Method Article

Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a extração de compostos orgânicos voláteis de uma amostra biológica com o método de extração sorbent assistido a vácuo, cromatografia gasosa juntamente com espectrometria de massa usando o Entech Sample Preparation Rail e análise de dados. Também descreve a cultura de amostras biológicas e sondagem de isótopos estáveis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Compostos orgânicos voláteis (VOCs) de amostras biológicas têm origens desconhecidas. Os VOCs podem se originar do hospedeiro ou de diferentes organismos de dentro da comunidade microbiana do hospedeiro. Para desembaraçar a origem dos VOCs microbianos, foram realizadas análises voláteis do espaço da cabeça de monoculturas bacterianas e co-culturas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, e testes estáveis de isótopos em amostras biológicas de fezes, saliva, esgoto e espito. Monoculturas foram utilizadas para identificar a produção volátil de espécies bacterianas individuais ou em combinação com a sondagem de isótopos estáveis para identificar o metabolismo ativo dos micróbios das amostras biológicas.

A extração sorbent assistida a vácuo (VASE) foi empregada para extrair os VOCs. O VASE é um método de extração de espaço livre de solventes fácil de usar, comercializado e livre de solventes para compostos semi-voláteis e voláteis. A falta de solventes e as condições de quase vácuo utilizadas durante a extração tornam o desenvolvimento de um método relativamente fácil e rápido quando comparado a outras opções de extração, como tert-butylation e microextração de fase sólida. O fluxo de trabalho descrito aqui foi usado para identificar assinaturas voláteis específicas de mono-e co-culturas. Além disso, a análise da sondagem estável de isótopos de amostras biológicas associadas humanas identificou CODs comumente ou exclusivamente produzidos. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho geral e considerações experimentais do VASE em conjunto com a sondagem estável de culturas microbianas vivas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Compostos orgânicos voláteis (VOCs) têm grande promessa de detecção e identificação bacteriana porque são emitidos de todos os organismos, e diferentes micróbios têm assinaturas exclusivas de VOC. Moléculas voláteis têm sido utilizadas como uma medida não invasiva para a detecção de várias infecções respiratórias, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica1, tuberculose2 na urina3 e pneumonia associada ao ventilador4, além de distinguir indivíduos com fibrose cística (CF) de indivíduos de controle saudável 5,6. Assinaturas voláteis têm sido usadas até mesmo para distinguir infecções específicas de patógenos em CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). No entanto, com a complexidade dessas amostras biológicas, muitas vezes é difícil identificar a fonte de VOCs específicos.

Uma estratégia para desembaraçar os perfis voláteis de micróbios infecciosos múltiplos é realizar a análise do espaço da cabeça de microrganismos tanto na mono-quanto na cocultura11. A análise do headspace examina os analitos emitidos no "headspace" acima de uma amostra em vez daqueles incorporados na própria amostra. Metabólitos microbianos têm sido frequentemente caracterizados em monoculturas devido à dificuldade em determinar a origem dos metabólitos microbianos em amostras clínicas complexas. Ao traçar perfis voláteis de monoculturas bacterianas, os tipos de voláteis que um micróbio produz in vitro podem representar uma linha de base de seu repertório volátil. A combinação de culturas bacterianas, por exemplo, a criação de co-culturas e o perfil das moléculas voláteis produzidas podem revelar as interações ou a alimentação cruzada entre as bactérias12.

Outra estratégia para identificar a origem microbiana de moléculas voláteis é fornecer uma fonte de nutrientes que é rotulada com um isótopo estável. Isótopos estáveis são formas não radioativas de átomos com um número diferente de nêutrons. Em uma estratégia que vem sendo utilizada desde o início da década de 1930 para traçar o metabolismo ativo em animais13, o microrganismo se alimenta da fonte de nutrientes rotulado e incorpora o isótopo estável em suas vias metabólicas. Mais recentemente, um isótopo estável na forma de água pesada (D2O) tem sido usado para identificar S. aureus metabolicamente ativo em uma amostra clínica de escarro CF14. Em outro exemplo, a glicose com 13C foi usada para demonstrar a alimentação cruzada de metabólitos entre os isolados clínicos cf de P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .

