Reconhece-se agora que o ambiente tridimensional das células pode desempenhar um papel importante em seu comportamento, maturação e/ou diferenciação. Este protocolo descreve um modelo de cultura celular tridimensional projetado para estudar o impacto da contenção física e restrições mecânicas em megacaiócitos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ambiente 3D que leva tanto ao confinamento quanto às restrições mecânicas é cada vez mais reconhecido como um importante determinante do comportamento celular. Assim, a cultura 3D foi desenvolvida para melhor abordar a situação in vivo. Os megacariócitos diferenciam-se das células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) na medula óssea (ML). O BM é um dos tecidos mais moles do corpo, confinado dentro do osso. O osso sendo pouco extensível na escala celular, megacariócitos são concomitantemente submetidos a uma rigidez fraca e alto confinamento. Este protocolo apresenta um método para a recuperação de HSPCs de linhagem de camundongos negativos (Lin-) por triagem imunomagnética e sua diferenciação em megacaiócitos maduros em um meio 3D composto de metilcelulose. A metilcelulose não é reativa em relação aos megacaiócitos e sua rigidez pode ser ajustada à da medula óssea normal ou aumentada para imitar uma medula fibrosa patológica. O processo de recuperação dos megacaitos para novas análises celulares também está detalhado no protocolo. Embora a extensão de proplato é impedida dentro do meio 3D, ela é descrita abaixo como resuspend os megacaitos em meio líquido e quantificar sua capacidade de estender proplatelets. Os megacariócitos cultivados em hidrogel 3D têm maior capacidade de formar proplatelets em comparação com aqueles cultivados em um meio líquido. Esta cultura 3D permite i) diferenciar progenitores em direção a megacaitos que atingem um estado de maturação mais elevado, ii) para recapitular fenótipos que podem ser observados in vivo, mas passam despercebidos nas culturas líquidas clássicas, e iii) para estudar vias de transdução induzidas pelas pistas mecânicas fornecidas por um ambiente 3D.
Introdução
As células do corpo experimentam um complexo microambiente 3D e são submetidas à interação entre pistas químicas e mecanofísicas, incluindo rigidez do tecido e confinamento devido às células vizinhas e matriz circundante 1,2,3. A importância da rigidez e confinamento para o comportamento celular só foi reconhecida nas últimas décadas. Em 2006, o trabalho seminal da Engler et al. 4 destacou a importância do ambiente mecânico para a diferenciação celular. Os autores demonstraram que a variação da rigidez do substrato celular resultou na orientação das células-tronco para várias linhagens de diferenciação. Desde então, o impacto das pistas mecânicas sobre o destino e o comportamento celular tornou-se cada vez mais reconhecido eestudado. Apesar de ser um dos tecidos mais moles do organismo, a medula óssea tem uma organização estrutural 3D que está confinada dentro do osso. A rigidez da medula, embora tecnicamente difícil de medir com precisão, é estimada entre 15 e 300 Pa 5,6. Dentro do estroma, as células estão bem confinadas umas às outras. Além disso, a maioria deles está migrando em direção aos vasos sinusoides para entrar na circulação sanguínea. Essas condições criam restrições mecânicas adicionais em células adjacentes, que têm que se adaptar a essas forças. As pistas mecânicas representam um parâmetro importante cujas consequências sobre a diferenciação de megacariote e a formação de proplatelets foram recentemente exploradas. Embora os megacaiócitos possam diferenciar in vitro na cultura líquida tradicional, eles não atingem o grau de maturação observado in vivo,em parte devido à ausência das pistas mecânicas do ambiente 3D 7. Progenitores em crescimento embutidos em hidrogel traz pistas mecânicas 3D que estão faltando em meio líquido.
Hidrogéis têm sido amplamente utilizados por várias décadas no campo hematológico, notadamente para cultivar células em colônias formando ensaios para quantificar progenitores hematopoiéticos. No entanto, esses hidrogéis raramente têm sido usados para explorar o impacto biológico do ambiente mecânico 3D na maturação e diferenciação das células hematopoiéticas. Nos últimos anos, nosso laboratório desenvolveu um modelo de cultura 3D usando um hidrogel à base de metilcelulose 8. Este gel físico não reativo é uma ferramenta útil para imitar as restrições físicas do ambiente de megacaiócito nativo. É derivado da celulose pela substituição de resíduos de hidroxílico (-OH) por grupos de metoóxido (-OCH3). Tanto o grau de substituição de metila quanto a concentração de metilcelulose determinam a rigidez do hidrogel uma vez que tenha gelatinado. Durante a fase de desenvolvimento desta técnica, foi demonstrado que o módulo de um Young na faixa de 30 a 60 Pa é a rigidez de gel ideal para o crescimento de megacariocíte 9.
