Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos contínuos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens, sendo responsáveis por enormes perdas socioeconômicas na indústria avícola global. Algumas vezes, os seres humanos também se infectam com ela, diante de uma alta taxa de letalidade ^1,2. No entanto, a pesquisa do vírus da IAAP é frequentemente dificultada, uma vez que não pode ser manuseada fora dos laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus são seguros o suficiente para serem praticados em laboratórios de nível 2 de biossegurança.

Os pseudovírus H5 da GAAP pertencem a vírus quiméricos que consistem em núcleos de vírus substitutos, envelopes lipídicos com glicoproteínas de superfície de vírus influenza e genes repórteres. Os núcleos de pseudovírus são geralmente derivados do vírus da imunodeficiência humana lentiviral (HIV), retrovírus como o vírus da leucemia murina (MLV) e o vírus da estomatite vesicular (VSV)³. Especificamente, o sistema de embalagem do HIV-1 é amplamente utilizado para produzir pseudovírus influenza, onde os genes primários fornecidos são gag e pol. O gene da mordaça do HIV expressa proteínas centrais. O gene pol expressa a integrase e a transcriptase reversa, ambas necessárias para a expressão do gene repórter em células transduzidas. Mimetizando o genoma do vírus substituto, o gene repórter é abraçado no núcleo do pseudovírus na forma de RNA. O gene repórter expressará a proteína nas células hospedeiras. Os níveis de expressão gênica dos genes repórteres podem ser usados para medir a eficiência da infecção por pseudovírus ^3,4. O repórter primário é a luciferase de vagalume para medir as unidades de luminescência relativa (RLU) ou atividade relativa de luciferase (RLA) em células transduzidas. Outros repórteres como lacZ, Gaussia e Renilla luciferase também são usados, só que em menor grau⁵.

Os pseudovírus são ferramentas ideais para o estudo de anticorpos neutralizantes contra o vírus H5 HAPI. Para medir a potência do anticorpo neutralizante, ensaios de neutralização de pseudovírus (NP)⁶ são usados. A hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) são glicoproteínas da superfície do vírus influenza A ^7,8. O AH é composto por um domínio da cabeça globular para ligação ao receptor e um domínio do tronco para fusão da membrana. A proteína NA tem atividade de sialidase para facilitar a liberação do vírus ^7,8. Um ensaio de NP pode medir anticorpos neutralizantes direcionados às proteínas HA. Anticorpos neutralizantes direcionados para a região da cabeça e tronco do AH também podem ser detectados por ensaios de adesão e entrada viral. Em comparação com vírus selvagens, os experimentos de neutralização de pseudovírus têm valores de detecção mais sensíveis, podem ser manuseados com segurança em um laboratório de biossegurança de nível 2 e geralmente são mais fáceis de operar na prática.

Este protocolo apresenta em detalhes os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 da GAAP e ensaios de NP. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios. Neste estudo, a cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) do vírus H5N1 da GAAP foi usada como exemplo. Para a obtenção dos soros imunes utilizados nos ensaios, esse protocolo selecionou a proteína HA originária da cepa TH como imunogênio para imunizar camundongos.

Todas as operações experimentais relacionadas a pseudovírus foram realizadas sob condição ABSL2 no Institut Pasteur da Academia Chinesa de Ciências de Xangai (IPS, CAS). Os experimentos com animais foram realizados com base nos protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do IPS, CAS.

1. Embalagem de pseudovírus com transfecção cálcio-fosfato

1. Realizar suspensões unicelulares de células HEK293FT (9 x 10⁵ por mL) em meio DMEM completo (Tabela 1). Adicionar 10 ml das suspensões unicelulares a um balão T75, incubar as células numa estufa a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO₂) durante 20 h antes da transfecção.
   NOTA: HEK293FT passagem baixa (<20 passagens) é recomendada. Certifique-se de que a monocamada celular seja 80-90% confluente.
2. Substitua o meio por 10 mL de meio fresco completo contendo cloroquina (100 μM) 2 h antes da transfecção.
3. Misturar os reagentes e o DNA plasmidial como mostrado na Tabela 2 e Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl₂e 2x tampão HEPES. Pipetar para cima e para baixo 5 vezes suavemente, incubar a mistura à temperatura ambiente (TR) por 20 min.
4. Transfira a mistura para o meio acima das células e agite suavemente o frasco. Incubar as células na incubadora de células por 15 h.
5. Substitua o meio por 15 mL de meio DMEM completo fresco. Incubar as células em estufa a 37 °C, 5% CO₂ durante 65 horas.
   NOTA: A cor do meio será laranja claro ou levemente amarelo, e pelo menos 80% da célula deve mostrar o efeito citopático (CPE) sob o microscópio de luz invertida.
6. Colher o sobrenadante e centrifugar-o a 2095 x g durante 20 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante, alíquota-o e armazená-lo a -80 °C.

