Summary
Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.
Abstract
L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (MH), et ainsi de suite. Pour détecter et analyser les oligomers ou agrégats protéiques solubles ou diffus, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui peut détecter la vitesse de diffusion et la luminosité d’une seule particule avec une seule sensibilité molécule, a été utilisée. Cependant, la procédure et le savoir-faire appropriés pour la détection de l’agrégation des protéines n’ont pas été largement partagés. Ici, nous montrons une procédure standard de mesure fcs pour les propriétés de diffusion des protéines sujettes à l’agrégation dans le lysate cellulaire et les cellules vivantes : fragment carboxyl-terminal associé à la SLA de l’ADN TAR/protéine liant l’ARN 43 kDa (TDP25) et de la dismutase de superoxyde 1 (SOD1). Les résultats représentatifs montrent qu’une partie des agrégats de protéine fluorescente verte (GFP) marqué TDP25 a été légèrement inclus dans la fraction soluble du lysate cellulaire neuroblastome murin Neuro2a. En outre, le SOD1 marqué GFP portant la mutation ALS-associée montre une diffusion plus lente dans les cellules vivantes. En conséquence, nous introduisons ici la procédure de détection de l’agrégation protéique via sa propriété de diffusion à l’aide de FCS.
Introduction
Les agrégations protéiques impliquant des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, etainsi de suite, sont connues pour être toxiques et perturberaient l’homéostasie protéique (protéostasie) dans les cellules et les organes, qui pourrait alors conduire au vieillissement2. Le dégagement de l’agrégation protéique est attendu comme stratégie thérapeutique; toutefois, les produits chimiques qui empêchent la formation d’agrégations protéiques et dégradent les agrégats protéiques (p. ex., petites molécules ou médicaments) n’ont pas encore été établis. De plus, la façon dont l’agrégation protéique exerce une toxicité reste insaisissable. Par conséquent, pour promouvoir des projets de recherche liés à l’agrégation des protéines, il est important d’introduire des procédures à haut débit pour détecter simplement l’agrégation des protéines. La détection de l’agrégation protéique à l’aide d’anticorps reconnaissant la conformation de l’agrégation protéique et du colorant fluorescent spécifique à l’agrégation a étélargement utilisée 3. Cependant, il est difficile de détecter l’agrégation, en particulier dans les cellules vivantes en utilisant de telles procédures classiques.
Le transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) est une procédure de détection de l’agrégation des protéines et des changements structurels. Toutefois, fret est incapable d’analyser la dynamique protéique (p. ex., diffusion et oligomérisation des protéines dans les cellules vivantes)3. Par conséquent, nous introduisons ici un protocole simple pour détecter l’agrégation des protéines dans la solution (par exemple, le lysate cellulaire) et les cellules vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui mesure la propriété de diffusion et la luminosité des molécules fluorescentes avec une seule sensibilité molécule4. FCS est une méthode de comptage des photons à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSM). À l’aide d’un détecteur de photons hautement sensible et du calcul de la fonction d’autocorrépendance (ACF) de l’heure d’arrivée des photons, le passage à travers le temps et la luminosité des molécules fluorescentes dans le volume de détection est mesuré. La diffusion ralentit avec une augmentation du poids moléculaire; ainsi, l’interaction intermoléculaire peut être estimée à l’aide de FCS. Plus puissamment encore, une augmentation de la luminosité de la molécule fluorescente indique l’homo-oligomérisation des molécules. Par conséquent, FCS est un outil puissant pour détecter une telle agrégation de protéines.
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Protocol
1. Matériaux et reagents
- Utilisez des solutions pyrogéniques gratuites et moyennes pour la culture cellulaire( tableau 1).
- Préparez des solutions pour l’expérience biochimique en utilisant de l’eau ultrapure et utilisez-la sans DNase/RNase.
- Sélectionnez un FBS approprié pour la culture cellulaire avec un processus de vérification de lot. Étant donné que le lot FBS sélectionné change régulièrement, le catalogue et le numéro de lot de FBS ne peuvent pas être représentés ici.
- ADN plasmide
- Préparer pmeGFP-N15 pour l’expression monomère eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 pour l’expression GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 pour l’expression SOD1-G85R-GFP; et pCAGGS8 en tant que transporteur.
REMARQUE : le meGFP est une variante monomère portant la mutation A206K du GFP amélioré (eGFP). TDP25 est un fragment de terminal C associé à la SLA de TDP-43. SOD1-G85R est un mutant associé à la SLA de SOD1.
