Summary
We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.
Abstract
Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (ZvH), enzovoort. Om oplosbare of diffuse eiwit oligomeren of aggregaten te detecteren en te analyseren, is fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt, die de diffusiesnelheid en helderheid van een enkel deeltje met een enkele molecuulgevoeligheid kan detecteren. De juiste procedure en knowhow voor de detectie van eiwitaggregatie zijn echter niet op grote schaal gedeeld. Hier tonen we een standaardprocedure van FCS-meting voor diffusie-eigenschappen van aggregatiegevoelige eiwitten in cellysaat en levende cellen: ALS-geassocieerd 25 kDa carboxyl-terminal fragment van TAR DNA/RNA-bindend eiwit 43 kDa (TDP25) en superoxide dismutase 1 (SOD1). De representatieve resultaten tonen aan dat een deel van de aggregaten van groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld TDP25 enigszins was opgenomen in de oplosbare fractie van murien neuroblastoom Neuro2a cellysaat. Bovendien toont GFP-gelabelde SOD1 met ALS-geassocieerde mutatie een langzamere diffusie in levende cellen. Dienovereenkomstig introduceren we hier de procedure om de eiwitaggregatie via de diffusie-eigenschap ervan te detecteren met behulp van FCS.
Introduction
Eiwitaggregaties met neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, enzovoort1 zijn bekend als giftig en zouden de eiwithomeostase (proteostase) in de cellen en organen verstoren, wat dan kan leiden tot veroudering2. De klaring van eiwitaggregatie wordt verwacht als een therapeutische strategie; chemische stoffen die eiwitaggregatievorming voorkomen en eiwitaggregaten afbreken (bijv. kleine moleculen of geneesmiddelen) zijn echter nog niet vastgesteld. Bovendien blijft de manier waarop eiwitaggregatie toxiciteit uitoefent ongrijpbaar. Daarom is het belangrijk om, om onderzoeksprojecten met betrekking tot eiwitaggregatie te bevorderen, procedures met een hoge doorvoer in te voeren om eenvoudig eiwitaggregatie te detecteren. Eiwitaggregatiedetectie met behulp van antilichamen die de conformatie van eiwitaggregatie en aggregatiespecifieke fluorescerende kleurstof herkennen, is veel gebruikt3. Het is echter moeilijk om de aggregatie te detecteren, vooral in levende cellen met behulp van dergelijke klassieke procedures.
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een procedure om eiwitaggregatie en structurele verandering te detecteren. FRET is echter niet in staat om eiwitdynamiek te analyseren (bijv. diffusie en oligomerisatie van eiwitten in levende cellen)3. Daarom introduceren we hier een eenvoudig protocol om eiwitaggregatie in oplossing (bijv. cellysaat) en levende cellen te detecteren met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS), die de diffusie-eigenschap en helderheid van fluorescerende moleculen met één molecuulgevoeligheidmeet 4. FCS is een fotontellingsmethode met behulp van een laserscan confocale microscoop (LSM). Met behulp van een zeer gevoelige fotondetector en berekening van de autocorrelatiefunctie (ACF) van de aankomsttijd van foton wordt de passeertijd en helderheid van de fluorescerende moleculen in het detectievolume gemeten. De diffusie vertraagt met een toename van het molecuulgewicht; zo kan intermoleculaire interactie worden geschat met behulp van FCS. Sterker nog, een toename van de helderheid van het fluorescerende molecuul duidt op homo-oligomerisatie van de moleculen. Daarom is FCS een krachtig hulpmiddel om een dergelijke eiwitaggregatie te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materialen en reagentia
- Gebruik pyrogene vrije oplossingen en medium voor celkweek (Tabel 1).
- Bereid oplossingen voor het biochemische experiment met ultrapure water en gebruik als DNase / RNase vrij.
- Selecteer een geschikte FBS voor de celcultuur met een partijcontroleproces. Aangezien de geselecteerde FBS-lot regelmatig verandert, kunnen de catalogus en het lotnummer voor FBS hier niet worden weergegeven.
- Plasmide DNA
- Bereid pmeGFP-N15 voor op eGFP monomeerexpressie; pmeGFP-C1-TDP256 voor GFP-TDP25-expressie; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 voor SOD1-G85R-GFP-expressie; en pCAGGS8 als drager.
