Summary
В этой статье подробно описываются основные этапы измерения утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану с помощью метода пластырного зажима, нового подхода к изучению термогенной способности митохондрий.
Abstract
Митохондриальный термогенез (также известный как митохондриальное разъединение) является одной из наиболее перспективных целей для увеличения расхода энергии для борьбы с метаболическим синдромом. Термогенные ткани, такие как коричневые и бежевые жиры, развивают узкоспециализированные митохондрии для производства тепла. Митохондрии других тканей, которые в первую очередь вырабатывают АТФ, также преобразуют до 25% от общего производства митохондриальной энергии в тепло и могут, следовательно, оказывать значительное влияние на физиологию всего организма. Митохондриальный термогенез не только необходим для поддержания температуры тела, но также предотвращает ожирение, вызванное диетой, и снижает выработку активных форм кислорода (АФК) для защиты клеток от окислительного повреждения. Поскольку митохондриальный термогенез является ключевым регулятором клеточного метаболизма, механистическое понимание этого фундаментального процесса поможет в разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией. Важно отметить, что точные молекулярные механизмы, которые контролируют острую активацию термогенеза в митохондриях, плохо определены. Этот недостаток информации во многом связан с нехваткой методов прямого измерения разъединяющихся белков. Недавняя разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, позволила впервые непосредственно изучить явление, лежащее в основе митохондриального термогенеза, утечку H+ через ИММ, и первую биофизическую характеристику митохондриальных транспортеров, ответственных за него, разъединяющего белка 1 (UCP1), специфичного для бурых и бежевых жиров, и транспортера АДФ/АТФ (AAC) для всех других тканей. Этот уникальный подход даст новое представление о механизмах, которые контролируют утечку H + и митохондриальный термогенез, и о том, как они могут быть нацелены на борьбу с метаболическим синдромом. В этой статье описывается методология зажимов, применяемая к митохондриям для изучения их термогенной способности путем непосредственного измерения токов H+ через IMM.
Introduction
Митохондрии славятся тем, что являются электростанцией клетки. Действительно, они являются основным источником химической энергии, АТФ. Что менее известно, так это то, что митохондрии также генерируют тепло. Фактически, каждая митохондрия постоянно генерирует два типа энергий (АТФ и тепло), а тонкий баланс между двумя энергетическими формами определяет метаболический гомеостаз клеток (рисунок 1). Как митохондрии распределяют энергию между АТФ и теплом, безусловно, является самым фундаментальным вопросом в области биоэнергетики, хотя он до сих пор в значительной степени неизвестен. Мы знаем, что увеличение производства митохондриального тепла (называемое митохондриальным термогенезом) и, следовательно, снижение производства АТФ увеличивает расход энергии, и это один из лучших способов борьбы с метаболическим синдромом1.
Митохондриальный термогенез возникает из-за утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану (IMM), что приводит к разъединению окисления субстрата и синтеза АТФ с последующим производством тепла, отсюда и название «митохондриальное разъединение»1 (рисунок 1). Эта утечка H+ зависит от митохондриальных транспортеров, называемых разъединяющими белками (UCP). UCP1 был первым идентифицированным UCP. Он выражается только в термогенных тканях, буром жире и бежевом жире, в которых митохондрии специализируются на производстве тепла 2,3,4. Идентичность UCP в нежировых тканях, таких как скелетные мышцы, сердце и печень, остается спорной. Митохондрии в этих тканях могут иметь около 25% общей митохондриальной энергии, преобразованной в тепло, что может значительно повлиять на физиологию всего тела1. Помимо поддержания температуры тела, митохондриальный термогенез также предотвращает ожирение, вызванное диетой, уменьшая калории. Кроме того, он уменьшает выработку активных форм кислорода (АФК) митохондриями для защиты клеток от окислительного повреждения1. Таким образом, митохондриальный термогенез участвует в нормальном старении, возрастных дегенеративных расстройствах и других состояниях, связанных с окислительным стрессом, таких как ишемия-реперфузия. Поэтому митохондриальный термогенез является мощным регулятором клеточного метаболизма, и механистическое понимание этого фундаментального процесса будет способствовать разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией.
Митохондриальное дыхание было первым методом, раскрывшим решающую роль митохондриального термогенеза в клеточном метаболизме и до сих пор является самым популярным в сообществе1. Этот метод основан на измерении потребления кислорода митохондриальной цепью переноса электронов (ETC), которая увеличивается при активации утечки митохондриального H+. Этот метод, хотя и инструментальный, не может непосредственно изучать утечку митохондриального H+ через IMM1, тем самым затрудняя точную идентификацию и характеристику белков, ответственных за него, особенно в нежировых тканях, в которых производство тепла является вторичным по сравнению с производством АТФ. Недавно разработка метода пластыря-зажима, применяемого к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H+ по всему ИММ в различных тканях 5,6,7.
