Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.
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Artigo de método
Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Megacariócitos de medula óssea são grandes células poliploides que garantem a produção de plaquetas sanguíneas. Elas surgem de células-tronco hematopoiéticas através de megacaripoiesis. As etapas finais deste processo são complexas e classicamente envolvem os progenitores megacariócitos bipotentes -Eritrócitos (MEP) e os progenitores megacayócitos unipotentes (MKp). Essas populações precedem a formação de megacaiócitos de boa fé e, como tal, seu isolamento e caracterização poderiam permitir a análise robusta e imparcial da formação de megacaiócitos. Este protocolo apresenta em detalhes o procedimento para coletar células hematopoiéticas da medula óssea do rato, o enriquecimento de progenitores hematopoiéticos através do esgotamento magnético e, finalmente, uma estratégia de classificação celular que produz populações altamente purificadas de MEP e MKp. Primeiro, as células de medula óssea são coletadas do fêmur, da tíbia, e também da crista ilíaca, um osso que contém um alto número de progenitores hematopoiéticos. O uso de ossos de crista ilíaca aumenta drasticamente o número total de células obtidas por camundongo e, portanto, contribui para um uso mais ético dos animais. Um esgotamento da linhagem magnética foi otimizado usando contas magnéticas de 450 nm permitindo uma classificação celular muito eficiente por citometria de fluxo. Por fim, o protocolo apresenta a estratégia de rotulagem e gating para a classificação das duas populações progenitoras megacarióficas altamente purificadas: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) e MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Esta técnica é fácil de implementar e fornece material celular suficiente para realizar i) caracterização molecular para um conhecimento mais profundo de sua identidade e biologia, ii) ensaios de diferenciação in vitro, que proporcionarão uma melhor compreensão dos mecanismos de maturação de megacaiócitos, ou iii) modelos in vitro de interação com seu microambiente.
Introdução
Plaquetas de sangue são produzidas por megacariócitos. Estas grandes células poliploides estão localizadas na medula óssea e, como em todas as células sanguíneas, elas são derivadas de Células-Tronco Hematopoiéticas (HSC)1. O caminho clássico de produção de megacaiócitos na medula óssea tem origem no HSC e envolve a geração de diferentes progenitores que restringem progressivamente seu potencial de diferenciação2. O primeiro progenitor a assinar o compromisso com a linhagem megacariocítica é o Progenitor megacarito-eritrócito (MEP), um progenitor bipotente capaz de produzir células eritrógradas e megacariócitos
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Protocolo
Os protocolos envolvendo animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Número de licença: E67-482-10).
1. Coleção de ossos de rato
- Sacrifique o animal em conformidade com as diretrizes institucionais.
NOTA: Os dados apresentados neste manuscrito foram obtidos de camundongos C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de idade. O número de células obtidas, e a frequência das populações citadas podem variar de acordo com a idade e a cepa do rato. - Pulverize o corpo com 70% de etanol.
- Com a....
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Resultados
A análise fenotípica das células identificadas como MEP e MKp foram realizadas por citometria de fluxo. As células foram rotuladas com anticorpos conjugados de fluorescência para CD41a e CD42c, marcadores clássicos das linhagens megacariocíticas e plaquetas. Ambos os marcadores foram expressos pelas células da população de MKp, enquanto esses marcadores ainda não foram detectados na superfície das células da população do MEP(Figura 4Ai,4Aii). Poliploidia é uma marca registra.......
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Discussão
O método descrito neste artigo permite a extração e purificação do mouse MEP e MKp. Um parâmetro importante na otimização do protocolo foi a obtenção de número suficiente de células compatíveis com a maioria dos ensaios moleculares e celulares. A prática geral da coleta de ossos de camundongos para extração de células hematopoiéticas geralmente consiste na colheita dos fêmures e tíbias de cada rato. O osso pélvico, outra fonte de material hematopoiético, é, portanto, muitas vezes negligenciado. As razões para não coletar.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem Monique Freund, Catherine Ziessel e Ketty pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), e por Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| agulhas de calibre 21 | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Anticorpo Gr-1-biotina | eBioscience | 13-5931-85 | Depleção magnética |
| Anticorpo B220-biotina | eBioscience | 13-0452-85 | Depleção magnética |
| Anticorpo Mac-1-biotina | eBioscience | 13-0112-85 | Magnético depleção |
| Anticorpo CD3e-biotina | eBioscience | 13-0031-85 | Depleção magnética |
| Anticorpo CD4-biotina | eBioscience | 13-9766-82 | Depleção magnética |
| Anticorpo CD5-biotina | eBioscience | 13-0051-85 | Depleção magnética |
| Anticorpo CD8a-biotina | eBioscience | 13-0081-85 | Anticorpo de depleção magnética |
| TER119-biotina | eBioscience | 13-5921-85 | Anticorpo de depleção magnética |
| CD127-biotina | eBioscience | 13-1271-85 | Anticorpo de depleção magnética |
| CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Anticorpo de classificação de células |
| CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Anticorpo de classificação de células |
| TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Classificação de células |
| Anticorpo CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Anticorpo de classificação de células |
| CD45-biotina | eBioscience | 13-0451-85 | Anticorpo de classificação de células |
| CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Anticorpo de classificação de células |
| c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Anticorpo de classificação de células |
| Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Anticorpo de classificação de células |
| CD16 / 32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Anticorpo de classificação de células |
| CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Classificação de células |
| Meio de cultura StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Almofada de dissecção | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Etanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Fórceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Pipeta de pasteur de vidro | Dutscher | 42011 | |
| Ímã : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Contas magnéticas: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solução | BD Bioscience | 555899 | |
| Bisturis | Fisher Scientific 12308009 | ||
| Tesoura | Euronexia | C-165-ASB | |
| Seringas estéreis de 1 mL | BD Bioscience | 303172 | |
| Tubos estéreis de 15mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Tubos estéreis de polipropileno de 5mL | Falcon | 352063 | |
| Tubos estéreis de poliestireno 5mL | Falcon | 352054 | |
| Tubos estéreis com 70µ tampão do filtro da pilha de m | Falcon | 352235 | |
| placa de Petri estéril | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Rolo do tubo | Benchmark Scientific | R3005 |
Referências
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