- Préparer pmeGFP-N15 pour l’expression monomère eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 pour l’expression GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 pour l’expression SOD1-G85R-GFP; et pCAGGS8 en tant que transporteur.
- Souche cellulaire
- Utilisez des cellules neuroblastome neuro2a murines.
REMARQUE : Les cellules Neuro2a ont une efficacité élevée en transfection et des protéines exogènes hautement expresses. Pour l’expression TDP25, des souches cellulaires ayant une efficacité d’expression élevée comme les cellules Neuro2a ou HEK293 sont nécessaires. Dans les cellules HeLa, TDP25 n’a pas pu être efficacement exprimé.
- Utilisez des cellules neuroblastome neuro2a murines.
2. Culture cellulaire et transfection
- Préparer un plat en plastique de 100 mm qui pousse les cellules Neuro2a de façon semi-confluente dans un milieu de croissance normal.
REMARQUE : Il est nécessaire d’incuber à 37 °C pendant environ 48 à 72 heures après l’ensemencement précédent jusqu’à ce que la semi-confluence soit atteinte. - Retirer le milieu.
- Ajouter 0,5 mL de solution trypsine-EDTA dans le plat de culture cellulaire et les incuber à 37 °C pendant 1 min.
- Ajouter 9,5 mL de milieu de croissance normal dans le plat et suspendre les cellules détachées.
- En utilisant trypan bleu pour tacher les cellules mortes, compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou manuellement. Puis diluer les cellules dans le milieu de la culture (1,0 × 105/mL).
- Ajouter 2 mL de suspension cellulaire dans un plat en plastique de 35 mm pour la lyse cellulaire ou un plat de base en verre pour la mesure des cellules vivantes.
- Incuber le plat à 37 °C pendant 1 jour.
- Commencez les préparatifs suivants 15 minutes avant le jour de la transfection.
- Préparer deux tubes de 1,5 mL et ajouter 100 μL d’Opti-MEM I à chaque tube.
- Dans le premier tube, mélanger 1,0 μg d’ADN plasmide (solution A). Dans le deuxième tube, mélanger 2,5 μL de Lipofectamine 2000 (Solution B).
REMARQUE : Pour maintenir l’efficacité de la transfection, maintenez la quantité totale d’ADN la même. Pour réduire le niveau d’expression de la mesure du SFC dans les cellules vivantes, la fraction de l’ADN plasmide pour l’expression des protéines devrait diminuer (p. ex., 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R et 0,8 μg de mélange pCAGGS). En outre, gardez le même rapport entre le volume de Lipofectamine 2000 et la quantité d’ADN plasmide. - Mélanger délicatement la solution A et B en ajoutant un dans l’un ou l’autre tube, puis l’incuber pendant 1 min à température ambiante (solution C).
- Ajouter la solution C au milieu culturel; et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C.
3. Lyse cellulaire et échange moyen
- Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope de routine.
- Retirer le milieu dans le plat.
- Ajouter 2 mL de PBS à 25 °C pour laver le milieu. Retirez le PBS.
- Déposer le plat sur une plaque d’aluminium sur la glace concassée.
REMARQUE : Nous utilisons une plaque d’aluminium de 1 mm d’épaisseur coupée dans un magasin d’outils du dimanche ou disponible dans le commerce comme équipement de laboratoire. - Ajouter 200 μL de tampon de lyse à 4 °C. Secouez légèrement le plat afin que le tampon soit réparti uniformément au fond du plat.
- Racler le plat à l’aide d’un grattoir cellulaire et récupérer le lysate avec des débris cellulaires non résolus dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Centrifugeuse de la solution à 20 400 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
- Récupérez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL et gardez-le à 4 °C ou sur la glace.
REMARQUE : Ne pas congeler le lysate. - Pour les mesures des cellules vivantes, remplacez le milieu avant la mesure. Vérifiez l’attachement cellulaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Confirmer l’expression à l’aide d’un microscope à fluorescence.
4. Étalonnage de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
- Démarrez le système et exécutez le logiciel d’opération. Allumez l’Argon+ laser (458/477/488/514 nm). Stabiliser le système au moins pendant 30 min.
- Configurer le chemin optique: Splitter faisceau principal: HFT488; Miroir dichroïque: NFT600; Filtre barrière de fluorescence : filtre à bande 505-540 (BP505-540); Détecteur : photodiode d’avalanche (APD)).
- Réglez la taille du sténopé en entrant la valeur directement (66 μm; 1 unité aéroy).
- Ajouter la solution Rhodamine 6G (Rh6G) dans un puits de la chambre de verre de couverture sur la scène.
- Ajouter l’eau ultrapure d’immersion sur l’objectif. N’utilisez pas l’huile d’immersion.
- Placez la chambre au microscope. Déplacez l’étape à la position appropriée.
- Concentrez-vous sur la surface supérieure du verre en mesurant la lumière éparse de la surface vitrée. Après avoir abaissé l’objectif vers le bas, tournez le bouton de mise au point dans le sens des aiguilles d’une montre pour régler.
REMARQUE: Vérifiez la direction de rotation du bouton de mise au point car il est opposé entre ceux fabriqués au Japon et en Allemagne. - Soulevez le point focal à 200 μm au-dessus de la surface supérieure du verre pour observer l’intérieur de la solution.
- Cliquez sur le taux de comptage et surveillez le taux de dénombrement des photons.
- Augmenter graduellement la valeur des filtres à thon acousto-optique (AOTF) (p. ex., transmission au laser excitation) de sorte que la valeur du taux de comptage est supérieure à 10 kHz.
- Cliquez sur l’ajustement du sténopé et ouvrez l’assistant d’ajustement du sténopé. Trouvez la position du sténopé avec le plus grand nombre (un pic) de photons dans l’axe x et y.
- Tournez l’anneau de correction de la lentille objective de sorte que les comptes par molécule (CPM) valeur est la plus élevée.
REMARQUE : Puisque l’épaisseur du verre de couverture de la chambre spécifiée ici est de 0,12-0,17 mm, l’anneau de correction est à peu près à son minimum ou à quelques tours de celui-ci, où le CPM est à son maximum. - Diminuez progressivement la valeur AOTF de sorte que la valeur CPM devient 2-3 kHz.
- Acquérir la fonction d’autocorréation (ACF) de Rh6G pour 90 s.
- Une fois la mesure terminée, cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de l’ajustement de la courbe.
- Sélectionnez un modèle pour une diffusion tridimensionnelle (3D) à un composant avec un état triplet.
REMARQUE : Le Rh6G est monodisperse et diffus en un seul composant avec un état triplet. - Réglez l’heure de départ appropriée en déplaçant la ligne rouge. Cliquez sur Fit All et vérifiez l’écart d’ajustement. Après avoir effectué le raccord de courbe, assurez-vous que le temps de diffusion (DT) et le paramètre de structure (SP) sont à peu près dans la gamme de 20-30 μs et 4-8, respectivement.
- Rappelez-vous la valeur des paramètres structurels. Utilisez la valeur SP pour l’analyse du raccord de courbe de tous les APF mesurés le même jour, dans les mêmes conditions optiques, et en utilisant le même type de plat de base en verre ou de verre de couverture chambé placé sur la scène du microscope.
5. Mesure fcs dans le lysate cellulaire
- Préparer les lysates cellulaires (voir ci-dessus).
- Déposer le lysate sur la chambre en verre de couverture. Placez un couvercle pour éviter le séchage et le couvercle de scène pour l’ombrage léger.
- Définissez l’état d’acquisition, la puissance laser, le temps de mesure et les répétitions.
- Cliquez sur le taux de comptage et ajustez la valeur AOTF du laser de sorte que la valeur CPM devient supérieure à 1 kHz.
- Effectuez une mesure d’essai pendant 1 min. Vérifiez si l’ACF calculé montre une amplitude positive et une désintégration lisse.
- Effectuez la mesure principale pendant 5 min.
REMARQUE : Le temps total de mesure est progressivement augmenté jusqu’à ce que la forme de l’ACF ne change pas même si le temps de mesure est augmenté. - Cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de montage de courbe.
- Sélectionnez un modèle de diffusion 3D à deux composants avec un état triplet. N’oubliez pas d’entrer la valeur SP et de modifier son paramètre en « Fixe » et non « Gratuit » avant de cliquer sur Fit all.
- Exportez la table équipée comme un fichier texte délimité par onglet.
- Si nécessaire, exportez l’enregistrement des taux ACF et Count sous forme de fichier texte délimité par onglets.
6. Mesure fcs dans les cellules vivantes
- Remplacer le milieu par un milieu frais avant la mesure.