OPMERKING: meGFP is een monomere variant met A206K-mutatie van verbeterde GFP (eGFP). TDP25 is een ALS-geassocieerd C-terminal fragment van TDP-43. SOD1-G85R is een ALS-geassocieerde mutant van SOD1.
- Bereid pmeGFP-N15 voor op eGFP monomeerexpressie; pmeGFP-C1-TDP256 voor GFP-TDP25-expressie; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 voor SOD1-G85R-GFP-expressie; en pCAGGS8 als drager.
- Celspanning
- Gebruik murien neuroblastoom Neuro2a cellen.
OPMERKING: Neuro2a-cellen hebben een hoge transfectie-efficiëntie en drukken exogene eiwitten zeer uit. Voor TDP25-expressie zijn celstammen met hoge expressie-efficiënties zoals Neuro2a- of HEK293-cellen vereist. In HeLa-cellen kon TDP25 niet efficiënt worden uitgedrukt.
- Gebruik murien neuroblastoom Neuro2a cellen.
2. Celcultuur en transfectie
- Bereid een plastic schaal van 100 mm die Neuro2a-cellen halfconfluently kweekt in een normaal groeimedium.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om ongeveer 48-72 uur na het vorige zaaien bij 37 °C te incuberen totdat de semi-samenvloeiing is bereikt. - Verwijder het medium.
- Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal en incubeer ze gedurende 1 minuut bij 37 °C.
- Voeg 9,5 ml normaal groeimedium toe aan de schaal en hang de losgemaakte cellen op.
- Als u Trypan blauw gebruikt om de dode cellen te beitsen, telt u het aantal cellen met behulp van een celteller of handmatig. Verdun vervolgens de cellen in kweekmedium (1,0 × 105/ml).
- Voeg 2 ml celsuspensie toe aan een plastic schaal van 35 mm voor cellyse of een glazen basisschaal voor live-celmeting.
- Incubeer het gerecht gedurende 1 dag op 37 °C.
- Start de volgende voorbereidingen 15 minuten voor de dag van de transfectie.
- Bereid twee buizen van 1,5 ml voor en voeg 100 μL Opti-MEM I toe aan elke buis.
- Meng in de eerste buis 1,0 μg plasmide-DNA (oplossing A). Meng in de tweede tube 2,5 μL Lipofectamine 2000 (oplossing B).
OPMERKING: Om de transfectie-efficiëntie te behouden, moet u de totale HOEVEELHEID DNA hetzelfde houden. Om het expressieniveau voor FCS-meting in levende cellen te verlagen, moet de fractiehoeveelheid plasmide-DNA voor eiwitexpressie afnemen (bijv. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R en 0,8 μg pCAGGS-mengsel). Houd bovendien dezelfde verhouding tussen het volume lipofectamine 2000 en de hoeveelheid plasmide-DNA. - Meng oplossing A en B voorzichtig door er een in een van beide buizen toe te voegen en incubeer deze vervolgens gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (oplossing C).
- Voeg oplossing C toe aan het cultuurmedium; en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C.
3. Cellysis & middelgrote uitwisseling
- Controleer de GFP-expressie met behulp van een routinemicroscoop.
- Verwijder het medium in de schaal.
- Voeg 2 ml PBS bij 25 °C toe om het medium uit te wassen. Verwijder de PBS.
- Leg de schaal op een aluminium plaat bovenop het gemalen ijs.
OPMERKING: We gebruiken een 1 mm dikke aluminium plaat gesneden in een zondagse gereedschapswinkel of in de handel verkrijgbaar als laboratoriumapparatuur. - Voeg 200 μL lysisbuffer toe bij 4 °C. Schud de schaal lichtjes zodat de buffer gelijkmatig verdeeld is over de bodem van de schaal.
- Schraap de schaal met een celschraper en herstel het lysaat met onopgelost celafval in een nieuwe buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de oplossing bij 20.400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Herstel het supernatant in een nieuwe buis van 1,5 ml en houd het op 4 °C of op ijs.
OPMERKING: Vries het lysaat niet in. - Vervang voor metingen van levende cellen het medium vóór de meting. Controleer de celbevestiging met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Bevestig de expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
4. Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) kalibratie
- Start het systeem en voer de bedieningssoftware uit. Schakel de Argon+ laser (458/477/488/514 nm) in. Stabiliseer het systeem ten minste gedurende 30 minuten.