2. Detecção da expressão das proteínas HA, NA e HIV-1 p24 do pseudovírus influenza

1. Detectar a expressão da proteína HA pelo ensaio de hemaglutinina (HA).
   1. Adicione 50 μL de PBS nas colunas 2-12, linhas A, B e C de uma placa de fundo redondo de 96 poços.
      Observação : linha A, B e C pertencem a 3 testes de replicação independentes e coluna 12 é usada como o controle negativo.
   2. Adicionar 100 μL de pseudovírus nos poços da coluna 1. Transferir 50 μL da coluna 1 para a coluna 2, misturar bem pipetando para cima e para baixo 5 vezes, efectuar as diluições duplas até à última coluna 11 e eliminar os 50 μL adicionais da coluna 11.
   3. Adicione 50 μL de eritrócitos a 0,5% em cada poço, pipete-o para cima e para baixo suavemente duas vezes. Incubar a placa por 30-60 min na RT ou até que as hemácias do controle negativo formem os pontos regulares no fundo do poço.
   4. Observar e registrar os títulos de AH do pseudovírus.
      NOTA: A unidade HA dos pseudovírus é o fator de diluição mais alto do vírus que pode causar 100% de hemaglutinação das hemácias.
2. Detectar a expressão das proteínas HA e NA pelo ensaio de western-blot.
   NOTA: Todas as etapas do western-blot são realizadas de acordo com o manual de clonagem molecular (^4ª edição).
3. Detectar a expressão da proteína p24 do HIV-1 pelo kit ELISA p24 do HIV-1 (Tabela de Materiais).
   1. Adicionar 50 μL do tampão de lise em 450 μL de amostra de pseudovírus. Misture bem.
   2. Adicionar 300 μL do tampão de lavagem a cada poço da microplaca. Bata a placa invertida para remover completamente o tampão de lavagem. Repita a lavagem 5 vezes.
   3. Adicionar 200 μL do padrão e amostras a cada poço separadamente. Incubá-los a 37 °C durante a noite ou durante 2 h.
   4. Aspirar o conteúdo da placa e lavá-la conforme descrito no passo 2.3.2.
      NOTA: Deixe um poço da placa de ensaio vazio para usar como substrato em branco.
   5. Adicionar 200 μL dos anticorpos do detector p24 a cada poço. Incubá-los a 37 °C durante 1 h. Aspirar e lavar a placa conforme descrito no passo 2.3.2.
   6. Adicionar 100 μL da solução de trabalho estreptavidina-peroxidase a cada poço e incubá-los a 37 °C durante 30 min. Aspirar e lavar a placa conforme descrito no passo 2.3.2.
   7. Adicionar 100 μL da solução de trabalho do subestado a cada poço, incluindo o poço em branco do substrato, e incubá-los a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: A cor azul se desenvolverá nos poços.
   8. Adicionar 100 μL do tampão de paragem a cada poço.
      NOTA: A cor azul mudará para amarelo imediatamente.
   9. Leia a densidade óptica a 450 nm em 15 minutos. Registrar os títulos de p24 do pseudovírus