- Utilisez un incubateur de stades thermiques. Placez le plat de culture cellulaire sur la scène du microscope.
- Confirmez la mise au point et la position à l’aide du micrope confocal. Sélectionnez la cellule de mesure. Zoomez et ajustez la position de la cellule. Obtenez des images de fluorescence d’une cellule exprimant le GFP en utilisant le mode vitesse de balayage lent.
- Sélectionnez une position de mesure FCS à l’aide de la position dans la section « FCS ».
- Sélectionnez au moins un point de mesure FCS à l’aide d’un réticule(figure 1).
- Mesurer l’ACF pendant 1 min.
REMARQUE : Étant donné que les protéines fluorescentes ont tendance à être photobleached dans les cellules vivantes en raison du mouvement lent comparé à la solution, le temps de mesure devrait être minimum. Il est généralement difficile d’obtenir de l’ACF dans la cellule aussi facilement que les mesures de solution parce que la mesure prolongée conduira à la photobleaching des protéines fluorescentes. - Cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de montage de courbe à l’aide d’un modèle de diffusion 3D à deux composants avec un état triplet.
REMARQUE : Pour les mesures des cellules vivantes, un modèle de diffusion 3D à deux composants à l’état triplet serait préférable parce qu’il est empiriquement difficile de diminuer la valeur chi-carrée avec un modèle de diffusion 3D à un composant en raison de l’existence de divers composants mobiles dans la cellule vivante. Mais même en utilisant un modèle pour la diffusion 3D à trois composants, les composants de diffusion ne sont généralement pas séparés par rapport à l’utilisation du modèle pour deux composants.
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Representative Results
Nous avons effectué la mesure fcs de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire et SOD1-G85R-GFP dans les cellules vivantes. Dans les deux cas, une amplitude positive et des APF lisses ont pu être acquis. Nous avons montré qu’une partie du GFP-TDP25 exprimée dans les cellules Neuro2a a été récupérée dans la fraction soluble dans l’état indiqué6. Dans la fraction soluble du lysate cellulaire, des molécules de fluorescence extrêmement brillantes ont été détectées dans l’enregistrement du taux de nombre de photons à l’aide de FCS(figure 2A,haut, flèche). Ces « pointes (aussi appelées burst) » n’ont pas été observées chez les monomères GFP et la solution de colorant fluorescent chimique monodisperse, ce qui suggère que les pointes indiquent des protéines oligomériques9. L’analyse du raccord de courbe à l’aide d’un modèle supposant une diffusion 3D à deux composants à l’état triplet a montré que les molécules à diffusion rapide (DTFast = 186 μs) étaient ~90% et les 10% restants étaient de 2,3 ms(figure 2A, bas; et tableau 2).
Au cours de la mesure SOD1-G85R-GFP dans les cellules vivantes, l’enregistrement du taux de nombre de photons a montré une diminution graduelle, ce qui suggère sa photobleaching dans le volume de détection(figure 2B, en haut). Bien que la contribution du photobleaching ait été montrée dans une gamme plus longue que 1 s dans l’ACF, une amplitude positive et la décomposition lisse de l’ACF ont été observées (figure 2B,bas). L’analyse du raccord de courbe à l’aide d’un modèle supposant une diffusion 3D à deux composants à l’état triplet a montré que les molécules à diffusion rapide (DTFast = 397 μs) étaient ~93,4 % et que les 6,6 % restants étaient de 12,3 ms (tableau 2). La mutation liée à la SLA, G85R, dans SOD1 n’a pas permis une différence dramatique dans la propriété de diffusion comparée au type sauvage. Cependant, l’inhibition protéasome a diminué le taux de diffusion seulement dans le mutant G85R de SOD1 dans lecytoplasme 7.