- Stel het optische pad in: Grootlichtsplijter: HFT488; Dichroïsche spiegel: NFT600; Fluorescentiebarrièrefilter: een banddoorlaatfilter 505-540 (BP505-540); Detector: lawine fotodiode (APD)).
- Stel de pinholegrootte in door de waarde direct in te voeren (66 μm; 1 luchtige eenheid).
- Voeg de Rhodamine 6G (Rh6G) oplossing toe aan een put van de afdekglaskamer op het podium.
- Voeg de onderdompeling ultrapure water op het doel. Gebruik de onderdompelingsolie niet.
- Plaats de kamer op het microscoopstadium. Verplaats het werkgebied naar de juiste positie.
- Focus op het bovenste glasoppervlak door het verstrooide licht van het glasoppervlak te meten. Nadat u de objectieve lens naar beneden hebt verlaagd, draait u de scherpstelknop met de klok mee om deze aan te passen.
OPMERKING: Controleer de draairichting van de scherpstelknop omdat deze tegenovergesteld is aan die in Japan en Duitsland. - Breng het brandpunt 200 μm boven het bovenste glasoppervlak om de binnenkant van de oplossing te observeren.
- Klik op de telsnelheid en controleer de snelheid van het aantal fotons.
- Verhoog geleidelijk de AOTF-waarde (acousto-optic tunable filters) (bijv. excitatielasertransmissie) zodat de telsnelheidswaarde meer dan 10 kHz is.
- Klik op de pinhole-aanpassing en open de wizard pinhole-aanpassing. Zoek de pinhole positie met het hoogste (een piek) aantal fotonen in zowel de x- als de y-as.
- Draai de correctiering van de objectieve lens zo dat de tellingen per molecuul (CPM) de hoogste zijn.
OPMERKING: Aangezien de dikte van het afdekglas van de hier gespecificeerde kamer 0,12-0,17 mm is, bevindt de correctiering zich rond het minimum of slechts een paar omwentelingen ervan, waar de CPM maximaal is. - Verlaag de AOTF-waarde geleidelijk, zodat de CPM-waarde 2-3 kHz wordt.
- Verkrijg de autocorrelation functie (ACF) van Rh6G gedurende 90 s.
- Zodra de meting is voltooid, klikt u op Aanpassen om curve-fittinganalyse uit te voeren.
- Selecteer een model voor eencomponent driedimensionale (3D) diffusie met een tripletstatus.
OPMERKING: De Rh6G is monodisperse en eencomponenten diffuus met een triplettoestand. - Stel de begintijd van de montage in door de rode lijn te verplaatsen. Klik op Alles passen en controleer de afwijking van de pasvorm. Zorg er na het uitvoeren van de curvefitting voor dat de diffusietijd (DT) en de structuurparameter (SP) ruwweg tussen respectievelijk 20-30 μs en 4-8 liggen.
- Onthoud de waarde van de structurele parameter. Gebruik de SP-waarde voor curvemontageanalyse van alle ACL's die op dezelfde dag worden gemeten, onder dezelfde optische omstandigheden, en met hetzelfde type glazen basisschaal of kamerdekselglas dat op het microscoopstadium is geplaatst.
5. FCS-meting in cellysaat
- Bereid de cellysaten voor (zie hierboven).
- Plaats het lysaat op de glazen afdekkamer. Plaats een deksel om uitdroging te voorkomen en het podiumdeksel voor lichte schaduw.
- Stel de aanschafconditie, laservermogen, meettijd en herhalingen in.
- Klik op Telsnelheid en pas de AOTF-waarde van de laser aan zodat de CPM-waarde meer dan 1 kHz wordt.
- Voer een proefmeting uit gedurende 1 min. Controleer of de berekende ACF een positieve amplitude en glad verval vertoont.
- Voer de hoofdmeting gedurende 5 minuten uit.
OPMERKING: De totale meettijd wordt geleidelijk verhoogd totdat de vorm van de ACF niet verandert, zelfs niet als de meettijd wordt verhoogd. - Klik op Aanpassen om curve-fittinganalyse uit te voeren.
- Selecteer een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een tripletstatus. Vergeet niet om de SP-waarde in te voeren en de instelling te wijzigen in "Opgelost" niet "Gratis" voordat u op Alles passen klikt.
- Exporteer de ingerichte tabel als een door tabs gescheiden tekstbestand.