3. Titulação de pseudovírus

1. Faça suspensões de célula única de células MDCK (5 x 10⁴ por mL) em meio DMEM completo, adicione 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 células a diferentes poços de uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células em estufa a 37 °C, 5% CO₂ durante 20 horas.
2. Retire o pseudovírus da geladeira de -80 °C, descongele-o no gelo e vortexe o pseudovírus.
3. Adicione 6 pseudovírus HAU (6x unidades HA) a cada poço de placa de fundo redondo de 96 poços e reabasteça cada poço com DMEM completo até 120 μL.
4. Pipetar para cima e para baixo a mistura 5 vezes para misturar completamente. Incubar a placa de mistura numa incubadora a 37 °C, 5 % de CO₂ durante 1 hora.
5. Transferir 100 μL da mistura para as células na placa de 96 poços. Coloque a placa de cultura celular de volta na incubadora por 48 h, 60 h e 72 h após a infecção pelo vírus.
6. Retire a placa da incubadora e realize o ensaio de luciferase (Tabela de Materiais).
7. Retire o meio dos orifícios da placa com cuidado. Enxaguar as células com 200 μL de PBS e remover o PBS tanto quanto possível.
   OBS: Vire a chapa e descarte o sobrenadante dando um tapa reverso em papel absorvente. Se a linha celular de teste não puder se fixar firmemente ao fundo, remova a aspiração do meio cuidadosamente.
8. Adicionar 50 μL do tampão de lise a cada poço e balançar a placa de cultura várias vezes. Conservar o prato a -80 °C durante a noite.
   NOTA: Misture 1 volume de tampão de lise 5x com 4 volumes de água para fazer o tampão de lise 1x. Equilibre o tampão de lise de 1x para RT antes de usar. Balançar a placa para garantir que as células sejam cobertas com o tampão de lise completamente. O único processo de congelamento-descongelamento pode ajudar a célula a ser lisada completamente.
9. Retire o prato, equilibre em TR por 2 h.
   Observação : a célula deve ser lisada completamente.
10. Agite a placa várias vezes suavemente e transfira todos os lisados celulares para placas opacas de 96 poços.
11. Adicionar 50 μL do substrato a cada poço, balançar a placa várias vezes suavemente e misturar bem o substrato e o tampão de lise.
12. Meça a luz produzida dentro de 5 min usando um luminômetro. Registre os títulos de luciferase do pseudovírus.
    NOTA: Quando um substrato adequado é adicionado, a luz é emitida como subproduto através de uma reação química na qual a luciferina é convertida em oxiluciferina pela enzima luciferase. A quantidade de luz produzida é proporcional à quantidade da enzima luciferase.

4. Preparação de soros imunes

NOTA: O soro imune será usado para experimentos relacionados a células, e a operação experimental deve ser realizada em condições assépticas.

1. Preparar 12 camundongos BALB/c fêmeas de oito semanas de idade. Divida igualmente os ratos em dois grupos.
   OBS: Um grupo era o grupo DDV e o outro era o grupo controle negativo.
2. Imunização do grupo DDV: Primer duas vezes por via intramuscular com 100 μg de um plasmídeo de DNA otimizado para códon que codifica a proteína A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA na semana 0 e na semana 3 e aumentar uma vez por via intraperitoneal com 512 partículas semelhantes ao vírus HAU TH (VLP) na semana 6.
3. Imunização do grupo controle: Primer duas vezes por via intramuscular com 100 μg de DNA plasmidial vetorial vazio na semana 0 e na semana 3 e aumentar uma vez por via intraperitoneal com VLP de vômito do HIV-1 na semana 6.
4. Coletar o sangue do camundongo 2 semanas após a última imunização.
   OBS: Aqui, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico (65 mg/kg) no momento da coleta de sangue. Após a coleta de sangue da veia submandibular, os camundongos foram eutanasiados imediatamente com CO₂.
5. Mantenha o sangue em RT por 2 h, depois 4 °C durante a noite. Centrifugar a 900 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Inative o soro colocando-o a 56 °C por 30 min.
6. Conservar os soros imunitários num frigorífico a -80 °C para utilização.
   NOTA: Consulte a Figura Suplementar 1 para obter o fluxograma que descreve os principais procedimentos de imunização de camundongos.

5. Ensaio de neutralização de pseudovírus (NP)

1. Fazer suspensões de célula única de células MDCK (5 x 10⁴ por mL) em meio DMEM completo e adicionar 100 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células em estufa a 37 °C, 5% CO₂ durante 20 horas.
2. Retire o pseudovírus e os soros da geladeira de -80 °C, descongele-o no gelo e vomite completamente.
3. Diluir os soros no meio completo 20 vezes e adicionar 100 μL de meio DMEM completo aos poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços das colunas 2-10.
4. Adicionar 200 μL dos soros diluídos para os poços da coluna 2, transferir 100 μL da coluna 2 para a coluna 3, diluir os soros como 1:20, 1:40, 1:80, etc., para 1:10240 sucessivamente da coluna 2 para a coluna 10 e eliminar os 100 μL da coluna 10.
5. Adicionar 100 μL de meio completo DMEM aos poços da coluna 11 como controlo negativo.
6. Adicionar 100 μL de pseudovírus a cada poço, pipetar a mistura 5 vezes mais e incubar a placa de mistura a 37 °C, 5% CO₂ durante 1 h.
7. Transferir 100 μL da mistura da placa de fundo redondo de 96 poços para o poço correspondente da placa de cultura celular de 96 poços. Colocar a placa de volta na incubadora (37 °C, 5% CO₂) por 60 h.
8. Retire a placa da incubadora. Execute o ensaio de luciferase conforme descrito nas etapas 3.7-3.12.