Митохондриальный пластырь-зажим всего ИММ был впервые установлен воспроизводимым способом Kirichok et al.8. Они описали первое прямое измерение токов митохондриального юнипортера кальция (MCU) в 2004 году с использованием митопластов из клеточных линий COS-78. Позже лаборатория Kirichok показала токи кальция из IMM тканей мыши9 и дрозофилы 9. Другие лаборатории в настоящее время регулярно используют этот метод для изучения биофизических свойств MCU 10,11,12,13,14. Анализ проводимости калия и хлорида также возможен и упоминался в нескольких статьях, но еще не был основным предметом публикации 6,7,9. Первое измерение токов H+ через IMM было зарегистрировано в 2012 году из митохондрий бурого жира мыши6 и из митохондрий мышиного бежевого жира в 2017году 7. Этот ток обусловлен специфическим разъединяющим белком термогенных тканей UCP1 6,7. Недавняя работа, опубликованная в 2019 году, охарактеризовала AAC как основной белок, ответственный за утечку митохондриального H+ в нежировых тканях, таких как сердце и скелетные мышцы5.
Этот уникальный подход теперь позволяет проводить прямой функциональный анализ с высоким разрешением митохондриальных ионных каналов и транспортеров, ответственных за митохондриальный термогенез. Чтобы облегчить расширение метода и дополнить другие исследования, такие как митохондриальное дыхание, ниже описан подробный протокол измерения токов H+ , переносимых UCP1 и AAC. Описаны три важных шага: 1) выделение митохондрий из мышиного бурого жира для анализа UCP1-зависимого тока H+ и митохондриальная изоляция от сердца для анализа AAC-зависимого тока H+ , 2) подготовка митопластов с помощью френч-пресса для механического разрыва внешней митохондриальной мембраны (OMM), 3) записи зажимов UCP1 и AAC-зависимых токов H+ по всему ИММ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры на животных, которые были выполнены, соответствуют руководящим принципам Национального института здравоохранения и были одобрены Калифорнийским университетом Лос-Анджелесского институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура выделения митохондрий основана на дифференциальном центрифугировании и незначительно варьируется от ткани к ткани. Например, поскольку коричневая жировая ткань чрезвычайно богата липидами, требуется дополнительный шаг для отделения клеточного мусора и органелл от липидной фазы перед сбором митохондрий. Чтобы избежать путаницы, две процедуры изоляции митохондрий (одна из бурого жира, а другая из сердца) подробно описаны ниже.
1. Митохондриальная изоляция из мышиного межлопастного бурого жира (модифицированная из Bertholet et al. 2020)15
- Усыпление самцов мышей C57BL/6 с использованием асфиксииCO2 и последующего вывиха шейки матки, как рекомендовано Группой Американской ветеринарной медицинской ассоциации и Комитетом IACUC.
- Расположив мышь брюхом лицом к столу, распылите спирт для очистки и намокания волос (модифицировано из Mann et al., 2014)16.
- Сделайте разрез 2 см в верхней части спины после захвата кожи пинцетом.
- Извлеките коричневый межлопаточный жир мыши, соответствующий двухлопастному органу с формой бабочки16.
- Переложите бурый жир в чашку Петри толщиной 35 мм, заполненную 5 мл буфера холодной изоляции (таблица 1), предварительно помещенную на лед.
- Очистите бурый жир от белого жира в бинокль.
- Переложите бурый жир в стакан объемом 10 мл с 5 мл буфера холодной изоляции (таблица 1), чтобы измельчить его на тонкие кусочки. Переложить на охлажденный льдом гомогенизатор стекла 10 мл (пестик из полиэтилена политетрафторэтилена (ПТФЭ)).
- Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации предварительно разрезанной ткани на льду шестью мягкими ударами с контролируемой скоростью 275 оборотов в минуту.
- Центрифугировать гомогенат при 8 500 х г в течение 10 мин при 4 °C в ледяной конической трубке объемом 15 мл. Отбросьте супернатант, содержащий липидную фазу.
- Повторно суспендировать гранулу в 5 мл ледяного изоляционного буфера (табл. 1) и гомогенизировать, во второй раз, суспензию на льду шестью медленными ходами со скоростью 275 оборотов/мин.