Com o avanço das técnicas de espectrometria de massa, os métodos de detecção de pistas voláteis passaram de observações qualitativas para medidas mais quantitativas. Usando espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), o processamento de amostras biológicas tornou-se ao alcance da maioria dos ambientes laboratoriais ou clínicos. Muitos métodos para levantamento de moléculas voláteis têm sido usados para traçar o perfil de amostras como alimentos, culturas bacterianas e outras amostras biológicas, e ar e água para detectar contaminação. No entanto, vários métodos comuns de amostragem volátil com alto rendimento exigem solvente e não são realizados com as vantagens proporcionadas pela extração a vácuo. Além disso, volumes ou quantidades maiores (superiores a 0,5 mL) de materiais amostrados são frequentemente necessários para análisede 15,16,17,18,19, embora isso seja específico do substrato e exija otimização para cada tipo e método de amostra.

Aqui, a extração sorbent assistida a vácuo (VASE) seguida de desorção térmica em um GC-MS foi empregada para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e coculturas e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro (Figura 1). Com quantidades amostrais limitadas, os VOCs foram extraídos de apenas 15 μL de escarro. Experimentos de sondagem de isótopos com amostras humanas exigiram a adição de uma fonte estável de isótopos, como glicose de 13C, e mídia para cultivar o crescimento da comunidade microbiana. A produção ativa de voláteis foi identificada como uma molécula mais pesada pelo GC-MS. A extração de moléculas voláteis sob um vácuo estático permitiu a detecção de moléculas voláteis com maior sensibilidade 20,21,22.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerações de análise de amostras

NOTA: O HSP contendo o sêrbent Tenax TA foi selecionado para capturar uma ampla gama de voláteis. Tenax tem uma menor afinidade com a água em comparação com outros sorbents, o que lhe permite capturar mais VOCs de amostras de maior umidade. Tenax também tem um baixo nível de impurezas e pode ser condicionado para reutilização. A seleção sorbent também foi feita em consideração com a coluna instalada no GC-MS (ver a Tabela de Materiais).

  1. Gerar controles negativos extraindo mídia e/ou amostrar em branco com as mesmas condições utilizadas para extração de amostras.
  2. Analise um HSP em branco (previamente confirmado como limpo e livre de fundo significativo) no GC-MS antes de analisar amostras extraídas. Passar em branco entre os tipos de amostra (por exemplo, três réplicas de bactérias monocultura, em branco, três réplicas de co-cultura de bactérias, em branco, etc.).
  3. Limitar o uso de itens de cuidados pessoais perfumados ou o consumo de alimentos fedidos antes da extração e análise da amostra. O ideal é preparar amostras em um capuz de biossegurança que não tenha sido limpo por álcool ou outros produtos de limpeza voláteis por pelo menos 30 minutos. Ligue o fluxo de ar no capô da biossegurança por 30-60 minutos antes da preparação da amostra.
  4. Mantenha amostras no gelo para limitar a liberação volátil durante a preparação da amostra.

2. Preparação mono e co-cultura

  1. No capô da biossegurança, culturas inoculadas de A. baumannii, S. aureus e P. aeruginosa na mídia de crescimento de Todd Hewitt. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação de 200 rpm.
  2. Após a incubação da noite para o dia, realize o manuseio da cultura no capô da biossegurança. Diluir cada cultura à densidade óptica 0,05 a 500 nm.
  3. Misture co-culturas em partes iguais, e pipeta 200 μL de mídia de controle, mono-, ou co-cultura em cada poço de uma placa de 96 poços, e coloque em incubadora de 37 °C por 24 horas. Prepare uma segunda placa para uma incubação de 48 h.
  4. Ao final do período de incubação, prepare amostras para extração na seção 4. Culturas líquidas pipetas em tubos de microcentrifuuuagem e armazenam a -80 °C.
    NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C para extrair mais tarde, se necessário.

3. Sondagem de isótopos estáveis na preparação de amostras biológicas

NOTA: As fezes e amostras de saliva foram doadas de doadores anônimos com aprovação do Conselho de Revisão Institucional irvine da Universidade da Califórnia (HS# 2017-3867). O esgoto veio de San Diego, CA. As amostras de escarro foram coletadas de sujeitos com fibrose cística como parte de um estudo maior aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan (HUM00037056).

  1. Realize todas as preparações de amostras biológicas no capô da biossegurança.
    1. Para preparar amostras fecais, adicione 1 mL de água deionizada a 100 mg de fezes em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e vórtice por 3 min. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
      1. A 15 μL de mistura fecal e de água, adicione 485 μL de meio de Infusão cerebral (BHI) com 20 mM 13C de glicose, ou BHI com 30% de deutério (D2O). Certifique-se de que o volume final da amostra seja de 500 μL. Prepare amostras em triplicados técnicos.
    2. Para preparar amostras de esgoto, adicione 500 μL de esgoto a 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose ou BHI com 30% D2O para um volume total de 1 mL. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
    3. Para preparar amostras de saliva, adicione 50 μL de saliva a 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose ou BHI com 30% D2O para um volume total de 550 μL. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
    4. Para preparar amostras de escarro para comparar os voláteis presentes na amostra antes e depois da colheita, realize uma primeira extração com 15 μL de escarro. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso. Prossiga para a seção 4 para extração amostral e extraia por 18 h a 37 °C com agitação de 200 rpm.
    5. Após a conclusão da primeira extração das amostras de escarro nãoculturadas, salve os frascos com escarro. Adicione 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose aos frascos com escarro de 3,5,1. Coloque no gelo quando não estiver em uso.
  2. Prossiga para a seção 4 para extração amostral.

4. Extração da amostra

  1. Coloque frascos de análise orgânica volátil vazio (VOA) (20 mL) na placa fria e coloque a placa fria no gelo no capô da biossegurança.
  2. Ligue a unidade de extração de caneta sorbent 5600 (SPEU) e ajuste à temperatura desejada conforme necessário para cada método.
    NOTA: Para experimentos de sondagem de isótopos estáveis a 37 °C, atingir o ponto de setpoint pode levar até 15 min. Para experimentos mono e co-cultura a 70 °C, chegar ao setpoint pode levar até 60 min.
  3. Colete HSPs limpos que sejam iguais ao número de amostras preparadas, incluindo HSPs para controles de mídia ou amostra.
  4. Rotular frascos VOA de 20 mL de acordo com amostras, réplicas e IDs HSP conforme necessário. Use um marcador que resista à água no caso de condensação se formar na parte externa do frasco enquanto estiver no gelo.
  5. Dentro do capô de biossegurança, desaparafusar a tampa branca no frasco, rapidamente tubos amostrado no frasco, e montar a tampa preta, forro de tampa e HSP.
    NOTA: As amostras não devem entrar em contato com o HSP, e o volume da amostra dependerá do tipo de amostra.
  6. Coloque o frasco contendo a amostra e o HSP de volta na placa fria.
  7. Repita as etapas 4.5 e 4.6 para cada amostra. Execute essas etapas por amostra em vez de todas de uma vez para evitar o aquecimento da amostra e, portanto, a liberação volátil prematura.
  8. Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas nos frascos de vidro, realize os seguintes passos fora do capô de biossegurança no banco. Ligue a bomba de vácuo, coloque os frascos sob vácuo até 30 mmHg e remova a fonte de vácuo.
    NOTA: Os frascos não precisam estar na bandeja fria após a aplicação do vácuo ter sido concluída.
  9. Verifique novamente a pressão depois de colocar todas as amostras sob vácuo usando o medidor de pressão. Se um frasco tiver um vazamento, certifique-se de que a tampa está aparafusada firmemente, e que os anéis O brancos do HSP e dos forros da tampa estejam corretamente no lugar.
    NOTA: Um selo comprometido pode resultar em diminuição da detecção volátil em comparação com um frasco sob vácuo.
  10. Coloque frascos na SPEU para o tempo e temperatura otimizados com agitação a 200 rpm. Extrair culturas por 1h a 70 °C. Extrair experimentos de sondagem de isótopos estáveis com amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro por 18 h a 37 °C.
  11. Coloque a placa fria a -80 °C para uso após o período de extração estiver completo.
  12. Quando a extração estiver completa, coloque amostras na placa fria por 15 minutos para extrair vapor de água do HSP e do espaço para a cabeça do frasco.
  13. Transfira os HSPs para as mangas.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui por até ~1 semana em temperatura ambiente antes de perder os compostos mais altamente voláteis dos HSPs.

5. Analisar amostras na cromatografia gasosa - espectrômetro de massa (GC-MS)

  1. Use as seguintes configurações GC-MS (veja a Tabela de Materiais): 35 °C com uma carga de 5 minutos, rampa de 10 °C/min a 170 °C e uma rampa de 15 °C/min para 230 °C com uma proporção de 20:1 e um tempo total de execução de 38 min.
  2. Defina o método de desorção da seguinte forma: 2 min, 70 °C pré-aqueça; 2 min 260 °C desorção; 34 min, 260 °C bakeout; e 2 min, 70 °C pós assado.
  3. Configure a sequência de amostras e inicie a execução de acordo com a instrumentação.
    1. Para configurar uma sequência no Software Entech, abra o programa. Nas opções à direita do menu suspenso do instrumento, selecione 5800 | Sequência.
    2. Observe a tabela de sequência no software Entech semelhante ao do software GC-MS. Nomeie a coluna Sample ID de acordo com o número de date_vial atual. Tenha em mente que o nome é análogo ao nome na tabela de sequência GC-MS, e o método 5800 determina a taxa de rampa de temperatura, tempos de retenção, etc. (abre um menu para selecionar o método gerado na etapa 5.2).
    3. Tenha em mente que as colunas Bandeja e Posição determinam para onde o Trilho de Preparação de Amostras (SPR) irá para pegar os HSPs.
      1. Observe as duas bandejas com 30 pontos cada para a esquerda imediata, dispostas como seis colunas com cinco pontos cada. A posição da bandeja que é mais esquerda e mais próxima do usuário (frente) é a posição 1, enquanto a mais à direita, mais distante é a posição 30.
      2. Observe que essas bandejas são HSP A ou B, onde HSP B é a bandeja mais próxima da SPR (bandeja mais interna), e logo atrás do HSP B está HSP Blank. Coloque as amostras extraídas nas bandejas e selecione o local na sequência de acordo.
    4. Salve a tabela de sequência, selecione Executar no lado esquerdo e , em seguida, Comece com branco em desorber se o HSP em branco estiver no desorber (denotado por um HSP marcado por rótulo amarelo).
  4. Observe que os HSPs serão manipulados pelo SPR para cada amostra na sequência. Deixe o SPR aquecer, então uma mensagem aparecerá na parte superior da tela para confirmar se o espaço em branco está no desorber. Clique em Skip para confirmar se a caneta está lá. Permita que o SPR execute todas as amostras automaticamente, e a sequência no lado GC-MS gravará automaticamente os dados em arquivos separados.