Figure 1: Image fluorescente confoccale des cellules Neuro2a exprimant SOD1-G85R-GFP. Image fluorescente confoccale des cellules de Neuro2a exprimant SOD1-G85R-GFP. Le réticule indique la position de mesure fcs dans le cytoplasme. Barre = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Résultats typiques du SFC et courbes ajustées pour les fonctions d’autocorrépendation. (A et B) Haut : Taux de comptage des photons enregistrés dans la plage de temps de mesure fcs (ligne verte). Bas : Fonctions d’autocorrépendation calculées (APF; Lignes brutes et grises) et courbes ACF équipées à l’aide d’un modèle de diffusion tridimensionnelle à deux composants à l’état triplet (lignes Fit, magenta). G(τ) pour l’axe Y indique l’amplitude des APF à l’époque pour l’axe X. Les lignes de points affichent les points de début et de fin des temps appropriés. Les flèches bleu foncé montrent la pointe avec des protéines extrêmement brillantes passant par le volume de détection (c.-à-d. oligomers/agrégats solubles). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom du matériel et de l’équipement | Composants | Commentaires/Description |
| Solution Rhodamine 6G de 0,1 mM. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M Chlorure de sodium (NaCl) | ||
| Tampon de lyse | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1× cocktail inhibiteur de la protéase | Le cocktail inhibiteur de la protéase doit être mélangé juste avant la lyse cellulaire. |
| Milieu de croissance normal | DMEM complété avec 10% FBS et 100 U/mL pénicilline G et 100 mg/mL Streptomycine | La vérification du lot pour FBS devrait être nécessaire. |
| Salin tampon phosphate (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 |
Tableau 1 : Compositions de solutions
| CPM (kHz) | DTRapide (ms) | Composant rapide (%) | DTSlow (ms) | Composant lent (%) | |
| GFP-TDP25 en lysate | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP en cellule vivante | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tableau 2 : Valeurs ajustées typiques pour les fonctions d’autocorrépendation
Les valeurs ajustées pour les fonctions d’autocorrépendation sont représentées à la figure 2 à l’aide d’un modèle de diffusion tridimensionnelle bi-composante à l’état triplet. Les dénombrements par molécule (CPM), le temps de diffusion rapide et lent (DTFast et DTSlow,respectivement), et leurs composants (composant rapide et lent) sont représentés.
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Discussion
En ce qui concerne l’étalonnage du système avant les mesures, les mêmes verreries que celle utilisée pour mesurer l’échantillon devraient être utilisées (p. ex., les 8 puits couvrent la chambre de verre pour le lysate cellulaire et le plat de base en verre de 35 mm pour les cellules vivantes). En raison de l’adsorption de Rh6G sur le verre, sa concentration effective peut parfois diminuer. Si c’est le cas, une solution Rh6G hautement concentrée comme 1 μM doit être utilisée juste pour le réglage du sténopé. Des taux extrêmement élevés de nombre de photons doivent être évités pour protéger le détecteur (p. ex., plus de 1 000 kHz). En outre, la solution concentrée n’est pas appropriée pour l’acquisition de la fonction d’autocorrépendation (maintenir moins de 100 kHz). L’étalonnage de la position du sténopé est important. Si le système optique est utilisé fréquemment, il est rare pour la dislocation dramatique du sténopé; ainsi, l’utilisation de « Fine » au début n’est souvent pas un problème pour trouver la position appropriée. Si aucune position de pointe des taux de compture utilisant « Fine » n’est trouvée, utilisez le « Grossier » pour déplacer le sténopé d’une extrémité de la plage de mouvement à l’autre avant la recherche de position à l’aide de « Fine ». Si l’amplitude de l’ACF était plate, vérifiez si la mise au point et la position sont appropriées.
Après la mesure Rh6G et son raccord, si le DT et/ou le SP est hors de la plage indiquée, réesserez le sténopé et le réglage de l’anneau de correction. Lorsque vous vous affichez toujours hors de portée, nous vous recommandons de contacter le support du fabricant car il est probablement dû à la défection présumée du système optique. En utilisant le DT et le SP mesurés en plus du coefficient de diffusion connu de Rh6G (414 μm2/s)dans l’eau, la taille effective du faisceau peut être calculée parce que le DT dépend de la tailledu faisceau 10. En outre, comme le SP est le rapport de taille du faisceau et la hauteur du volume de détection efficace, le volume de détection peut être calculé. Le calcul du volume est nécessaire pour déterminer la concentration absolue. Plus de description du principe et du dépannage pendant l’étalonnage est également disponible dans les protocoles tels que rapportésprécédemment 11,12,13.