- Переложите гомогенат в 15 мл ледяной конической трубки и центрифугируйте его при 700 х г в течение 10 мин при 4 °C до гранул всех ядер и неразрывных клеток.
- Соберите супернатант в свежую трубку объемом 15 мл и поместите на лед.
- Центрифугируют супернатант при 8,500 х г в течение 10 мин при 4°С с получением гранулы, содержащей митохондрии.
- Повторно суспендировать гранулы, содержащие митохондрии в 3,8 мл ледяного гипертонико-маннитольного буфера (табл. 2) и инкубировать митохондриальную суспензию на льду в течение 10-15 мин.
2. Митохондриальная изоляция от сердца мыши (модифицировано из Garg et al. 2019)17
- Усыпление самцов мышей C57BL/6 с использованием асфиксииCO2 и последующего вывиха шейки матки, как рекомендовано Группой Американской ветеринарной медицинской ассоциации и Комитетом IACUC.
- После размещения мыши на спине распылите спирт, чтобы очистить и намочить волосы. Затем сделайте разрез 2 см на грудной клетке после захвата кожи пинцетом.
- Рассекните сердце из груди животного и промойте его, чтобы удалить всю кровь в стакане объемом 10 мл с 5 мл раствора для холодного выделения (таблица 1).
- После того, как сердце очищено от следов крови, перенесите его на другой стакан объемом 10 мл, содержащий 5 мл буфера холодной изоляции (таблица 1), чтобы измельчить его на тонкие кусочки. Затем переложить на охлажденный льдом стеклянный гомогенизатор 10 мл (пестик из PTFE).
- Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации предварительно разрезанной ткани на льду шестью мягкими ударами с контролируемой скоростью 275 оборотов в минуту.
- Переложите гомогенат в 15 мл ледяной конической трубки и центрифугируйте его при 700 х г в течение 10 мин при 4 °C к ядрам гранул и неразрывным клеткам.
- Соберите супернатант в свежую трубку объемом 15 мл и поместите на лед.
- Центрифугируют супернатант при 8,500 х г в течение 10 мин при 4°С с получением гранулы, содержащей митохондрии.
- Повторно суспендируют митохондриальную гранулу в 3,8 мл ледяного гипертонико-маннитольного буфера (таблица 2) и инкубируют митохондриальную суспензию на льду в течение 10-15 мин.
3. Подготовка митопластов френч-прессом для механического разрыва ОММ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Французская процедура прессования позволяет освободить IMM от OMM с сохранением его целостности, включая матрицу и crista (рисунок 2)18. Митохондрии предварительно инкубируют в гипертонально-маннитольный буфер (таблица 2) и подвергают более низкому давлению во время процедуры френч-прессования, чтобы избежать резкого растяжения ИММ при разрыве ОММ.
- Заполните митохондриально-гипертоническую-маннитольную суспензию в охлажденную мини-ячейку давления (диаметр поршня 3/8") френч-пресса (рисунок 3А).
- Выберите средний режим френч-пресса и сожмите суспензию через мини-ячейку давления при 110 на циферблате френч-пресса для митохондрий бурого жира и при 140 для митохондрий сердца (~ 2000 фунтов на квадратный дюйм). Убедитесь, что суспензия выходит из мини-напорной ячейки со скоростью около 1 капли / с.
- Соберите капли в 15 мл охлажденной льдом конической трубки.
- Центрифугировать суспензию при 10 500 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Повторно суспендируют гранулы митопластов в 0,5-2 мл ледяного буфера Hypertonic-KCl (таблица 3) и хранят суспензию на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Митопласты бурого жира и сердца готовы к записи зажимов и должны оставаться пригодными для использования в течение примерно 3-6 ч.
4. Электрофизиологические записи утечки H+ через UCP1 и AAC 5,7,15
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую электрофизиологическую установку (рисунок 3B): инвертированный микроскоп с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC), объектив погружения в воду 60x, стол виброизоляции и клетку Фарадея, стандартный усилитель, поддерживающий малошумные записи, стандартный дигитайзер, используемый для электрофизиологической установки, pClamp 10, микроманипулятор, опорный электрод ванны (солевой мост 3 M KCl-agar, вставленный в держатель микроэлектрода, содержащий гранулу хлорида серебра / серебра в корпус держателя (описанный в Liu et al. 2021)19, перфузионная камера с 0,13 мм стеклянным покровным дном, соединенным с гравитационной перфузионной системой.
