ledsaget av et sterkt minne, kan resultere i individuelle sterke preferanser både under og over tilfeldighet, men gruppegjennomsnittet bør gi en preferanse som ikke er vesentlig forskjellig fra tilfeldighetene. Individuelle data bør tolkes nøye. Fordelingen av individuelle datapunkter i en gruppe kan også være informativ for å tolke resultater. Som vist i figur 4 og figur 5, endres fordelingen avhengig av minnets styrke. Totalt sett kan protokollen som presenteres her enkelt følges for å implementere objektplasseringsoppgaven med repetisjoner for å modellere kortsiktig og / eller langsiktig romlig minne. Den enkle og fleksible treningsprotokollen og muligheten for å implementere ytterligere manipulasjoner gjør denne oppgaven til et populært valg. Disse endringene i protokollen gjør det mulig å undersøke bestemte trinn, for eksempel minneanskaffelse, konsolidering og tilbakekalling.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil takke Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara og David Bett for innsiktsfulle kommentarer og forslag. Denne studien ble støttet av Erasmus+ (til G.B. og L.N.); Graduate School of Health, Aarhus University (til K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) og PROMEMO - Senter for proteiner i minnet, et senter for fremragende forskning finansiert av Danish National Research Foundation (DNRF133) (til T.T.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Open-field/experimental box O'Hara & Co (Japan) OF-3001 Open-field box for the object location task
Object 1: cones O'Hara & Co (Japan) ORO-RR
Object 2: footballs O'Hara & Co (Japan) ORO-RB
Object 3: rectangular blocks O'Hara & Co (Japan) ORO-RC Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus O'Hara & Co (Japan) SPP-4501 Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software O'Hara & Co (Japan) TimeSSI For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats Charles River 603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, R. N. Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).
  2. Blaser, R., Heyser, C. Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183 (2015).
  3. Dix, S. L., Aggleton, J. P. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).
  4. Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
  5. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  6. Gulinello, M., et al. Rigor and reproducibility in rodent behavioral research. Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780 (2019).
  7. Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data. PLoS One. 15 (4), 0230900 (2020).
  8. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  9. Migues, P. V., et al. Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).
  10. Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep. Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).
  11. Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).
  12. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
  13. Witten, I. B., et al. Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement. Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).
  14. Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety. Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).
  15. Schmitt, U., Hiemke, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).
  16. Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. Early life manipulations alter learning and memory in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).
  17. Denenberg, V. H., Grota, L. J. Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories. Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).
  18. Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system. Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).
  19. Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks. Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).
  20. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
  21. Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. The expression of allocentric object-place recognition memory during development. Behavioral Brain Research. 372, 112013 (2019).
  22. Yaski, O., Eilam, D. How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats. Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).

Tags

Virkemåte problem 171 objektplasseringsoppgave romlig minne gjenkjenningsminne rotte innenfor emneutforming
En eksperimentell design innen emne ved hjelp av en objektplasseringsoppgave hos rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bayraktar, G., Højgaard, K.,… More

Bayraktar, G., Højgaard, K., Nijssen, L., Takeuchi, T. A Within-Subject Experimental Design using an Object Location Task in Rats. J. Vis. Exp. (171), e62458, doi:10.3791/62458 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter