A hemorragia subaracnóidea continua a carregar uma alta carga de mortalidade e morbidade no homem. Para facilitar novas pesquisas sobre a condição e sua fisiopatologia, um modelo pré-quiasmático de injeção única é apresentado.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A hemorragia subaracnóidea continua a carregar uma alta carga de mortalidade e morbidade no homem. Para facilitar novas pesquisas sobre a condição e sua fisiopatologia, um modelo pré-quiasmático de injeção única é apresentado.
Apesar dos avanços no tratamento nas últimas décadas, a hemorragia subaracnóidea (HAS) continua a carregar uma alta carga de morbidade e mortalidade, acometendo em grande parte uma população bastante jovem. Vários modelos animais de HAS têm sido desenvolvidos para investigar os mecanismos fisiopatológicos por trás da HAS e testar intervenções farmacológicas. O modelo pré-quiasmático de injeção única no rato apresentado neste artigo é um modelo experimental de HAS com volume sanguíneo pré-determinado. Resumidamente, o animal é anestesiado, intubado e mantido em ventilação mecânica. A temperatura é regulada com uma almofada de aquecimento. Um cateter é colocado na artéria caudal, permitindo a medição contínua da pressão arterial, bem como a coleta de sangue. A membrana atlantooccipital é incisada e um cateter para registro de pressão é colocado na cisterna magna para permitir a medição da pressão intracerebral. Esse cateter também pode ser utilizado para intervenções terapêuticas intratecais. O rato é colocado em uma estrutura estereotáxica, um orifício de rebarba é perfurado anteriormente ao bregma, e um cateter é inserido através do orifício da broca e colocado logo anterior ao quiasma óptico. O sangue autólogo (0,3 mL) é retirado do cateter de cauda e injetado manualmente. Isso resulta em um aumento da pressão intracerebral e uma diminuição do fluxo sanguíneo cerebral. O animal é mantido sedado por 30 min e recebe soro fisiológico e analgésicos por via subcutânea. O animal é extubado e devolvido à gaiola. O modelo pré-quiasmático apresenta alta taxa de reprodutibilidade e variação limitada entre os animais devido à volemia pré-determinada. Ele mimetiza a HAS em humanos, tornando-se um modelo relevante para a pesquisa da HAS.
A hemorragia subaracnóidea (HSA) não traumática é uma forma de acidente vascular cerebral, representando cerca de 5% de todos os casos. A causa mais comum de HAS não traumática é a ruptura súbita de um aneurisma (HAAS), que corresponde a 85% das HAS. Outras causas incluem a ruptura de malformação arteriovenosa, coagulopatias e ruptura de veias na hemorragia perimesencefálica1. A taxa de incidência é de 9 por 100.000 pessoas-ano, com mortalidade em torno de um em cada três e outro terço necessitando do suporte da vida diária após a HAS 2,3.
Após a estabilização inicial e a confirmação diagnóstica, o tratamento depende da gravidade da hemorragia. Os pacientes mais gravemente acometidos terão um dreno extraventricular inserido nos ventrículos para reduzir a pressão intracerebral (PIC) e serão internados na unidade de terapia neurointensiva, onde serão monitorados de perto. Os pacientes serão submetidos a uma angiografia para identificar o (provável) aneurisma e, posteriormente, terão o aneurisma enrolado ou cortado para evitar ressangramento4. Apesar de inúmeros estudos de terapias farmacológicas, apenas a nimodipina, um antagonista dos canais de cálcio, demonstrou melhorar os desfechos5. Vários ensaios clínicos estão atualmente em andamento. Por favor, veja a revisão de Daou e colegas para uma extensa lista6.
A ruptura de um aneurisma tem sido descrita como o início súbito da pior cefaleia já experimentada ou uma cefaleia trovoada. A ruptura resulta em um aumento acentuado da PIC seguido por uma redução no fluxo sanguíneo cerebral (FSC). Essa redução resulta em isquemia global do cérebro, o que pode resultar em perda de consciência. Esta via mais mecanicista, juntamente com a quebra iniciada dos elementos extravasados do sangue, dá origem à liberação de citocinas e ativação do sistema imune inato, resultando em neuroinflamação estéril. Além disso, a quebra da barreira hematoencefálica, resultando em edema cerebral e distúrbio na homeostase iônica, é frequentemente observada. Todas essas alterações e muito mais, denominadas lesão cerebral precoce (EBI), ocorrem nos primeiros dias e resultam em perda neuronal e apoptose7.
Aproximadamente 1/3 dos pacientes acometidos por HSA desenvolverá isquemia cerebral tardia (ICD) entre os dias 4-148. A ICD é definida como a estreia de um comprometimento neurológico focal ou uma queda de no mínimo dois pontos na escala de coma de Glasgow com duração mínima de 1 h, quando outras causas, incluindo convulsões e ressangramento, são excluídas. A ICD está associada a um risco aumentado de morte e a um desfecho funcional diminuído após a HSA9. O vasoespasmo cerebral (CVS), o estreitamento das artérias cerebrais, é conhecido por estar associado à ICD há décadas e antigamente pensava-se ser a única razão para a ICD. Desde então, tem sido demonstrado que a SCV pode ocorrer sem o desenvolvimento de ICD e mais fatores, incluindo trombose e constrição microvascular, depressão disseminada cortical e resposta inflamatória de EBI foram identificados desde então10,11,12.
Devido à grande influência da EBI e DCI no curso da doença e na evolução dos pacientes acometidos, os modelos animais precisam mimetizá-los no maior grau possível, sem deixar de ser reprodutíveis. Os pesquisadores empregaram uma ampla gama de modelos diferentes em uma variedade de animais, de camundongos a primatas não humanos, para tentar simular a aSAH. Os ratos selvagens Sprague-Dawley e Wistar são atualmente os animais de laboratório mais utilizados, e os modelos mais comuns são o modelo de perfuração endovascular, o modelo de injeção dupla de cisterna-magna e, por último, o modelo de injeção única pré-quiasmática, que será descrito neste artigo13.
O modelo pré-quiasmático de injeção única foi originalmente desenvolvido por Prunell e colaboradores para combater algumas das deficiências dos outros modelos experimentais14. A cirurgia, quando dominada, é altamente reprodutível e minimiza a variação entre os animais. O modelo mimetiza a HAS em humanos em múltiplos pontos, incluindo o aumento súbito da PIC após a injeção de sangue, resultando em isquemia global transitória devido à queda do FSC15,16. Acomete a circulação anterior, que é onde ocorre a maior parte da HAS em humanos17. A mortalidade varia de 10% a 33%, dependendo do estudo e da quantidade de sangue injetado14,18. A morte celular tardia e a neuroinflamação podem ser detectadas nos dias 2 e 7, fornecendo variáveis para estudar as consequências da EBI e DCI 19,20.
O estudo apresenta uma descrição atualizada do modelo de injeção única pré-quiasmática no rato, juntamente com uma descrição de como utilizar a sonda ICP como porta para administração intratecal de fármacos.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Este procedimento é feito de acordo com a Diretiva 2010/63/UE da União Europeia relativa à proteção de animais utilizados para fins científicos e aprovada pela Inspeção Dinamarquesa de Experiências Animais (licença n.º 2016-15-0201-00940). A cirurgia é realizada usando técnica asséptica na medida do possível, incluindo instrumentos estéreis, luvas, cateteres e suturas. Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, pesando entre 230 e 350 g, grupo alojados em ciclo claro/escuro de 12 horas, com temperatura constante de 22 °C (± 2 °C) e umidade de 55% (± 10%). Os animais recebem ração padrão e água ad libitum. Os animais são alojados em gaiolas individuais após a cirurgia, mas podem ser devolvidos ao grupo quando a sonda ICP tiver sido removida. O anestésico nesse protocolo é o gás isoflurano, mas uma mistura intraperitoneal de 1,5 mL/kg de quetamina (100 mg/mL) e xilazina (20 mg/mL) também é eficaz21.
1. Preparações
2. Anestesia
3. Cateter de cauda
4. Sonda ICP
5. Colocação da agulha e da sonda Laser-Doppler
6. Indução da HAS
7. Recuperação e despertar
8. Remoção da sonda de PIC (se não for removida durante a cirurgia)
NOTA: Use um microscópio cirúrgico a critério do cirurgião.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
As mulheres têm um risco aumentado de HSA em comparação com os homens. Apesar disso, roedores machos são usados principalmente em experimentos devido ao possível viés da heterogeneidade do ciclo estral em fêmeas. Os resultados representativos aqui apresentados são de uma publicação recente comparando ratos fêmeas e machos, confirmando que o modelo produz resultados semelhantes em fêmeas em comparação commachos 21. Participaram do estudo 34 ratas da raça Sprague-Dawley (18 HSAs e 16 shams). Shams n...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
O modelo pré-quiasmático de injeção única de HAS mimetiza vários elementos importantes da HAS humana, incluindo a espícula da PIC, redução do FSC, isquemia global transitória, suprarregulação de marcadores neuroinflamatórios e SCV 14,15,16,18,19,20. A sonda ICP também foi utilizada como porta para administração intratecal (
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.