- Потяните боросиликатные стеклянные нити в день записи с помощью съемника микропипетки. Установите программу на съемник, используемый для генерации пипеток с высокой степенью воспроизводимости20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конструкция программы требует нескольких попыток получить пипетки, оптимизированные для патч-зажима IMM. Стандартная пипетка имеет тонкие наконечники с прогрессивной конической формой. - Вставьте одну стеклянную нить в съемник и потяните, чтобы получить почти две одинаковые патч-пипетки из одной боросиликатной нити.
- Отрегулируйте программу, когда пипетки становятся непоследовательными между циклами вытягивания из-за старения нити нагревательной коробки съемника.
- Поместите пипетку внутрь полировальной машины и поместите наконечник рядом с нитью накаливания под 100-кратным увеличением, чтобы отполировать ее огнем.
- Нажмите ножную педаль несколько раз, чтобы нагреть нить накала, не забивая и не повреждая кривую наконечника.
- Полируйте до тех пор, пока не будут получены пипетки с сопротивлением от 25 до 35 МОм при заполнении раствором пипетки на основе ТМА (ТМА для гидроксида тетраметиламмония, таблица 4).
- Предварительно инкубировать обшивки (диаметр 5 мм, толщина 0,1 мм) с 0,1% желатином для уменьшения адгезии митопласта и промыть их раствором для ванны KCl (таблица 5) перед нанесением суспензии митопласта.
- Готовят сырое разбавление путем смешивания ~35 мкл концентрированной суспензии митопласта с 500 мкл раствора для ванны KCl (таблица 5) и помещают его на крышки, предварительно помещенные в колодец из 4-луночной пластины.
- Инкубировать на льду в течение 15-20 мин для митопластов до осадка на покровном листе.
- Заполните камеру ванны полностью ~50 мкл раствора для ванны KCl (таблица 5).
- Перенесите крышку с митопластами в камеру с помощью тонкого микродиссекционного пинцета с изогнутым наконечником.
- Расположите крышку в нижней части камеры. Не перфузируйте камеру, чтобы митопласты оставались стабильными на крышке.
- Выберите индивидуальный неадгезивный митопласт в форме 8, отсканировав крышку под микроскопом с 60-кратным объективом.
- Загрузите пипетку раствором пипетки (~50 мкл) и поместите ее в держатель пипетки.
- Поднесите пипетку в раствор ванны с помощью микроманипулятора и подойдите к ней чуть выше выбранного митопласта, чтобы приблизиться к ИММ. Программа усилителя дает сопротивление пипетки, как только она находится в растворе ванны. Удерживайте мембранный потенциал на уровне 0 мВ и подавайте импульсы 10 мВ с помощью команды мембранного теста в программе усилителя.
- Примените небольшое отрицательное давление, чтобы быстро создать гигазиал с помощью IMM (рисунок 2B).
- Поднимите пипетку с прикрепленным митопластом, чтобы держать их подальше от крышки, чтобы избежать поломки уплотнения из-за дрейфа пипетки во время эксперимента.
- Компенсируйте блуждающие емкостные переходные процессы с помощью команды «мембранный тест» в программе усилителя перед тестированием конфигурации всего митопласта для получения правильного измерения емкости (Cm) для мембраны митопласта после взлома.
- Примените кратковременные (5-15 мс) импульсы напряжения (250-600 мВ) с помощью программы усилителя, чтобы разорвать мембранный пластырь под стеклянной пипеткой и достичь конфигурации всего митопласта (рисунок 2C). Успешная обкатка отражается повторным появлением емкостных переходных процессов.
- После обкатки установите емкостные переходные процессы с помощью опции мембранного теста программы усилителя для оценки емкости мембраны (отражающей размер митопласта) и его сопротивления доступу Ra (отражающего качество конфигурации всего митопласта). После обкатки Ra должен составлять от 40 до 80 МОм. Митопласты (размером 2-6 мкм), используемые для экспериментов с зажимами, обычно имеют мембранные емкости 0,5-1,1 пФ.
- Сразу после обрыва замените раствор для ванны KCl (таблица 5) раствором для ванны HEPES (таблица 6), начав перфузию.
- Применяйте протокол рампы 850 мс, разработанный с помощью программы усилителя, от -160 мВ до +100 мВ с интервалом 5 с, удерживая митопласт на 0 мВ. Этот протокол работает для исследований UCP1 6,7,15 и AAC5 (рисунок 4 и рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для UCP1 и AAC-зависимых измерений тока H+ рекомендуется получать все электрофизиологические данные на частоте 10 кГц и фильтровать на частоте 1 кГц с использованием соответствующего программного обеспечения, приводящего в действие усилитель и дигитайзер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H+ через IMM и митохондриальные транспортеры, UCP1 и AAC, которые отвечают за нее. Электрофизиологический анализ UCP1- и AAC-зависимых Утечек H+ может дать первый взгляд на термогенную емкость митохондрий. В разделе результатов описываются стандартные процедуры измерения утечки H+ через UCP1 и AAC.
UCP1-зависимое измерение тока H+ (рисунок 4)6,7,15
Применение протокола повышения напряжения индуцирует ток H+ большой амплитуды через ИММ бурого жира без добавления экзогенных жирных кислот (ФА), необходимых активаторов ИКП (рисунок 4А). Это специфическая характеристика бурого и бежевого жира IMM из-за местной продукции FA за счет активности фосфолипазы, связанной с мембраной. Когда ток H+ развивается в ответ на протокол рампы, важно дождаться стабилизации амплитуды тока. Количественная оценка амплитуды тока H+ через UCP1 требует определения базовой линии, соответствующей нулевому току UCP1. После достижения стабильности амплитуды тока H+ рекомендуется перфузить либо ингибитор UCP1 гуанозиндифосфат (GDP - 1 мМ, рисунок 4A), либо хелатор FA (0,5% FA-свободный бычий сывороточный альбумин, не показан), либо 10 мМ метилбетациклодекстрина (MβCD) для экстракции эндогенной мембраны FA, рисунок 4B, черный след). Остаточный ток - это ток, от которого будет определяться амплитуда токов UCP1. Чтобы помочь сравнить амплитуды токов UCP1 в разных митопластах, плотность тока (pA / pF) каждого митопласта рассчитывается путем нормализации токов UCP1 с емкостью митопласта (Cm) 5,7. Ток может быть реактивирован путем добавления экзогенной длинноцепочечной ФА с использованием арахидоновой кислоты (АА) или олеиновой кислоты (ОА) (1-2 мкМ). Поскольку как бурые, так и бежевые жировые ИММ обладают активностью PLA2, эндогенные мембранные FA частично регенерируются в течение нескольких минут после промывки MβCD/альбумина из ванны, что приводит к реактивации тока H+ через UCP1 6,7. Как и ожидалось, этот ток полностью исчезает в ИММ мышей UCP1-/- (рисунок 4A)6,7.
Более точным способом сравнения плотности и активности UCP1 различных митопластов одной и той же ткани или митопластов из разных тканей (коричневого и бежевого жира) является контроль концентрации ФА на поверхности ИММ 6,7. Действительно, амплитуда тока H+ может варьироваться между митопластами из-за количества белка UCP1 на ИММ, а также из-за производства эндогенной ФА. Таким образом, рекомендуется извлекать эндогенную ФА из ИММ и реактивировать UCP1-зависимый H+ ток путем добавления экзогенной ФА в известной концентрации. Для этого эндогенные ФА должны быть сначала извлечены из ИММ путем перфузии раствора для ванны HEPES (таблица 6), содержащего 10 мМ MβCD. Затем, чтобы обеспечить реактивацию тока H+ через UCP1 только точной концентрацией экзогенных FA, последние будут перфузированы на фоне HEPES/MβCD для непрерывного извлечения FA, полученных из IMM.
Изучение конкуренции между пуриновым нуклеотидом и ФА за связывание с UCP1 также возможно с помощью метода пластырь-зажим 6,7,15. Ингибирование UCP1 пуриновыми нуклеотидами (например, Mg2+ без АТФ) можно сравнить с двумя различными концентрациями FA (в идеале в 10 раз). С этой целью эндогенную мембрану FA сначала удаляют путем нанесения 10 мМ MβCD (рисунок 4B, черный след). Применение экзогенных ФА (например, здесь показано только 0,5 мМ ФА), применяемых на фоне 10 мМ MβCD, позволяет точно контролировать концентрацию активирующих ФА, поскольку локально произведенные ФА немедленно извлекаются из мембраны. В этом состоянии экзогенные ФА в первую очередь отвечают за развитие тока H+. Различные концентрации АТФ впоследствии добавляют в раствор ОА/МиХД для оценки IC50АТФ для каждой испытанной концентрации ФА и, таким образом, для установления того, конкурирует ли ФА с пуриновыми нуклеотидами за связывание с UCP1.