Quelques pointes ont été observées dans la mesure FCS de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire(figure 2A, en haut). Nous montrons que de tels pics ont été observés dans la mesure fcs de huntingtine agrégée-encline comprenant les répétitions élargies de polyglutamine étiquetées avec GFP ou protéine fluorescente jaune (YFP) (HttQ78 et HttQ143)9; il suggère ainsi des oligomers/agrégats solubles de GFP-TDP25 dans la fraction soluble du lysate cellulaire. Mais une telle population de pointe était rare ; ainsi, l’ACF et son résultat incurvé peuvent ne pas inclure une contribution majeure de ces pointes. Une raison possible pour seulement une petite quantité d’agrégats étant inclus dans la fraction soluble est probable parce que TDP25 est fortement aggregation-encline et ses agrégats sont fractionnés dans la fraction insoluble comme montré utilisant une fraction du lysate de cellules suivi de la détection occidentale de ballonnement6. Les phénomènes de la tendance à se rétablir à la fraction insoluble de protéines sujettes à l’agrégation ont souvent étéobservés 6,9. De tels oligomers/agrégats solubles ne peuvent pas être facilement détectés utilisant des méthodes biochimiques conventionnelles telles que SDS-PAGE suivies du ballonnement occidental ; ainsi, FCS a un avantage. Toutefois, il est difficile d’analyser plusieurs composantes à l’aide du SFC conventionnel parce qu’il mesure la population moyenne. Des procédures plus développementales combinées à une analyse non paramétrique bayésienne détermineraient les composantes multiples de l’échantillon sans aucune hypothèse pour lescomposantes 14.
Le temps de diffusion dans les cellules vivantes était relativement lent par rapport au lysate cellulaire. Puisque la viscosité dans la cellule est connue pour être plus élevée que cela dans des solutions telles que PBS et tampon détergent-contenant15,le temps de diffusion dans les cellules vivantes obtient théoriquement 2.5-3 fois plus longtemps. En raison de cette diffusion lente dans les cellules vivantes comparant dans la solution, le photobleaching des étiquettes fluorescentes peut souvent être provoqué. Pour corriger l’effet photobleaching sur les APF, certaines procédures telles que l’hypothèse exponentielle de décomposition16 et le filtrage du bruit à l’aide de la fonction d’ondeont été proposées 17. Bien que de telles corrections soient considérées comme efficaces, elles n’ont toujours pas été aussi simples pour les utilisateurs généraux parce qu’elles nécessitent des compétences en programmation. De plus, dans les mesures des cellules vivantes, la plage d’ajustement doit être déterminée avec plus de soin afin que la valeur chi-carrée de la courbe ajustée devienne petite. Comme le montre la figure 2B, la fourchette où G (τ) était inférieure à 1 a été exclue de la plage de montage. Alternativement, plus de balises fluorescentes photostables sont nécessaires pour analyser lentement la diffusion / déplacement des molécules. GFP est facile à utiliser comme étiquette, et sa stabilité est bonne, mais il est souvent photobleached pendant les mesures FCS. Pour surmonter cette propriété photostable, HaloTag avec tétramethylrhodamine (TMR) comme colorant fluorescent chimique a été disponible18. Toutefois, l’étiquetage incomplet par les ligands fluorescents (p. ex., TMR-ligand) et les piscines de teinture piégées sont des problèmes pour l’étiquetage spécifique des protéinesd’intérêt 19; ainsi, l’expression exogène des protéines d’intérêt étiquetées avec des protéines fluorescentes serait le premier choix pour l’étiquetage fluorescent dans les cellules vivantes.
Il existe de nombreux types de protéines fluorescentes, ainsi que des colorants fluorescents chimiques; cependant, comme indiqué dans cet article, le GFP amélioré monmérique (meGFP) est une étiquette facile à utiliser pour FCS aussi bien que d’autres microscopie de fluorescence parce que ses propriétés biochimiques et de fluorescence sont bien connues. Par conséquent, dans nos études, meGFP est le premier choix et généralement utilisé pour étiqueter les protéines sujettes à l’agrégation pour les mesures FCS6,7,9.
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Disclosures
Ces auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
A.K. a été soutenu par une subvention de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), par une subvention de la Fondation Nakatani pour la lutte contre les nouvelles infections coronavirus, par une subvention du Bureau de l’Université d’Hokkaido pour le développement des futurs leaders de la recherche (L-Station), et une subvention d’aide de la Fondation Hoansha. M. K. a été partiellement soutenu par une subvention du JSPS pour la recherche scientifique sur les domaines novateurs « Chimie pour biosystèmes d’entassement multimoléculaire » (#20H04686) et une subvention de la JSPS pour la recherche scientifique sur les domaines novateurs « Physique de l’information des questions vivantes » (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
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