6. Ensaio de ligação de pseudovírus

1. Faça suspensões de célula única de células MDCK (4 x 10⁴ por mL) em meio DMEM completo e adicione suspensões de células de 100 μL a cada poço em uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células a 37 °C, 5% CO₂ durante 20 h.
2. Incubar o pseudovírus com soros em DMEM contendo 1% de BSA a 4 °C durante a noite.
   NOTA: O volume da mistura é de 100 μL.
3. Bloquear as células MDCK com 100 μL por poço de DMEM contendo 1% de BSA a 4 °C por 1 h.
4. Inocular a mistura de pseudovírus e soro (100 μL) na monocamada de MDCK e incubá-la a 4 °C por 2 h.
5. Lave a placa celular 4 vezes com PBS contendo 1% de BSA para remover qualquer vírus não ligado.
6. Lisar as células com 100 μL de tampão de lise luciferase em TR por 30 min.
7. Quantificar a quantidade de vírus ligado nas células com um kit ELISA p24 para VIH-1, conforme descrito acima (secção 2.3).

7. Avaliação da entrada viral

1. Fazer suspensões de célula única de células MDCK (5 x 10⁴ por mL) em meio DMEM completo e adicionar 100 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células a 37 °C, 5% CO₂ durante 20 h antes do ensaio.
2. Inocular o pseudovírus (100 μL) em uma monocamada de MDCK em uma placa de 96 poços a 4 °C por 6 h.
3. Lavar a placa celular 4 vezes com PBS contendo 1% de BSA para remover pseudovírus não ligados.
4. Adicionar 100 μL dos soros imunes diluídos em série ou soros de camundongos com vacinação simulada em DMEM contendo 1% de BSA à monocamada e incubar a célula a 4 °C por 2 h.
5. Remova o sobrenadante celular e lave a placa de cultura celular 4 vezes com PBS contendo BSA a 1%.
6. Adicionar DMEM fresco às células e incubar durante 60 h numa incubadora a 37 °C, 5% CO₂ .
7. Medir a atividade relativa da luciferase (RLA) das células, conforme descrito nas etapas 3.7-3.12.
   NOTA: A entrada viral, indicada pela RLA, foi expressa como uma porcentagem da leitura obtida na ausência de soros, que foi definida como 100%.

Expressão das proteínas p24 HA, NA e HIV-1 do pseudovírus influenza
Para identificar a eficiência da embalagem viral, os estoques de pseudovírus influenza foram detectados pela primeira vez pelo ensaio de AH (Figura 2A). As unidades de AH por mililitro de pseudovírus influenza são 643 (Tabela 3). Ensaios de western-blot e ELISA sanduíche foram usados para testar a expressão das proteínas HA, NA e HIV-1 p24. Em seguida, foram calculadas as proporções de unidade de AH e a quantidade de gag p24 para pseudovírus. Os resultados do ensaio de western-blot mostraram que havia 4 tipos de proteínas: HA0, HA1, HA2 e NA (Figura 2 suplementar). Isso indica que as proteínas envelopadoras dos pseudovírus influenza são semelhantes às dos vírus selvagens. As proporções de AH e Gag p24 estavam dentro da normalidade, conforme relatado (Tabela 3)9.

Tabela 3: Quantificação do pseudovírus H5.

Titulação de pseudovírus
Para medir a concentração de partículas virais funcionais, foi detectada atividade relativa da luciferase (RLA) do pseudovírus. As leituras de RLA são dependentes de muitas variáveis. Para identificar o efeito da quantidade de células transduzidas nas leituras do RLA, semeamos as células de 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 por poço de placa de 96 poços (Figura 2). Os resultados mostraram que as leituras de RLA do pseudovírus são as mais altas, e o erro padrão da média é o menor quando 5000 células são semeadas em um poço de placa de 96 poços (Figura 4A). Para identificar o efeito do tempo de incubação, as leituras de RLA são detectadas em 48 h, 60 h e 72 h após a infecção pelo vírus. Os resultados mostraram que, quando incubados por 60 h, as leituras de RLA do pseudovírus são maiores em valores e melhores em repetibilidade com baixo erro padrão da média (Figura 4B). Os resultados indicam que é adequado semear 5000 células em um poço de uma placa de 96 poços e detectar leituras de RLA 60 h após a infecção pelo vírus.