AAC-зависимое измерение тока H+ (рисунок 5)5
В отличие от бурого жира, ИММ нежировых тканей, таких как скелетные мышцы и сердце, не развивает измеримый H+ сразу после взлома (рисунок 5, черные следы). Чтобы индуцировать измеримый ток H+ через AAC, необходимо применять раствор для ванны HEPES (таблица 6), содержащий 1-2 мкМ экзогенной ФА (АА, рисунок 5А, красный след). Это может указывать на то, что ИММ нежировых тканей не имеет механизма производства ФА в МММ, как это содержится в ИММ коричневых и бежевых жиров.
Исходный уровень (или нулевой ток) для количественной оценки амплитуды тока H+ через AAC соответствует раствору ванны HEPES (таблица 6), перфузировавшемуся на поверхности ИММ до добавления FA. Чтобы подтвердить, что измеренный ток H+ переносится AAC, важно применять специфические ингибиторы AAC, добавленные к FA, 1 мкМ карбоксиатрактилозида (CATR, рисунок 5A) или 4 мкМ бонкгревиновой кислоты (BKA, не показаны)5, которые почти полностью ингибируют ток H+ . Этот ток полностью исчезает в ИММ мышей AAC1-/- (рисунок 5A), причем AAC1 является преобладающей изоформой в сердце5.
Патч-зажимный анализ взаимодействия между FA-зависимой утечкой H+ и нуклеотидами также возможен с AAC5. Однако существует важное различие между AAC и UCP1: AAC не только несет H+, но и его основная функция заключается в транспортировке адениннуклеотидов ADP и ATP21. Чтобы изучить, как обмен адениннуклеотидов влияет на FA-зависимую утечку H+ , в раствор пипетки добавляют 1 мМ Mg2+ свободный АДФ. Затем FA перфузируются для активации тока H+ через AAC. Только ADP в растворе пипетки не влияет на ток H+ 5. Как только достигнута стабильная амплитуда тока H+ , ADP перфузируется одновременно с FA. Только когда АДФ присутствует с обеих сторон мембраны для генерации активного нуклеотидного обмена через AAC, достигается постоянное, но никогда не достигающееся полного ингибирования утечки H+ (рисунок 5B). Это может указывать на то, что два вида транспорта AAC (ток FA-H+ и обмен ADP/ATP) конкурируют и, вероятно, происходят через один и тот же транслокационный путь. Гомообмен ADP/ADP был выбран таким образом, чтобы избежать дополнительного тока, связанного с физиологическим гетерообменом ADP/ATP 5.
Рисунок 1: Распределение митохондриальной энергии между теплом и производством АТФ. Механизмы митохондриального АТФ и производства тепла. Митохондрии имеют две мембраны [OMM (фиолетовый) и IMM (оранжевый)], которые содержат механизм для АТФ и производства тепла. ETC генерирует электрохимический градиент H+ через ИММ, который используется АТФ-синтазой (AS) для производства АТФ и используется UCP для выработки тепла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Метод митохондриального пластырного зажима (модифицированный из Bertholet et al. 2020)15. (A) Митохондрии выделяют из тканевого лизата центрифугированием (OMM в фиолетовом и IMM в оранжевом). (B) Французский пресс низкого давления разрывает OMM для высвобождения IMM, который дает митопласт. Левая панель представляет собой митопласт, который принимает 8-образную форму с остатками ОММ, прикрепленными к ИММ. Стеклянная пипетка приближается к IMM, чтобы сформировать гигаомное уплотнение (конфигурация, прикрепленная к митопласту). Фотография конфигурации, прикрепленной к митопласту, показана на правой панели. (C) Конфигурация цельного ИММ (диаграмма на левой панели) получается после разрыва мембранного пластыря под пипеткой несколькими импульсами напряжения (200-500 мВ). Фотография всей конфигурации IMM показана на правой панели. Внутренние токи (I, красный) отрицательны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Французская пресса и электрофизиологическая установка. (A) Изображение французской прессы, которая помогает разорвать OMM для выпуска IMM. (B) Изображение клетки Фарадея, инвертированного микроскопа с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC), 60-кратного погружного объектива в воду, таблицы виброизоляции и