- Exporteer indien nodig de ACF- en count-tariefrecord als een door tabbladen gescheiden tekstbestand.
6. FCS-meting in levende cellen
- Vervang het medium door een nieuw medium voor de meting.
- Gebruik een warmtefase incubator. Zet de celkweekschaal op het microscoopstadium.
- Bevestig de scherpstelling en positie met behulp van de confocale micrope. Selecteer de meetcel. Zoom in en pas de celpositie aan. Verkrijg fluorescentiebeelden van een GFP-expresserende cel met behulp van de modus voor langzame scansnelheid.
- Selecteer een FCS-meetpositie met behulp van Positie in de sectie "FCS".
- Selecteer ten minste één FCS-meetpunt met behulp van een kruisdraad (figuur 1).
- Meet de ACF gedurende 1 min.
OPMERKING: Omdat fluorescerende eiwitten de neiging hebben om in levende cellen te worden gefotobleekt als gevolg van langzame beweging in vergelijking met de oplossing, moet de meettijd minimaal zijn. Het is over het algemeen moeilijk om ACF in de cel zo soepel te verkrijgen als oplossingsmetingen, omdat langdurige metingen zullen leiden tot fotobleaching van fluorescerende eiwitten. - Klik op Aanpassen om curve-montageanalyse uit te voeren met behulp van een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een tripletstatus.
OPMERKING: Voor metingen van levende cellen zou een model voor tweecomponenten 3D-diffusie met een triplettoestand beter zijn omdat het empirisch moeilijk is om de chi-kwadraatwaarde te verlagen met een 3D-diffusiemodel met één component vanwege het bestaan van verschillende mobiele componenten in de levende cel. Maar zelfs met behulp van een model voor driecomponenten 3D-diffusie, worden de diffusiecomponenten meestal niet gescheiden in vergelijking met het gebruik van het model voor twee componenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We voerden FCS-meting uit van GFP-TDP25 in cellysaat en SOD1-G85R-GFP in levende cellen. In beide gevallen konden een positieve amplitude en gladde ACL's worden verkregen. We hebben aangetoond dat een deel van GFP-TDP25, uitgedrukt in Neuro2a-cellen, werd teruggevonden in de oplosbare fractie onder de aangegeven toestand6. In de oplosbare fractie van het cellysaat werden extreem heldere fluorescentiemoleculen gedetecteerd in het fotontellingssnelheidsrecord met behulp van FCS(figuur 2A, boven, pijl). Dergelijke "spikes (ook wel burst genoemd)" werden niet waargenomen in GFP-monomeren en monodisperse chemische fluorescerende kleurstofoplossing, wat suggereert dat de spikes oligomere eiwitten aangeven9. Curve fitting analyse met behulp van een model uitgaande van tweecomponenten 3D diffusie met een triplet toestand toonde aan dat de snelle diffusie moleculen (DTFast = 186 μs) ~90% waren en de resterende 10% was 2,3 ms (Figuur 2A, onder; en Tabel 2).
Tijdens de SOD1-G85R-GFP-meting in levende cellen liet het fotontellingsrecord een geleidelijke afname zien, wat suggereert dat het fotobleaching in het detectievolume(figuur 2B, boven). Hoewel de bijdrage van de fotobleaching werd getoond in een bereik van meer dan 1 s in de ACF, werden een positieve amplitude en een glad verval van de ACF waargenomen(figuur 2B, onder). Curve fitting analyse met behulp van een model uitgaande van tweecomponenten 3D diffusie met een triplet toestand toonde aan dat de snelle diffusie moleculen (DTFast = 397 μs) ~93,4% waren en de resterende 6,6% was 12,3 ms (Tabel 2). ALS-gebonden mutatie, G85R, in SOD1 liet geen dramatisch verschil in diffusie-eigenschap toe in vergelijking met wild type. Proteasoomremming verminderde echter de diffusiesnelheid alleen in de G85R mutant van SOD1 in het cytoplasma7.