O protocolo a seguir descreve um método para cultivar progenitores megacariocíticos de camundongos em um hidrogel de metilcelulose 3D. Foi demonstrado anteriormente que, em comparação com a cultura líquida padrão, essa cultura de hidrogel aumenta o grau de poliploidização de megacaitos, melhora a maturação e organização intracelular, e aumenta a capacidade de megacaiócitos para estender proplatelets uma vez resuspended em um meio líquido 9. Este manuscrito descreve em detalhes o protocolo para o isolamento das células lin- da medula óssea do rato e sua incorporação em um hidrogel de metilcelulose para cultura 3D, bem como a quantificação de sua capacidade de produzir proplatas e a recuperação das células para análises posteriores.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os experimentos devem ser realizados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os protocolos exibidos no vídeo foram realizados em estrita conformidade com a lei europeia e as recomendações do Conselho de Revisão do Etablissement Français du Sang (EFS). Uma primeira versão deste protocolo foi originalmente publicada em 2018 em Métodos em Biologia Molecular 8.
NOTA: A Figura 1 apresenta uma visão esquemática de todo o processo. Este processo inclui 1) dissecção óssea, recuperação de medula e isolamento mecânico de células de medula, 2) classificação magnética de células negativas de linhagem (Lin-) células, 3) semeadura em hidrogel líquido ou metilcelulose, e 4) resuspensão de megacaitos cultivados em gel 3D para exame da formação de propetato em meio líquido.
1. Coleta óssea de ratos adultos
NOTA: Nesta seção, é importante minimizar a contaminação microbiana.
- Prepare um tubo de 15 mL para coleta óssea com o Médio Modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco contendo 1% do volume total de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG) mistura de antibióticos (penicilina 10000 U/mL, estreptomicina 100000 μg/mL e L-glutamina 29,2 mg/mL).
NOTA: Se todos os camundongos utilizados tiverem o mesmo genótipo, acumule todos os ossos no mesmo tubo contendo 1 mL de DMEM - PSG 1% por número de camundongos. Antibióticos são importantes para evitar a possível proliferação de bactérias durante o tempo de amostragem óssea. - Encha um tubo de 50 mL com etanol 70% para desinfecção óssea e outro para lavagem de instrumentos durante o procedimento. Use instrumentos de dissecção esterilizados.
- Anestesiar os camundongos usando inalação de isoflurana (4%) e rapidamente proceder à luxação cervical para eutanásia dos camundongos. Imerque rapidamente o corpo em 70% de etanol para desinfetar e evitar contaminação microbiana.
- Disseca rapidamente as tíbias e os fêmures.
- Usando um bisturi, corte as epífitas da extremidade lateral do tornozelo para a tíbia e da extremidade do quadril para o fêmur.
- Mergulhe os ossos por um segundo em 70% de etanol antes de imergi-los no meio DMEM contendo 1% de PSG.
2. Dissociação de medula e isolamento de células Lin
NOTA: Esta parte do protocolo é realizada sob um capô de fluxo laminar. Para uma cultura, todos os poços fazem parte do mesmo experimento e não podem ser considerados como réplicas biológicas independentes. As células de todos os camundongos são agrupadas para garantir a homogeneidade de todos os poços e para serem capazes de compará-los uns com os outros, eliminando uma possível variabilidade inter-individual. Para réplicas biológicas independentes, a cultura deve ser repetida.
- Coloque os ossos em uma placa de Petri e levante-os duas vezes na solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco para remover potenciais contaminantes.
- Prepare dMEM - 1% PSG em um tubo de 50 mL.
NOTA: Forneça 2 mL de DMEM - 1% PSG por camundongos usados para o experimento. - Encha uma seringa de 5 mL equipada com uma agulha de calibre 21 com DMEM - 1% PSG.
- Segurando o osso com fórceps, introduza apenas o bisbilhotamento da agulha na extremidade lateral do joelho.
NOTA: A epífise lateral do joelho deve permanecer intacta a partir da dissecção, deixando uma pequena cavidade em seu centro através da qual inserir a agulha. A epífise restante manterá o osso preso à agulha durante a descarga. Tenha cuidado para não introduzir mais do que o chanfrado no osso, pois pode esmagar e danificar a medula. - Pressione rapidamente o êmbolo da seringa para lavar a medula em um tubo de 50 mL.