O trabalho foi apoiado pela Fundação Lundbeck e pela Bolsa de Excelência Lundbeck (nº R59-A5404). Os financiadores não tiveram nenhum papel em nenhuma parte do manuscrito.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cateter de veia periférica 16 G | BD Venflon | 393229 | Agulha encurtada, distal 1 cm curvada. Asas removidas |
| Campânula/câmara | de anestesia Desconhecido | ||
| Analisador de gases sanguíneos | Radiômetro | ABL80 | |
| Monitor de pressão arterial (PA) | Adinstruments | ML117 | Conecta-se a |
| Powerlab Pinça curva, 12 cm x 3 | F.S.T | 11001-12 | Para anestesia |
| Almofada cilíndrica, 28 cm x 4 cm | Caseiro | Feito de toalhas cirúrgicas | |
| Hardware de aquisição de dados | Adinstruments | ML870 Powerlab | |
| Software de aquisição de dados | Adinstruments | LabChart 6.0 | |
| Broca | KMD | 1189 | |
| Controlador de broca | Silfradent | 300 IN | |
| Luz flexível | Schott | KL200 | |
| Almofada de aquecimento | Minco | 1135 | |
| Agulha hipodérmica, 20 G | KD Medical | 301300 | Conecta-se ao monitor ICP de quadro estereotáxico |
| Adinstruments | ML117 | Conecta-se ao | |
| vaporizador de isoflurano | Powerlab Ohmeda | TEC3 | |
| Laptop | Lenovo | T410 | |
| Monitor doppler a laser | Adinstruments | ML191 | |
| Sonda doppler a laser | Oxford Optronics | MSF100XP | Conecta-se ao monitor doppler a laser |
| Porta-agulhas, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | Para anestesia |
| Seringa de precisão, 0,025 mL | Hamilton | 547407 | |
| Quadro estereotáxico | Kopf Instruments | M900 | |
| Microscópio cirúrgico | Carl Zeiss | F170 | |
| Sutura agulha | Allgaier | 1245 | para |
| anestesia Controlador de temperatura | CWE,INC. | Transdutor TC-1000 | |
| x 2 | Adinstruments | MLT0699 | Conecta-se ao monitor BP e ICP |
| Ventilador | Ugo Basile | 7025 | |
| Clipper veterinário | Aesculap | GT421 | |
| Afastador Blair de 3 pontas, 13,5 cm | Agnthos | 17022--13 | |
| Afastador de Alm sem corte | FST | 17008-07 | |
| Pinça curva, 12 cm x 2 | F.S.T | 11001-12 | |
| Porta-agulhas, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | |
| Pinça reta Dumont, 11 cm | F.S.T | 11252-00 | |
| Hemostático Halsted-Mosquito reto x 2 | F.S.T | 13008-12 | |
| Tesoura de íris reta, 9 cm | F.S.T | 14090-09 | |
| Tesoura reta Vannas, 10,5 cm | F.S.T | 15018-10 | |
| Cotonetes absorvíveis | Kettenbach | 31603 | |
| Linha de seda preta, 4-0, 5 x 15 cm | Vö mel | 14757 | |
| Cera óssea | Aesculap | 1029754 | |
| Gel para os olhos de carbômero 2 mg/g | Cotonete Paranova | ||
| Heinz Herenz | WA-1 | ||
| Aplicador com ponta de algodão x 4 | Selefa | 120788 | |
| Agulha hipodérmica, 23 G x2 | KD Medical | 900284 | Conecta-se à torneira. Remova a extremidade distal |
| Agulha hipodérmica, 23 G x3 | KD Medical | 900284 | Remova a extremidade distal. 2 conecta-se à torneira, 1 à seringa |
| Sonda ICP: | Caseiro | Feito do seguinte: | |
| Tubo de polietileno, 20 mm | Smiths medical | 800/100/200 | Diâmetro interno (ID): 0,58 mm, Diâmetro externo (OD): 0,96 mm. |
| Tubo de silicone, 10 mm | ID do 15202710 Fisher | : 0,76 mm, OD: 2,4 mm. | |
| Tubo de silicone, 2 mm | Fisher | 11716513 | ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm. |
| Tubos de micro hematócrito | Marca | 7493 11 | |
| OP-toalha, 45 cm x75 cm | Mö lnlycke | 800430 | |
| Adaptador PinPort, 22 G | Instech | PNP3F22 | |
| Injetor PinPort | Instech | PNP3M | |
| Tubo de polietileno, 2 x 20 cm | Smiths medical | 800/100/200 | Conecta-se à seringa. ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm. |
| Elástico | Bisturi Desconhecido | ||
| , 10 lâminas | Kiato | 23110 | |
| Agulha espinhal, 25 G x 3,5'' | Braun | 5405905-01 | |
| Sistema de torneira, Discofix x 2 | Braun | 16494C | Conecta-se ao transdutor |
| Sutura, 4-0, monofil, não reabsorvível x 3 Seringa | EH7145H | Ethicon | |
| , 1 mL | BD Plastipak | 1710023 | |
| Seringa, luer-lock, 10 mL x 4 | BD Plastipak | 305959 | Conecta-se ao transdutor |
| Cola adesiva tecidual | 3M | 1469SB | |
| 0,5% Chlorhexidine spirit | Faaborg Pharma | 210918 | |
| Carprofeno 50 mg/mL | ScanVet | 43715 | Isoflurano diluído 1:10 |
| Baxter | |||
| Solução salina isotônica | Amgros | 16404 | |
| Lidocaína-Adrenalina 10 mg/5 µ g / mL | Amgros | 16318 |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.