Figuur 1: Confocaal fluorescerend beeld van Neuro2a cellen die SOD1-G85R-GFP uitdrukken. Confocaal fluorescerend beeld van Neuro2a cellen die SOD1-G85R-GFP uitdrukken. Het kruishaar geeft de FCS-meetpositie in het cytoplasma aan. Bar = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Typische FCS-resultaten en gemonteerde curven voor de autocorrelatiefuncties. (A en B) Top: Geregistreerde fotontellingssnelheid in het FCS-meettijdbereik (groene lijn). Onder: Berekende autocorrelatiefuncties (ACL's; Ruwe, grijze lijnen) en gemonteerde ACF-curven met behulp van een model voor tweecomponenten driedimensionale diffusie met een triplettoestand (Fit, magenta-lijnen). G(τ) voor Y-as geeft de amplitude van ACL's aan op tijd τ sec. voor X-as. Puntlijnen tonen passende begin- en eindtijdpunten. Donkerblauwe pijlen tonen de piek met extreem heldere eiwitten die door het detectievolume gaan (d.w.z. oplosbare oligomeren/aggregaten). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Naam van het materiaal/de apparatuur | Onderdelen | Opmerkingen/Beschrijving |
| 0,1 mM Rhodamine 6G oplossing. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M Natriumchloride (NaCl) | ||
| Lysisbuffer | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1× proteaseremmercocktail | Proteaseremmercocktail moet vlak voor de cellysis worden gemengd. |
| Normaal groeimedium | DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U/ml penicilline G en 100 mg/ml Streptomycine | Partijcontrole voor FBS moet worden vereist. |
| Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4 |
Tabel 1: Samenstellingen van oplossingen
| CPM (kHz) | DTSnel (ms) | Snelle component (%) | DTLangzaam (ms) | Langzame component (%) | |
| GFP-TDP25 in lysaat | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP in levende cel | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tabel 2: Typische gemonteerde waarden voor de autocorrelatiefuncties
De gemonteerde waarden voor de autocorrelatiefuncties worden weergegeven in figuur 2 met behulp van een model voor tweecomponenten driedimensionale diffusie met een triplettoestand. Tellingen per molecuul (CPM), snelle en langzame diffusietijd (respectievelijk DTFast en DTSlow)en hun componenten (fast and slow component) worden weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wat de systeemkalibratie vóór de metingen betreft, moet hetzelfde glaswerk worden gebruikt als het glaswerk dat wordt gebruikt om het monster te meten (bv. de 8-putten bedekken de glazen kamer voor cellysaat en de glazen basisschaal van 35 mm voor levende cellen). Door de adsorptie van Rh6G op het glas kan de effectieve concentratie soms afnemen. Als dat het gevolg is, moet een sterk geconcentreerde Rh6G-oplossing zoals 1 μM alleen voor de pinhole-aanpassing worden gebruikt. Extreem hoge fotontellingen moeten worden vermeden om de detector te beschermen (bijv. meer dan 1000 kHz). Bovendien is de geconcentreerde oplossing niet geschikt voor de verwerving van de autocorrelatiefunctie (minder dan 100 kHz behouden). De kalibratie van de pinhole positie is belangrijk. Als het optische systeem vaak wordt gebruikt, is het zeldzaam voor dramatische dislocatie van het pinhole; het gebruik van "Fine" aan het begin is dus vaak geen probleem om de juiste positie te vinden. Als er geen piekpositie van de tellingssnelheden met "Fine" wordt gevonden, gebruikt u de "Coarse" om het pinhole van het ene uiteinde van het bewegingsbereik naar het andere te verplaatsen voordat u de positiebevinding met "Fine" gebruikt. Als de amplitude van de ACF vlak was, controleert u of de scherpstelling en positie geschikt zijn.
Probeer na de Rh6G-meting en de montage ervan, als de DT en/of SP buiten het aangegeven bereik ligt, de pinhole- en correctieringaanpassing opnieuw. Wanneer we nog steeds buiten het bereik verschijnen, raden we u aan contact op te nemen met de ondersteuning van de fabrikant, omdat dit waarschijnlijk te wijten is aan vermoedelijke defecten van het optische systeem. Met behulp van de gemeten DT en SP naast de bekende diffusiecoëfficiënt van Rh6G (414 μm2/s) in water, kan de effectieve straal taille worden berekend omdat DT afhankelijk is van de straal taille10. Bovendien, aangezien sp de verhouding van straal taille en de hoogte van het efficiënte opsporingsvolume is, kan het opsporingsvolume worden berekend. De volumeberekening is nodig om de absolute concentratie te bepalen. Meer beschrijving van het principe en probleemoplossing tijdens de kalibratie is ook beschikbaar in protocollen zoals eerder gerapporteerd11,12,13.