NOTA: Para evitar respingos e facilitar a descarga e liberação da medula coloque a extremidade livre do osso na parede do tubo, imersa em DMEM - 1% PSG. Na prática, um volume entre 500 μL e 1 mL é geralmente suficiente para expulsar a medula do osso. Quando a medula foi totalmente expelida, o osso ficou branco. Caso a medula não tenha sido totalmente expulsa da diáfise como julgada por alguma cor vermelha remanescente, é possível repetir a descarga com meio fresco. - Repita os passos 2.4. e 2,5. para todos os ossos, reabastecendo a seringa de 5 mL com DMEM - 1% PSG, se necessário.
- Use a mesma seringa de 5 mL com a agulha de 21 medidores para transferir o volume total de medula lavada em tubos de 10 mL com fundo redondo.
NOTA: Não é absolutamente necessário mudar para um tubo de 10 mL com fundo redondo, mas facilita a ção para as seguintes etapas de dissociação. Não hesite em trocar seringa e/ou agulha se houver suspeita de risco de contaminação. - Prossiga para a dissociação celular aspirando e expulsando as células médias e de medula sucessivamente duas vezes através de uma agulha de calibre 21, três vezes através de um calibre 23 e uma vez através de uma agulha de calibre 25.
NOTA: Evite bolhas de ar, pois pode ser prejudicial para as células. - Transfira a suspensão para tubos de 15 mL.
- Meça o número do celular e verifique a viabilidade usando um contador celular automatizado ou uma câmara celular para contagem manual na presença de azul trypan para excluir células mortas.
- Centrifugar os tubos de 15 mL por 7 min a 300 x g. Usando uma pipeta de transferência de 1 mL, cuidadosamente pipeta para fora e descartar o supernatante.
- Isolar células de haste e progenitor por classificação imunomagnética negativa usando um kit de isolamento de células hematopoiéticas do rato.
NOTA: O objetivo desta classificação celular é recuperar as células negativas para todos os anticorpos de seleção (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) e, portanto, eliminar as células que já estão engajadas em uma linhagem diferenciada diferente da megacariocítica. - Seguindo as instruções do kit, resuspenque a pelota celular em m médio recém-preparado (PBS com 2% do volume final de soro bovino fetal (FBS), EDTA 1 mM) a uma concentração de 1 × 108 células/mL e distribua a suspensão em tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL a um volume máximo de 2 mL.
- Adicione aos tubos de poliestireno: soro de rato normal a uma concentração de 50 μL/mL, bem como a mistura de anticorpos biotiningados (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) a uma concentração de 50 μL de mix por mL e homogeneizar suavemente os tubos.
NOTA: Esses anticorpos se ligarão a células já engajadas em uma via de diferenciação, exceto a via megacariocítica. - Incubar os tubos no gelo por 15 minutos.
- Adicione contas magnéticas revestidas de streptavidin a uma concentração de 75 μL/mL e homogeneize-se movendo suavemente os tubos.
- Incubar novamente no gelo por 10 minutos.
- Se necessário, ajuste a um volume final de 2,5 mL por tubo com meio M.
- Homogeneize a suspensão apertando suavemente o tubo pouco antes de colocá-los, sem as tampas, dentro de um ímã e esperar por três minutos.
NOTA: As células já engajadas em uma via de diferenciação e revestidas com contas magnéticas serão retidas na parede do tubo dentro do ímã. - Inverta ímã e tubo para transferir o conteúdo do tubo para um novo tubo de poliestireno de 5 mL com fundo redondo.
NOTA: Não tire o tubo do ímã para a transferência; é feito invertendo o ímã com o tubo ainda dentro. Use um movimento constante e não agite o tubo. - Descarte o tubo inicial contendo células de rótulo magnético indesejados e coloque o novo, sem sua tampa, no ímã por mais três minutos.
- Procedendo como na etapa 2.20, transfira as células Lin- isoladas para um novo tubo de 15 mL.
NOTA: Se vários tubos de poliestireno de 5 mL foram usados para as etapas anteriores, acumule todas as células no mesmo tubo de 15 mL. As células recuperadas após a triagem celular são células-tronco hematopoiéticas e progenitores. A presença de trombopoietina (TPO), o principal regulador fisiológico da megacariopoiese 10,direcionará a diferenciação celular para a linha celular megacariocítica. - Meça o número da célula Lin e a viabilidade como na etapa 2.10.
