O epitélio intestinal confere não apenas absorção de nutrientes, mas proteção contra substâncias nocivas. A junção intercelular mais epitelial apical, ou seja, a junção apertada, regula soluto paracelular e permeabilidade de íons. Aqui, é descrito um protocolo para a preparação de folhas mucosas e avaliação da seletividade de íons de junções apertadas usando a técnica da câmara de Ussing.
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Artigo de método
Avaliação funcional da barreira de junção apertada intestinal e permeabilidade de íons em tecido nativo pela técnica da câmara de ussing
Neste artigo
Resumo
Resumo
A técnica da câmara de Ussing foi inventada pela primeira vez pelo cientista dinamarquês Hans Ussing em 1951 para estudar o transporte transcelular de sódio através da pele de sapo. Desde então, essa técnica tem sido aplicada a muitos tecidos diferentes para estudar os parâmetros fisiológicos do transporte através de membranas. O método de câmara de Ussing é preferível a outros métodos porque o tecido nativo pode ser usado, tornando-o mais aplicável ao que está acontecendo in vivo. No entanto, como o tecido nativo é usado, o rendimento é baixo, o tempo é limitado, e a preparação do tecido requer habilidade e treinamento. Essas câmaras têm sido utilizadas para estudar proteínas específicas de transporte em diversos tecidos, entender a fisiopatologia da doença, como na Fibrose Cística, estudar o transporte e a absorção de medicamentos, e especialmente contribuír para a compreensão do transporte de nutrientes no intestino. Dado todo o processo de transporte epitelial de um tecido, não apenas vias transepiteliais, mas também caminhos paracelulares são importantes. Junções apertadas são um determinante chave da permeabilidade paracelular específica do tecido em todo o intestino. Neste artigo, a técnica da câmara de Ussing será usada para avaliar a permseletividade paracelular dos íons, medindo os potenciais de condução transeptelial e diluição.
Introdução
O método da câmara de Ussing foi desenvolvido pela primeira vez pelo cientista dinamarquês Hans Ussing. Ussing primeiro o usou para medir a corrente de curto-circuito do transporte de sódio através da pele de sapo depois que foi observado que NaCl poderia ser transportado através da pele contra um gradiente de concentração íngreme1. Seu sistema consistia na pele do sapo montada entre duas câmaras com acesso a ambos os lados da pele. Cada câmara continha a solução de Ringer que foi circulada e arejada. Duas pontes estreitas de ágar anéis situadas perto da pele e conectadas a eletrodos Saturados KCl-calomel mediram a diferença potencial como lido....
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Protocolo
Todos os animais utilizados nesses experimentos foram mantidos na unidade de cuidados com animais da Universidade de Shizuoka e os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para pesquisas em animais estabelecidas pela Universidade de Shizuoka. Todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Shizuoka (Licenças #205272 e #656-2303).
1. Preparação de eletrodos NaCl
NOTA: Os eletrodos utilizados nestes experimentos consistem em NaCl concentrado ou KCl. Os eletrodos KCl/calomel são comprados comercialmente. Antes de iniciar o experimento, cer....
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Resultados
Os resultados apresentados neste artigo são resultados que fizeram parte de um projeto maior que foi concluído (ver ref.4,23,24).
A condutância elétrica transeptelial do intestino delgado é diminuída em cldn15-/- camundongos.
A condutância transmucosal da linha de base (sob condições de curto-circuito) do segmen.......
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Discussão
Neste experimento, as câmaras de Ussing foram usadas para medir os parâmetros elétricos da linha de base e o potencial de diluição de NaCl no intestino delgado de camundongos Cldn15-/- e WT. É muito importante ao fazer experimentos de câmara de Ussing para verificar se a preparação da membrana usada nos experimentos é viável. Isso geralmente é feito adicionando glicose ou o ativador de cíclase adenílato forskolin e vendo se há um aumento apropriado no Isc (100-300 μA/cm2.......