микроманипулятора. Стандартный усилитель, стандартный дигитайзер и пк-компьютер не показаны на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ток H+ через UCP1 в буром жире. (A) Репрезентативный UCP1-зависимый ток H+ , зарегистрированный из митопласта бурого жира, выделенного из WT (верхняя панель) и UCP1−/− мышей (нижняя панель). Следы контрольного тока H+ , показанные черным цветом, соответствуют стабилизированной амплитуде тока после разрыва IMM. Затем 1 мМ ВВП добавляют в раствор для ванны (оранжевый). Протокол рампы напряжения показан над трассами WT. рН растворов ванны и пипетки показан на диаграмме пипетки-митопласта. (Б) Ингибирование UCP1 пуриновыми нуклеотидами в буром жире. Репрезентативные UCP1-зависимые следы тока H+ в различных концентрациях АТФ на цитозольной грани ИММ бурого жира мышей при термонейтральности. UCP1-зависимый ток H+ активировался олеиновой кислотой (ОА) 0,5 мМ, смешанной с 10 мМ MβCD.Протокол напряжения указан вверху. В нижней панели представлен тот же след, но не нормализован емкостью мембраны митопласта. Митопласт бурого жира на этом рисунке имел мембранную емкость 0,624 пФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: FA-зависимый H+ ток через AAC в митопласте сердца. (A) Репрезентативный AAC-зависимый ток H+ при применении 2 мкМ АА в растворе для ванны (верхняя панель, оранжевый) в митопластах сердца WT и ингибируется 1 мкМ CATR (фиолетовый). Репрезентативные следы, зафиксированные в митопласте сердца AAC1 −/−, находятся в нижней панели. Контрольный ток выделен черным цветом. Протокол рампы напряжения показан над трассами WT. рН растворов ванны и пипетки показан на диаграмме пипетки-митопласта. (B) В то время как раствор пипетки содержал 1 мМ АДФ, ААС-зависимый ток H+ индуцируется 2 мкМ АА (оранжевый) и ингибируется добавлением 1 мМ АДФ к ванне (фиолетовый). Протокол рампы напряжения показан над трассировкой. рН растворов ванны и пипетки показан на диаграмме пипетки-митопласта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Конечная концентрация |
| сахароза | 250 мМ |
| ХЕПЕС | 10 мМ |
| ЭГТА | 1 мМ |
| pH скорректирован до 7,2 с TrisBase |
Таблица 1: Буфер изоляции митохондрий (тонус ~ 300 ммоль на кг)
| Реагент | Конечная концентрация |
| сахароза | 140 мМ |
| D-маннит | 440 мМ |
| ХЕПЕС | 10 мМ |
| ЭГТА | 1 мМ |
| pH скорректирован до 7,2 с TrisBase |
Таблица 2: Гипертонально-маннитольный буфер
| Реагент | Конечная концентрация |
| ККл | 750 мМ |
| ХЕПЕС | 20 мМ |
| ЭГТА | 1 мМ |
| pH скорректирован до 7,2 с TrisBase |
Таблица 3: Гипертонический буфер KCl
| Реагент | Конечная концентрация |
| Тма | 130 мМ |
| ХЕПЕС | 100 мМ |
| ЭГТА | 1 мМ |
| MgCl2 для записей UCP1 | 2 мМ |
| или | |
| TrisCl для записей AAC | |
| pH, скорректированный до 7,0 или 7,5 с D-глюконовой кислотой |
Таблица 4: Раствор пипетки на основе ТМА (тонус ~ 360 ммоль на кг)
| Реагент | Конечная концентрация |
| ККл | 150 мМ |
| ХЕПЕС | 10 мМ |
| ЭГТА | 1 мМ |
| pH скорректирован до 7.0 с TrisBase |
Таблица 5: Раствор для ванны KCl (тонус ~ 300 ммоль на кг)
| Реагент | Конечная концентрация |
| сахароза | 100 мМ для записей UCP1 |
| или | |
| 150 мМ для записей AAC | |
| ХЕПЕС | 150 мМ для записей UCP1 |
| или | |
| 100 мМ для записей AAC | |
| 1 мМ ЭГТА | |
| pH скорректирован до 7.0 с TrisBase |
Таблица 6: Раствор для ванны HEPES (тонус ~ 300 ммоль на кг)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья о методе направлена на то, чтобы представить метод зажимов, недавно примененный к митохондриям, новый подход к непосредственному изучению утечки H+ через IMM, ответственный за митохондриальный термогенез 5,6,7,15. Этот метод не ограничивается тканями, а также может быть использован для анализа утечки H+ и других проводок IMM в различных стандартных моделях человека и клеток, таких как HAP1, COS7, C2C12 и MEF-клетки. Тем не менее, каждая изоляция митохондрий требует некоторых корректировок, специфичных для каждого типа клеток или тканей.