Sommige pieken werden waargenomen in de FCS-meting van GFP-TDP25 in cellysaat(figuur 2A, boven). We tonen aan dat dergelijke pieken werden waargenomen bij fcs-meting van geaggregeerd gevoelig huntingtine, met inbegrip van geëxpandeerde polyglutamine-herhalingen gelabeld met GFP of geel fluorescerend eiwit (YFP) (HttQ78 en HttQ143)9; het suggereert dus oplosbare oligomeren/aggregaten van GFP-TDP25 in de oplosbare fractie van het cellysaat. Maar zo'n piekpopulatie was zeldzaam; het ACF en het resultaat van de curve-fitting mogen dus geen belangrijke bijdrage van dergelijke pieken bevatten. Een mogelijke reden om slechts een kleine hoeveelheid aggregaten in de oplosbare fractie op te nemen , is waarschijnlijk omdat TDP25 zeer aggregatiegevoelig is en de aggregaten ervan worden gefractioneerd in de onoplosbare fractie , zoals blijkt uit een fractionering van het cellysaat gevolgd door western blotting detection6. De verschijnselen van de neiging om te herstellen tot de onoplosbare fractie van aggregatiegevoelige eiwitten zijn vaak waargenomen6,9. Dergelijke oplosbare oligomeren/aggregaten kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd met conventionele biochemische methoden zoals SDS-PAGE, gevolgd door westerse blotting; FCS heeft dus een voordeel. Het is echter moeilijk om multicomponenten te analyseren met behulp van conventionele FCS omdat het de gemiddelde populatie meet. Meer ontwikkelingsprocedures in combinatie met bayesiaanse nietparametrische analyse zouden de multicomponenten in de steekproef bepalen zonder aannames voor de componenten14.
De diffusietijd in levende cellen was relatief traag in vergelijking met het cellysaat. Aangezien bekend is dat de viscositeit in de cel hoger is dan die in oplossingen zoals PBS en wasmiddelhoudende buffer15, wordt de diffusietijd in levende cellen theoretisch 2,5-3 keer langer. Als gevolg van deze trage diffusie in levende cellen vergelijken in oplossing, fotobleaching van fluorescerende tags kan vaak worden veroorzaakt. Om het fotobleaching-effect op ACL's te corrigeren, zijn enkele procedures voorgesteld, zoals exponentiële vervalhypothese16 en ruisfiltering met waveletfunctie17. Hoewel dergelijke correcties worden verondersteld effectief te zijn, is het nog steeds niet zo eenvoudig voor algemene gebruikers omdat het programmeervaardigheden vereist. Bovendien moet bij metingen van levende cellen het montagebereik zorgvuldiger worden bepaald, zodat de chi-vierkante waarde van de gemonteerde curve klein wordt. Zoals blijkt uit figuur 2B, werd het bereik waarbij G(τ) kleiner was dan 1, uitgesloten van het montagebereik. Als alternatief zijn meer fototabele fluorescerende tags nodig om langzaam verspreidende / bewegende moleculen te analyseren. GFP is gemakkelijk te gebruiken als labeling tag, en de stabiliteit is goed, maar het wordt vaak gefotobleekt tijdens FCS metingen. Om deze fototabele eigenschap te overwinnen, halotag met tetramethylrhodamine (TMR) als een chemische fluorescerende kleurstof is beschikbaar18. Onvolledige etikettering door de fluorescerende liganden (bv. TMR-ligand) en gevangen kleurstofpools zijn echter problematische problemen voor specifieke etikettering van eiwitten van belang19; zo zou exogene expressie van eiwit-van-belang gelabeld met fluorescerende eiwitten de eerste keuze zijn voor fluorescerende etikettering in levende cellen.
Er zijn vele soorten fluorescerende eiwitten, evenals chemische fluorescerende kleurstoffen; zoals in dit artikel wordt getoond, is monomere verbeterde GFP (meGFP) echter een gemakkelijk te gebruiken tag voor FCS en andere fluorescentiemicroscopie omdat de biochemische en fluorescentie-eigenschappen bekend zijn. Daarom is meGFP in onze studies de eerste keuze en wordt het over het algemeen gebruikt om de aggregatiegevoelige eiwitten te labelen voor FCS-metingen6,7,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Deze auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
A.K. werd ondersteund door een Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), door een grant-in-aid van de Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, door een subsidie van Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) en een grant-in-aid van Hoansha Foundation. M. K. werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) en een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