- Calcule o volume necessário de suspensão celular para centrífuga para ter 1 x 106 células viáveis x Número de Poço, Bem Número sendo o número de poços para sementes por condição.
- Prepare um tubo por condição com o volume apropriado de suspensão celular e centrífuga a 300 x g por 7 min.
- Para culturas líquidas, descarte o supernasce e resuspenque a pelota celular em meio de cultura completa (DMEM, PSG 1% do volume final, FBS 10% do volume final, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) para alcançar a concentração final de 2 × 106 células viáveis/mL (igual a 1 × 106 células por 500 μL bem). Incubar as células a 37 °C abaixo de 5% de CO2. (= dia 0 de cultura)
NOTA: Veja o próximo parágrafo para culturas de metilcelulose Como exemplo, para preparar meio de cultura completa para um bem, use 435 μL de DMEM, 50 μL de 100% FBS para final de 10%, 5 μL de 100% PSG para 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL para final de 100 U/mL e 5 μL de 5 μg/mL TPO para 50 ng/mL final. Placas de cultura de 4 poços ou 24 poços são tipicamente usadas, pois seu diâmetro de poço é um bom ajuste para os 500 μL necessários por poço.
3. Incorporação celular em hidrogel de metilcelulose
NOTA: Observe que o protocolo a seguir descreve o método para obter um único poço de cultura de células hidrogel, adaptar-se ao número de poços necessários.
- Descongele 1 mL de solução de estoque de metilcelulose a temperatura ambiente. Prepare uma alíquota extra separada de metilcelulose para revestimento de seringa.
NOTA: Em uma concentração de 3%, a metilcelulose permanece líquida à temperatura ambiente (20-25 °C). - Cubra uma seringa de bloqueio Luer de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 18 com metilcelulose, desenhando 1 mL de metilcelulose da alíquota extra. Expulse totalmente o metilcelulose.
NOTA: Esta etapa de revestimento garante que o volume de metilcelulose coletado na etapa 3.3 seja exato. - Com a mesma seringa e agulha, mas utilizando uma nova alíquota de metilcelulose, desenhe o volume apropriado de metilcelulose(Figura 2A).
NOTA: Para alcançar uma concentração final de 2% de metilcelulose em um volume final de 500 μL por poço, é necessário 333 μL de 3% de metilcelulose. - Remova com cautela a agulha. Utilizando fórceps esterilizados, enrosque um conector de trava Luer na extremidade da seringa (Figura 2B-C).
- Conecte uma segunda seringa de bloqueio Luer de 1 mL ao conector de bloqueio Luer, a fim de conectar as duas seringas(Figura 2D).
NOTA: Não há necessidade de revestir esta segunda seringa. - Distribua igualmente o volume de metilcelulose entre as duas seringas(Figura 2E) e coloque-as de lado até o passo 3.11.
- Prepare o meio de cultura DMEM concentrado de modo a obter no volume final de metilcelulose (etapa 3.11) uma concentração idêntica à do meio de cultura líquida para cada composto (PSG 1% do volume final, FBS 10% do volume final, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
- Prepare 167 μL de cultura concentrada por poço final de 1 × 106 células. Esse volume médio é calculado de modo a obter uma concentração final de metilcelulose de 2%. O volume total no poço será de 500 μL (167 μL de suspensão celular em meio de cultura concentrada + 333 μL de metilcelulose) e todos os componentes terão uma concentração idêntica à dos poços líquidos.
- Como exemplo, para preparar meio de cultura completa para um poço, usar 102 μL de DMEM, 50 μL de 100% FBS para 10% final, 5 μL de 100% PSG para 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL para final de 100 U/mL e 5 μL de 5 μg/mL TPO para 50 ng/mL final. Dá um volume de 167 μL usado para resuspensar as células e com a adição de 333 μL de metilcelulose o volume final será de 500 μL.
- Após completar a etapa de centrifugação 2.26, descarte o supernasce e resuspenque a pelota celular no meio de cultura concentrada a uma razão de 1 ×10 6 células por 167 μL.
- Retire as seringas e desconecte uma delas do conector.
- Pipeta 167 μL da suspensão da célula.
- Adicione a suspensão da célula diretamente no conector da seringa(Figura 2F),certificando-se de não introduzir bolhas de ar.
NOTA: Ao adicionar a suspensão da célula, desenhe lentamente o êmbolo da seringa simultaneamente para liberar algum espaço para a suspensão da célula. - Reconecte cuidadosamente as duas seringas(Figura 2G)sem perder nenhuma suspensão na rosca do parafuso.