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Divulgações
Os autores não têm potenciais conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é suportado por 17K00860 (para HH) e 19K20152 (para NI). A WH gostaria de reconhecer a Fundação bolsa Otsuka Toshimi por seu apoio financeiro de 2018-2021.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #3 tubo de polietilo | Hibiki | diâmetro externo 1,0 mm; diâmetro interno 0,5 mm | |
| #7 tubo de polietila | Hibiki | diâmetro externo 2,3 mm; diâmetro interno 1,3 mm | |
| Seringa de travamento de 10 mL | Terumo | SS-10LZ | As seringas de travamento são necessárias para evitar que a agulha se desloque durante o enchimento da agulha de |
| 19 g | Terumo | NN-1938R | Tenha cuidado ao trabalhar com agulhas e descarte em recipiente para objetos cortantes Agulha |
| 23 g | Terumo | NN-2332R | Tenha cuidado ao trabalhar com agulhas e descarte em recipiente para objetos cortantes |
| Perfurador de 5 mm | NA | NA | Use para fazer furos em papel de filtro e |
| agulhas de acupuntura | Seirin | NS | Usado como pinos de dissecação para fixar o tecido na placa de dissecação |
| Ágar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Clipes jacaré | NA | NA | Conecta o eletrodo ao amplificador |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Manitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | Isso é usado para corrigir a diferença de osmolalidade na diluição HEPES tampão |
| D(+)-Glicose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Kit de | Você vai precisar de tesouras e pinças curvas | ||
| dissecação | Usamos placas de cultura de células de 10 cm e cobertas com borracha de silicone | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | Para fazer estoque de forscolina |
| Gravador elétrico | TOA Electronics | PRR-5041 | Outros gravadores elétricos equivalentes estão disponíveis comercialmente |
| Amplificador de grampo de tensão epitelial | Nihon Kohden | CEZ9100 | Outros amplificadores equivalentes estão disponíveis commericamente |
| papel de filtro, cortado em quadrados | NA | NA | Perfurado com um punção de 5 mm, usado para segurar a preparação intestinal |
| pinça fina | Fast Gene | FG-B50476 | Para dissecção romba da camada muscular |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Faça estoque de 10 mM em DMSO, a concentração final será de 10 µ M |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indometacina | Sigma I7338-5G | Faça um estoque de 1 mM em 21 mM NaHCO3, a concentração final é de 10 µ M | |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/eletrodo de calomelano | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto químico | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamina | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Gás Misto (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Usado para borbulhar solução de Ringer e câmaras ao usar solução de Ringer | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| Eletrodo de NaCl | NA | NA | Eletrodos artesanais que requerem NaCl concentrado e fio de prata |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gás | Shizuoka Oxygen Company | Usado para câmaras borbulhantes ao usar o parafilme de tampão HEPES | |
| Bemis | PM-996 | Usado para ajudar a selar o medidor de pH das câmaras Ussing | |
| DKK-TOA Corp | HM-305 | O tampão HEPES precisa ser ajustado para pH 7,4 a 37 ° | |
| Eletrodo medidor de pH | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| borracha de silicone | Shinetsu Chemical | KE-12 | Usado para encher placas de dissecação |
| fio | Usado para fazer eletrodos de NaCl | ||
| Pequenos frascos com tampas de plástico | NA | NA | Uso para eletrodos de NaCl |
| estereomicroscópio | Zeiss | Stemi 305 | Um estereomicroscópio permite que você veja a profundidade, para que você possa dissecar o tecido mais facilmente |
| Tris (base Trizma) | Sigma | T1503-1KG | Faça uma solução de 1M para ajustar o pH dos tampões HEPES |
| Câmaras de Ussing | Sanki Kagaku Kougei | Estas câmaras são câmaras de perfusão contínua feitas sob medida com um diâmetro de janela de 5 mm | |
| Bomba de água e sistema de aquecimento | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
Referências
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M.
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Reimpressões e permissões
