Aqui descrevemos um protocolo para empacotamento de pseudovírus e a medição da atividade neutralizante de anticorpos.
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Artigo de método
Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens. Ocasionalmente, os seres humanos também são vítimas dela, o que resulta em alta mortalidade. No entanto, a pesquisa do vírus da GAAP é frequentemente dificultada, considerando que deve ser manuseada dentro de laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus provam ser as ferramentas ideais para estudar anticorpos neutralizantes contra os vírus H5 da GAAP. Este protocolo descreve os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 GAAP e ensaios de neutralização de pseudovírus. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios.
Introdução
Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos contínuos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens, sendo responsáveis por enormes perdas socioeconômicas na indústria avícola global. Algumas vezes, os seres humanos também se infectam com ela, diante de uma alta taxa de letalidade 1,2. No entanto, a pesquisa do vírus da IAAP é frequentemente dificultada, uma vez que não pode ser manuseada fora dos laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens....
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Protocolo
Todas as operações experimentais relacionadas a pseudovírus foram realizadas sob condição ABSL2 no Institut Pasteur da Academia Chinesa de Ciências de Xangai (IPS, CAS). Os experimentos com animais foram realizados com base nos protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do IPS, CAS.
1. Embalagem de pseudovírus com transfecção cálcio-fosfato
- Realizar suspensões unicelulares de células HEK293FT (9 x 105 por mL) em meio DMEM completo (Tabela 1). Adicionar 10 ml das suspensões unicelulares a um balão T75, incubar as células numa estufa a 37 °C, 5% de....
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Resultados
Expressão das proteínas p24 HA, NA e HIV-1 do pseudovírus influenza
Para identificar a eficiência da embalagem viral, os estoques de pseudovírus influenza foram detectados pela primeira vez pelo ensaio de AH (Figura 2A). As unidades de AH por mililitro de pseudovírus influenza são 643 (Tabela 3). Ensaios de western-blot e ELISA sanduíche foram usados para testar a expressão das proteínas HA, NA e HIV-1 p24. Em seguida, foram calculadas as proporções de un.......
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Discussão
HEK293FT células são geralmente usadas como células de empacotamento para produzir pseudovírus. A detecção regular de micoplasma é essencial durante a cultura celular. A contaminação por micoplasma pode diminuir drasticamente o rendimento do pseudovírus e, às vezes, próximo de zero. Comparadas com outras contaminações, as contaminações por micoplasma não levam a alterações no valor de pH ou turbidez do meio de cultura celular. Mesmo uma alta concentração de micoplasma não é visível a olho nu ou ao microscópio. Três métod.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de pesquisa do Projeto de Capacitação em Inovação da província de Jiangsu (BM2020019), Projeto Científico e Tecnológico de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), Programa de Pesquisa Estratégica Prioritária da Academia Chinesa de Ciências (XDB29030103), Projeto Científico e Tecnológico de Guangdong (No. 2020B1111340076) e o Programa de Pesquisa Aberta do Laboratório da Baía de Shenzhen (No. SZBL202002271003).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagente |
| 96 placas de cultura de células de poços (fundo plano) | Thermo fisher scientific | 167008 | material consumível |
| 96 placas de cultura de células (fundo redondo) | Thermo fisher scientific | 163320 | material consumível |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | - | Equipamento / Centrífuga |
| Seringas de insulina BD | BD 324910 | material consumível | |
| Cloreto de cálcio anidro | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagente |
| difosfato de cloroquina | Selleck | S4157 | Reagente |
| Dulbecco ' s Modificado Eagle Médio (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagente |
| Fetal Soro | Bovino Gibco | 16000-044 | Reagente |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Linha celular |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagente |
| HIV-1 p24 Antígeno ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Kit de reagentes |
| Luciferase Asme Sistema de ensaio Freezer Pacote | Promega | E4530 | Kit de reagentes |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Linha celular |
| Tubos de microcentrífuga 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | material consumível |
| Nunc Tubos de centrífuga cônicos 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | material consumível |
| Nunc Tubos de centrífuga cônicos 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | material consumível |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | material consumível |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Reagente |
| Pontas de Pipeta (10 μ L) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | material consumível |
| Pontas de pipeta (100 μ L) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | pontas de pipeta de material consumível |
| (1000 μ L) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | material consumível |
| Pipetas sorológicas (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | material consumível |
| Pipetas sorológicas (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | material consumível |
| Tripsina / EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagente |
| Varioskan Flash | Thermo fisher científico | -- | Equipamento/leitor de microplacas |
| Incubadora de camisa de água | Thermo fisher scientific | 3111 | Incubadora de equipamentos/células |
| Sal de sódio de pentobarbital | Sigma | 57-33-0 | Reagente |
Referências
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z.
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Reimpressões e permissões