6. Análise de dados

  1. Dados de filtro de qualidade no software GC-MS (Tabela de Materiais).
    1. Revise cada pico no cromatógrafo e anote picos que correspondem à biblioteca do Instituto Nacional de Padrões & Tecnologia (NIST) (ou com outra biblioteca disponível).
    2. Adicione picos de cromatograma anotados ao método de processamento. Defina os critérios para a seleção de picos para incluir compostos com maior probabilidade superior a 75%, e garantir que o alinhamento de cada íon identificador do composto esteja dentro do centro do pico.
      1. Para adicionar um pico ao método de processamento, selecione Calibrar | Editar | composto Nome | inserir composto sob composto padrão externo. Adicione o nome do composto, tempo de retenção, Quant Signal Target Ion. Adicione os três maiores picos. Para salvar, selecione ok | | de método Salve.
    3. Uma vez que o método de processo seja configurado, proceda a Quantitate | Calcule e veja | Resultado de QEdit Quant.
    4. Inspecione cada composto para garantir que os picos estejam alinhados com seus tempos de retenção esperados e estejam acima do ruído de fundo.
    5. Uma vez que o QEdit tenha sido concluído, selecione Saída | Sim , para salvar os QEdits e voltar ao cromatógrafo principal. Exporte as integrações da área abrindo o arquivo no lado esquerdo. Selecione | quantitato Gerar Relatório.
    6. Para exportar arquivos para uso no DExSI, selecione | de arquivos Dados de exportação para | de formato AIA Crie novo diretório e selecione um local para o arquivo ou use diretório existente.
    7. Observe uma nova janela se abrindo para selecionar arquivos para exportação. Mova os arquivos para o lado direito da janela e clique em Process. Aguarde alguns segundos a alguns minutos, dependendo do número de arquivos sendo convertidos.
  2. Corrija a abundância de isótopos no DExSI de acordo com as instruções para o software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) e realize a análise com um software ou programa favorito (por exemplo, R). Os scripts usados para gerar as figuras estão localizados em https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mono-e co-culturas de S. aureus, P. aeruginosa, e A. baumannii
As monoculturas consistiam das espécies bacterianas S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Estes são patógenos oportunistas comuns encontrados em feridas humanas e infecções crônicas. Para identificar as moléculas voláteis presentes nas monoculturas e coculturas, foi realizada uma pequena extração de 1 h a 70 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para identificar a produção volátil em culturas in vitro e amostras associadas ao homem, foram realizadas análises voláteis de monoculturas de P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e isótopos estáveis de diferentes amostras biológicas. Na análise para as monoculturas e coculturas, os voláteis foram detectados realizando uma extração curta por 1h a 70 °C. A análise volátil das monoculturas e coculturas permitiu o levantamento dos compostos produzidos tanto por espécies individuais quanto duran...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V. L. V e S.J.B. D. foram ex-funcionários da Entech Instruments Inc., e K. W. é membro do Programa Universitário da Entech. J.P., J.K., e C.I.R. não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Heather Maughan e Linda M. Kalikin pela edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13C glicoseSigma-Aldrich389374-1G
2-StgEntech Instruments01-10-20030
Frascos VOA de 20 mLFisher Scientific5719110
24 mm Tampas pretas com furo, sem septoEntech Instruments01-39-76044Bmantém o revestimento da tampa no lugar no frasco
Revestimento do frasco de 24 mm para canetas sorventesEntech InstrumentsSP-L024Spermite que as canetas façam uma vedação a vácuo na parte superior do frasco
5600 Unidade de extração de caneta sorvente (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 Unidade de extração de caneta sorvente -120 VAC
96-well placas de ensaioGenesee25-224
Mídia de infusão de coração cerebral (BHI)Sigma-Aldrich53286-500G
ChemStation StofwareColuna Agilent
DB-624Agilent122-1364E60 m, 0,25 mm de diâmetro, espessura de filme de 1,40 mícron, em GC-MS
Óxido de deutérioSigma-Aldrich151882-1L
Dexsi softwareDexsi (código aberto)
GC-MS (7890A GC e 5975C inerte XL MSD com detector de triplo eixo)Agilent7890A GC e 5975C inerte XL MSD com eixo triplo
Headspace Bundle HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01Itens para extração de headspace incluídos no pacote
Caneta sorvente Headspace (HSP) - em brancoEntech InstrumentsSP-HS-0
Caneta sorvente Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
Tubos de microcentrífuga (2 mL)VWR53550-792
O-ringsEntech InstrumentsSP-OR-L024
Trilho de Preparação de AmostrasEntech Instruments
Caneta Sorvente condicionador térmicoEntech Instruments3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) mídiaSigmaT1438-500G
Bomba de Diaph

References

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