Ensaios PN
Os títulos de neutralização dos soros imunes do grupo controle e do grupo DDV foram medidos por ensaios de NP (Figura 5). Como mostrado na Figura 5A, os soros imunes do grupo DDV exibiram altos títulos de neutralização contra a cepa do pseudovírus A/Thailand/1(KAN)-1/04. Em contraste, os soros do grupo controle não apresentaram atividade neutralizante (Figura 5B). Em comparação com os ensaios sorológicos tradicionais (ensaios HI e MN), os ensaios NP são mais sensíveis (dados não são mostrados).

Ensaio de neutralização de anexos
Alguns anticorpos de neutralização podem dificultar a ligação dos vírus aos receptores do ácido siálico. Esses anticorpos são direcionados para a cabeça do AH e predominam após a imunização por vacina comercial ou infecção pelo vírus influenza. Para identificar a atividade neutralizante desses anticorpos, são realizados ensaios de neutralização de ligação (Figura 3). Em comparação com os soros controle, a atividade neutralizante dos soros imunes é potente, o que indica que há muitos anticorpos direcionados para a cabeça do AH nos soros imunes (Figura 6A).

Avaliação da entrada viral
Este ensaio é usado para identificar anticorpos que impedem a fusão do envoltório viral e membranas endossômicas durante a infecção pelo vírus influenza. Esses anticorpos são direcionados para o domínio do pedúnculo do AH e são comumente menos potentes. Para medir os títulos de neutralização desses anticorpos, são realizados ensaios pós-fixação (Figura 3). Há diferenças significativas entre os soros imunes e os soros-controle, o que indica que há anticorpos direcionados para a região do tronco do AH no soro imune (Figura 6B).

Figura 1: Fluxograma da transfecção mediada por cálcio. Este fluxograma é utilizado para descrever os principais procedimentos de transfecção mediada por cálcio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação e titulação do pseudovírus. (A) Fluxograma do ensaio de HA de pseudovírus descrevendo as principais etapas do ensaio de HA de pseudovírus. (B) Fluxograma do ensaio do pseudovírus P24 descrevendo as principais etapas do ensaio do pseudovírus P24. (C) Fluxograma do ensaio de titulação de pseudovírus descrevendo as principais etapas do ensaio de titulação de pseudovírus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ensaios de neutralização baseados em pseudovírus. (A) Fluxograma do ensaio NP descrevendo as principais etapas do ensaio NP. (B) Fluxograma do ensaio de ligação de pseudovírus descrevendo as principais etapas do ensaio de apego. (C) Fluxograma de Avaliação do Ensaio de Entrada Viral descrevendo as principais etapas do Ensaio de Entrada Viral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Titulação do pseudovírus. (A) Diferentes quantidades de células por poço em uma placa de 96 poços influenciam as leituras de RLA. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 células foram semeadas em placa de 96 poços. (B) Diferentes épocas de colheita influenciam as leituras do RLA. As leituras de RLA são detectadas em 48 h, 60 h e 72 h após a infecção pelo vírus. Os dados coletados de três experimentos independentes são apresentados como média ± MEV; as barras de erro representam o erro padrão da média (EPM). Foi realizada ANOVA one-way com teste de Tukey. P < 0,0001; ns, não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Respostas de anticorpos neutralizantes H5 detectadas com pseudovírus. (A) Titulação das respostas de anticorpos neutralizantes dos soros imunes do grupo DDV. (B) Titulação das respostas de anticorpos neutralizantes dos soros imunes do grupo controle. O CI 50 é definido como as diluições recíprocas do anticorpo neutralizante que podem inibir50 % do pseudovírus. Os dados coletados de três experimentos independentes são apresentados como média ± MEV; as barras de erro representam o erro padrão da média (EPM). O pseudovírus VSVG foi usado como controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Detecção da potência do anticorpo de neutralização por ensaios de ligação e entrada viral. (A) Soros imunes do grupo DDV, não do grupo controle, inibem a ligação viral às células. (B) Soros imunes do grupo DDV, não do grupo controle, inibem parcialmente a infecção viral pós-apego. Os dados coletados de três experimentos independentes são apresentados como média ± MEV; as barras de erro representam o erro padrão da média (EPM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição completa do meio DMEM.

Tabela 2: Sistema de empacotamento de pseudovírus.

Figura suplementar 1: Fluxograma da imunização em camundongos. Este fluxograma descreve os principais procedimentos de imunização em camundongos. Os soros imunes foram utilizados como amostras. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Expressão das proteínas HA, NA e HIV-1 p24 do pseudovírus influenza. Western-blot de proteínas de pseudovírus. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.