NOTA: Antes da reconexão, desenhe o êmbolo para deixar o conector meio vazio e deixe espaço suficiente para a segunda seringa se conectar sem que a suspensão transborde. - Homogeneize lentamente o meio de metilcelulose com a suspensão celular com dez movimentos de êmbolo entre as duas seringas(Figura 2H).
- Desenhe o volume total em uma seringa e desconecte as duas seringas, deixando o conector no vazio.
- Esvazie o conteúdo da seringa em um poço de placa de 4 poços(Figura 2I).
- Incubar as células a 37 °C abaixo de 5% de CO2 (= dia 0 de cultura).
NOTA: É possível preparar dois poços de metilcelulose com um par de seringas. Aumente em dois o volume de metilcelulose e o volume de suspensão celular para ter 2 x106 células. Após completar a etapa 3.13. distribuir o volume igualmente entre as duas seringas para ter 500 μL em cada uma delas. Desconectá-los e esvaziar o que não é o conector em uma cultura bem. Reconecte as seringas para transferir o volume daquele que manteve o conector para o outro. Desconecte as seringas, aquela com 500 μL não deve ter o conector ligado, e semear as células em uma segunda cultura bem. A metilcelulose de 3% é comprada como uma solução de estoque no Medium (IMDM) modificado da Iscove, enquanto as células concentradas são suspensas no DMEM. Testes comparativos foram feitos inicialmente para garantir que esse meio misto não tenha impacto no resultado do experimento, especialmente em comparação com a cultura líquida em 100% DMEM.
4. Ressuspensão celular para análise de proplatelet
NOTA: A análise da capacidade de formação de proplatelets deve ser realizada em condições comparáveis entre megacariócitos cultivados líquidos e metilcelulose. As restrições físicas exercidas pelo hidrogel de metilcelulose inibem a extensão proplatelet. Portanto, as células cultivadas com metilcelulose são resuspengiadas em meio líquido fresco no terceiro dia de cultura para permitir que elas ampliem proplatelets. O hidrogel de metilcelulose é um hidrogel físico que é facilmente diluído em cima da adição líquida. É importante ressaltar que, para evitar artefatos de ressuspensão e centrifugação, as células no meio líquido de controle devem ser tratadas simultaneamente da mesma forma que as células cultivadas com metilcelulose. Consulte a representação esquemática do experimento(Figura 1).
- Prepare 10 mL de DMEM - 1% PSG pré-aquecido a 37 °C em um tubo de 15 mL para cada poço para resuspend.
- Resuspensar cautelosamente as células de cada poço nos 10 mL de DMEM - 1% PSG.
NOTA: Faça suavemente vários movimentos para cima e para baixo para diluir completamente o metilcelulose. Para os poços líquidos certifique-se de coletar todas as células depositadas na parte inferior do poço. - Centrifugar os tubos 5 min a 300 × g.
- Enquanto isso, preparem o meio cultura completo (DMEM, PSG 1% do volume final, FBS 10% do volume final, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
NOTA: Nesta etapa cada poço é recuperado para ser diluído pela metade, portanto, prepare 1 mL de cultura completa por poço. - Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em 1 mL de meio de cultura para cada tubo.
- Reseed 500 μL de suspensão celular por poço em uma placa de 4 ou 24 poços e incubar a 37 °C sob 5% DE CO2.
NOTA: A partir de um poço inicial, obtenha 2 poços para visualização proplatelet em duplicata. Observe que, como essas duplicatas se originam da mesma amostra, elas não podem ser consideradas como réplicas independentes. - 24 horas após a ressedação, no 4º dia da cultura, adquira aleatoriamente 10 imagens por poço usando microscopia de campo brilhante e o objetivo × 20.
NOTA: As células tendem a se agrupar no centro do poço, certifique-se de não ter muitas células no campo, pois pode dificultar a visualização e quantificação proplatletas. Certifique-se de capturar pelo menos 5 megacaiócitos por campo. - Conte o número total de megacaiócitos e de megacaiócitos que estendem proplatelets em cada imagem e calcule a proporção de megacaiócitos que estendem proplatelets.
NOTA: A quantificação não é automatizada; executar a contagem de células manualmente. A contagem pode ser facilitada pelo uso do plugin de contador de células do ImageJ para clicar nas células, a fim de marcá-las conforme são contadas. 10 campos adquiridos por poços e poços em duplicata representam aproximadamente 150-300 megacaiócitos por condição.
5. Fixação celular e recuperação para análises futuras
ATENÇÃO: Este protocolo utiliza fixações que devem ser manuseadas sob um capô de fumaça, usando equipamentos de proteção.
NOTA: O objetivo é manter intactas as restrições de gel aplicadas nas células até que estejam totalmente fixas. Portanto, e independentemente do fixador utilizado, deve ser adicionado no poço em cima do metilcelulose, sem perturbar o gel. O mesmo protocolo é aplicado às culturas líquidas.
- Adicione um volume de solução fixação igual ao volume semeado (500 μL neste protocolo), em cima da metilcelulose sem interromper o gel. Aguarde o tempo adequado de acordo com o fixador utilizado (pelo menos 10 min).
NOTA: A difusão fixativa em todo o gel deve ser muito rápida, como revelado por uma rápida mudança na cor do gel (do rosa para um tom amarelo-laranja). Paraformaldeído (8% em DPBS, 500 μL por poço) é geralmente usado para imunolabeling, enquanto glutaraldheído (5% em tampão de cacodilato, 500 μL por poço) é usado para análise de microscopia eletrônica. - Usando uma pipeta P1000 suavemente faça várias pipetting para cima e para baixo com o fixador e o gel de modo a diluir homogêneamente o metilcelulose.
- Usando a mesma pipeta e ponta, transfira todo o volume do poço para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de DPBS e homogeneize.
- Centrifugar a mistura a 300 × g por 7 min.
NOTA: Um segundo passo de lavagem pode ser necessário para eliminar toda a metilcelulose - Descarte o supernascer e resuspenque a pelota de megacaito no meio apropriado de acordo com a análise desejada (imunolabelamento, citometria de fluxo9,microscopia eletrônica ...) (para microscopia eletrônica veja também o método de papel "In situ exploração dos principais passos da megacariopoiese usando microscopia eletrônica de transmissão" nesta edição jove).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os dados obtidos por este protocolo foram originalmente publicados no Blood em 20169.
De acordo com o protocolo, as células foram semeadas em meio de hidrogel líquido ou metilcelulose. As células em meio líquido têm todos sedimentados na parte inferior do poço, em contato com a superfície plástica rígida e em algum momento com outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea no gel e são isoladas das cél...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Na década anterior, a mecanobiologia tem levantado cada vez mais interesse em muitas áreas da biologia. É comumente reconhecido que o ambiente mecânico ao redor das células desempenha um papel em seu comportamento, enfatizando a importância de estudar como os megacaiócitos sentem e respondem a sinais mecânicos extracelulares. É desafiador medir com precisão a rigidez do tecido da medula óssea no situ11, especialmente se considerarmos a medula vermelha hematopoiética, pois está localizada ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Fabien Pertuy e Alicia Aguilar que inicialmente desenvolveram essa técnica no laboratório, bem como Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Estrasburgo) que caracterizaram as propriedades viscoelasticas do hidrogel de metilcelulose. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e por uma bolsa ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher é beneficiária da Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvenção da FRM FDT202012010422).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas de calibre 18 | de calibre | Sigma-Aldrich | |
| Agulhas de | calibre 23 | 301155 | |
| Terumo | AN*2332R1 | ||
| Agulhas de calibre 25 BD | Microlance | 300400 | |
| Placas de cultura de 4 poços | Thermo Scientific | 144444 | |
| Seringas de 5 mL | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equipados com cartões de filtro | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Centrífuga Cytospin | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen Dako DMEM | |||
| 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco Estéril' s ímãs de solução salina tampoiados com fosfato |
| EasySep | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Kit de isolamento de células progenitoras hematopoiéticas de camundongo EasySep | Stem Cell Technologies | 19856A | anticorpos biotinilados (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7– 4) e esferas magnéticas revestidas com estreptavidina |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL seringas | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | ou 309628 seringas da BD MEDICAL |
| Luer lock seringas conectores | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R& AMP; D systems | HSC001 | |
| Corrediças revestidas com polilisina | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10.000 unidades/mL penicilina, 10.000 μ g/mL de estreptomicina e 29,2 mg/mL de glutamina |
| de rato | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Hirudina recombinante | Transgè ne | rHV2-Lys47 | |
| Trombopoietina humana recombinante (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10.000 unidades/mL |
| Tubos plásticos de 10 mL com fundo redondo Falcon | 352054 | ||
| Tubos |
Referências
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