Основные этапы прямого измерения токов H+ через ИММ бурого жира 5,6 и сердца5 обобщены здесь, чтобы проиллюстрировать механизмы, ответственные за митохондриальный термогенез в специализированных термогенных и нежировых тканях. Действительно, разработка этого метода впервые позволяет проводить функциональный анализ с высоким разрешением двух основных UCP (UCP1 и AAC) в их родной мембранной среде с точным контролем критических экспериментальных условий, таких как: 1) рН растворов пипеток и ванн, 2) контроль мембранного потенциала через IMM и 3) точный состав растворов для исключения любых ионов и метаболитов, проницаемых для ИММ, отличных от H+. Пипетки на основе ТМА (Таблица 4) и растворы для ванн HEPES (Таблица 6) разработаны для регистрации токов H+ и содержат только соли, которые диссоциируют на крупные анионы и катионы, обычно непроницаемые для ИММ. В то время как раствор для ванны может быть изменен с помощью перфузионной системы, позволяющей применять различные процедуры на цитозольной стороне мембраны, невозможно изменить состав интрапипетного раствора. Это ограничивает понимание регуляторных механизмов, которые встречаются на матричной стороне. Действительно, соединения должны присутствовать в растворе интрапипетки во время заполнения пипетки. Поэтому утечку H+ можно изучать в изоляции от других токов. Фармакологические исследования и использование мышей KO имели важное значение для характеристики и идентификации белков, ответственных за ток H+, через ИММ различных тканей 5,6,7. Эти результаты установили, что UCP1 является основным UCP коричневого и бежевого жира и AAC в нежировых тканях. Мы не можем полностью исключить возможность существования других токов H+, не опосредованных UCP1 и AAC. Однако, если существуют другие токи H+, их амплитуда была выше разрешения нашей электрофизиологической установки. Мы не измеряем H+ перекачку внеземных цивилизаций в условиях, описанных в этой статье. Как только мы достигнем полной конфигурации ИММ, митохондриальный матрикс вымывается перфузией внутрипипетного раствора. Межмембранное пространство больше не существует с момента разрыва OMM с французской прессой. Не были добавлены субстраты респираторных комплексов, имеющих решающее значение для прокачки H+ через ETC. Поэтому маловероятно, что будет развиваться активное перекачивание H+ в электрофизиологических условиях, описанных здесь.
Одноканальные записи иссеченных патчей в этой статье не описаны. Хотя UCP1- и AAC-зависимые токи H+ через IMM являются надежными из-за их высокой плотности белка, одноканальные отверстия не могут быть разрешены, потому что амплитуда унитарных токов UCP1 и AAC, вероятно, слишком мала.
В отличие от биохимических исследований, митохондриальная изоляция, описанная в этой статье, не должна приводить к высокому уровню чистоты митохондрий. Действительно, митохондриальный препарат, состоящий из множества индивидуализированных митопластов и клеточного мусора, сканируется под микроскопом, чтобы найти один 8-образный митопласт для пластыря. 8-образная форма митопласта обусловлена высвобождением ИММ через отверстие в ОММ, вызванное процедурой френч-прессования (рисунок 2). Менее плотная доля соответствует IMM15,17. Подходящий препарат может быть определен свободно движущимися митопластами, которые можно легко отличить от клеточного мусора. Однако важно уменьшить количество мусора, чтобы избежать загрязнения ИММ, что может повлиять на качество уплотнения стеклянной пипетки с мембраной. Этот этап сканирования под микроскопом позволяет выбрать митопласт с высокой целостностью ИММ, распознаваемой менее плотной долей, чем та, которая ограничена OMM, и, следовательно, увеличивает шансы на успешную взлом.
Этот метод впервые обеспечил прямое измерение UCP1- и AAC-зависимых токов H+ в их родной мембране. Тем не менее, митохондриальная целостность и компартментализация больше не существуют из-за разрыва OMM и, вероятно, крист. Поэтому важно дополнить анализ пластырей другими классическими методами, такими как митохондриальное дыхание, чтобы подтвердить физиологическую роль недавно охарактеризованных белков в интактных митохондриях.
Метод пластырного зажима, применяемый к митохондриям, предлагает новые возможности для лучшего понимания молекулярных механизмов, ответственных за утечку и термогенез митохондрий H+ . В сочетании с современными клеточными и молекулярными методами этот инновационный подход даст новое представление о механизмах, которые контролируют термогенную способность митохондрий, и о том, как они могут быть нацелены на борьбу с заболеваниями, связанными с митохондриальной дисфункцией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Я благодарю доктора Юрия Киричка за великую науку, частью которой я был в его лаборатории, и членов лаборатории Киричка за полезные дискуссии. Я также благодарю доктора Дугласа К. Уоллеса за предоставление нокаутирующих мышей AAC1 . Финансирование: A.M.B была поддержана премией Американской кардиологической ассоциации за развитие карьеры 19CDA34630062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
