在这里,我们描述了假病毒包装和抗体中和活性测量的协议。
自1996年以来,A/Goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感(HPAI)H5病毒一直在家禽和野生鸟类中引起流感疫情。有时,人类也会成为它的受害者,从而导致高死亡率。尽管如此,高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍,因为它必须在生物安全3级实验室内处理。为了解决这个问题,在H5 HPAI研究的一些实验中,假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒被证明是研究针对 H5 HPAI 病毒的中和抗体的理想工具。该协议描述了H5 HPAI假病毒制备和假病毒中和测定的程序和关键步骤。此外,它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。
自1996年以来,A/goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感(HPAI)H5病毒在家禽和野生鸟类中持续暴发流感,给全球家禽业造成了巨大的社会经济损失。有时,人类也会感染它,面临高死亡率1,2。然而,高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍,因为它不能在生物安全3级实验室之外处理。为了解决这个问题,在H5 HPAI研究的一些实验中,假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒足够安全,可以在生物安全2级实验室进行实践。
H5 HPAI 假病毒属于嵌合病毒,由替代病毒核心、带有流感病毒表面糖蛋白的脂质包膜和报告基因组成。假病毒核心通常来源于慢病毒人类免疫缺陷病毒 (HIV)、逆转录病毒(如鼠白血病病毒 (MLV) 和水疱性口炎病毒 (VSV)3。具体来说,HIV-1包装系统被广泛用于产生流感假病毒,其中提供的主要基因是 gag 和 pol。HIVgag基因表达核心蛋白。pol基因表达整合酶和逆转录酶,这两者都是报告基因在转导细胞中表达所必需的。模仿替代病毒的基因组,报告基因以RNA形式被拥抱到假病毒核心中。报告基因将在宿主细胞中表达蛋白质。报告基因的基因表达水平可用于测量假病毒感染效率3,4。主要报告基因是萤火虫荧光素酶,用于测量转导细胞中的相对发光单位(RLU)或相对荧光素酶活性(RLA)。其他报告基因如lacZ,Gaussia和Renilla荧光素酶也被使用,只是程度较小5。
假病毒是研究针对H5 HAPI病毒的中和抗体的理想工具。为了测量中和抗体的效力,使用假病毒中和(PN)测定6。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒7,8表面的糖蛋白。HA由用于受体结合的球状头部结构域和用于膜融合的干结构域组成。NA蛋白具有促进病毒释放的唾液酸酶活性7,8。PN 测定可以测量针对 HA 蛋白的中和抗体。针对HA头部和茎区域的中和抗体也可以通过病毒附着和进入测定来检测。与野生型病毒相比,假病毒中和实验具有更灵敏的检测值,可以在2级生物安全实验室中安全处理,并且在实践中通常更容易操作。
该协议详细介绍了H5 HPAI假病毒制备和PN测定的程序和关键步骤。此外,它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒的A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)毒株为例。为了获得测定中使用的免疫血清,该方案选择源自TH菌株的HA蛋白作为免疫原来免疫小鼠。
HEK293FT细胞通常用作包装细胞以产生假病毒。在细胞培养过程中,定期检测支原体至关重要。支原体污染可大大降低假病毒产量,有时接近于零。与其他污染相比,支原体污染不会导致细胞培养基的pH值变化或浑浊。即使是高浓度的支原体,肉眼或显微镜下也看不到。三种常用的支原体检测方法是支原体培养、荧光 DAPI 或 Hoechst 33258 DNA 染色和聚合酶链反应 (PCR)。PCR扩增培养样品中的支原体DNA广?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了江苏省创新能力建设项目(BM2020019)和深圳市科技项目(No.JSGG20200225150702770)、中国科学院战略重点研究计划(XDB29030103)、广东省科技计划(编号:2020B1111340076)和深圳湾实验室开放研究计划(编号:2020B1111340076)。SZBL202002271003)。
1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |